Un nuevo método de evolución dirigida específicamente al ámbito de la ingeniería termoestabilidad fue desarrollado y validado tanto para las enzimas bacteriolíticas. Después de sólo una ronda de mutagénesis al azar, una enzima bacteriolítica evolucionado, PlyC 29C3, muestra mayor que el doble de la actividad residual en comparación con la proteína de tipo salvaje después de incubación a temperatura elevada.
Evolución dirigida se define como un método para aprovechar la selección natural con el fin de diseñar proteínas de adquirir propiedades particulares que no están asociados con la proteína en la naturaleza. La literatura ha proporcionado numerosos ejemplos sobre la aplicación de la evolución dirigida a alterar con éxito especificidad molecular y catálisis 1. La principal ventaja de la utilización de la evolución dirigida en lugar de más racional enfoques para la ingeniería molecular se refiere al volumen y la diversidad de las variantes que pueden ser seleccionados 2. Una posible aplicación de la evolución dirigida consiste en la mejora de la estabilidad estructural de las enzimas bacteriolíticas, tales como endolisinas. Bacteriófago codificar y expresar endolisinas para hidrolizar un enlace covalente crítico en el peptidoglicano (es decir, la pared celular) de las bacterias, lo que resulta en la lisis de la célula huésped y la liberación de los viriones progenie. En particular, estas enzimas tienen la capacidad de inducir la lisis extrínsecamente a Susceptbacterias ible en la ausencia de fagos y, además, se han validado tanto in vitro como in vivo por su potencial terapéutico 3-5. El tema de nuestro estudio evolución dirigida implica la PlyC endolisina, que se compone de subunidades PlyCA y PlyCB 6. Cuando se purificó y se añadió extrínsecamente, la holoenzima PlyC lisa los estreptococos del grupo A (GAS), así como otros grupos de estreptococos en cuestión de segundos y, además, ha sido validado in vivo contra GAS 7. Significativamente, el seguimiento cinética de enzimas residuales después de incubación a temperatura elevada proporciona evidencia clara de que PlyC pierde actividad lítica abruptamente a 45 ° C, lo que sugiere una vida media corta terapéutico, lo que puede limitar el desarrollo adicional de esta enzima. Otros estudios revelan la falta de estabilidad térmica se observa solamente para la subunidad PlyCA, mientras que la subunidad PlyCB es estable hasta ~ 90 ° C (observación no publicada). Además de PlyC, hay sarias ejemplos en la literatura que describen la naturaleza termolábil de endolisinas. Por ejemplo, el Staphylococcus aureus endolisina LysK y Streptococcus pneumoniae endolisinas Cpl-1 y Pal perder actividad espontáneamente a 42 ° C, 43,5 ° C y 50,2 ° C, respectivamente 8-10. De acuerdo con la ecuación de Arrhenius, que relaciona la velocidad de una reacción química a la temperatura presente en el sistema en particular, un aumento en la termoestabilidad se correlacionan con un aumento de la esperanza de vida de estante 11. Con este fin, la evolución dirigida ha demostrado ser una herramienta útil para alterar la actividad térmica de varias moléculas en la naturaleza, pero nunca ha esta tecnología particular ha explotado con éxito para el estudio de las enzimas bacteriolíticas. Asimismo, las cuentas de éxito para progresar en la estabilidad estructural de esta clase particular de los antimicrobianos en conjunto son inexistentes. En este vídeo, se emplea una metodología novedosa que utiliza un error-pruna polimerasa de ADN seguido por un proceso de selección optimizada utilizando un formato de 96 pocillos placa de microtitulación para identificar las mutaciones de la subunidad PlyCA de la PlyC endolisina estreptocócica que se correlacionan con un aumento de la estabilidad cinética enzimática (Figura 1). Los resultados después de sólo una ronda de mutagénesis al azar sugieren la metodología es la generación de variantes PlyC que retienen más del doble de la actividad residual en comparación con los de tipo salvaje (WT) PlyC después de tratamiento a temperatura elevada.
Este protocolo, descrito en la Figura 1, se presenta una metodología bien 96 placa de microtitulación que permite utilizar evolución dirigida para aumentar la termoestabilidad de cualquier enzima bacteriolítica. Mediante el uso de una ADN polimerasa propensa a errores, se pueden introducir mutaciones al azar que aumentan la estabilidad general cinética de la molécula traducido bacteriolítica de interés, que es típicamente debido a las reorganizaciones molecular que consiste en aumentar electrostática, puente disulfuro y por interacciones hidrofóbicas que generan mejorado embalaje molecular, modificaciones mejoradas de las redes de carga superficial o refuerzo de un estado de oligomerización superior 17-18. Después de la introducción de mutaciones de nucleótidos, un procedimiento de cribado extenso se utilizó a continuación para identificar las mutaciones que son térmicamente beneficioso. Los resultados representativos se presentan aquí se basan en una ronda de mutagénesis al azar. En realidad, se ha sugerido queal menos tres rondas sucesivas de mutagénesis aleatoria, cada uno usando el mutante más robusto como el enzima de plomo, seguido por combinación aleatoria de ADN es apropiado para este tipo de estudios dirigidos comportamiento evolución térmica 2.
Es importante comprender que mientras que este protocolo identifica las mutaciones que aumentan la estabilidad cinética, estas variantes no necesariamente han aumentado termoestabilidad. Una molécula se considera termoestable cuando tiene la capacidad de conservar su estructura a una temperatura alta. Sin embargo, en el ensayo presentado, la actividad residual de los lisados mutantes no se analizan a la misma temperatura que se incubaron inicialmente menos durante la etapa de tratamiento térmico y por lo tanto uno se puede seleccionar para las mutaciones que promueven el replegamiento en lugar de termoestabilidad mejorada 19. Mientras que estamos extrapolando comportamiento térmico como una indicación de la estabilidad térmica, la estabilidad térmica verdadero debe ser medido empíricamente por biophyscos métodos tales como dicroísmo circular (CD), calorimetría diferencial de barrido (DSC) y fluorimetría de exploración diferencial (DSF). Los datos preliminares de experimentos de CD y DSF sugieren que varios candidatos identificados a partir de la metodología presentada en efecto, visualizar termoestabilidad progresado (datos no mostrados).
Aunque la metodología que se presenta aquí es específico para implementar el comportamiento térmico aumentado a PlyC, esta misma metodología, además, puede ser empleado para mejorar la actividad térmica a otras enzimas bacteriolíticas con algunas modificaciones menores de variables tales como tampones, las tasas de mutación, las condiciones de calentamiento y sistemas de expresión. Una variable fundamental asociado con este ensayo se refiere a la tasa de mutación de nucleótidos de la ADN polimerasa propensa a errores. Hemos elegido utilizar el error-prone Mutazyme ADN polimerasa II en nuestro ensayo de evolución dirigida, debido a la evidencia experimental que sugiere que esta enzima en particular muestra la menor cantidad de sesgo conse refiere a que los nucleótidos están aleatoriamente incorporará en el gen de interés en comparación con otras técnicas de mutagénesis al azar tales como el uso de hidroxilamina, mutator E. cepas de E. coli y otro ADN propenso a errores polyermases 20. En general, la disminución de las tasas de mutación tienden a ser más deseable por dos razones. En primer lugar, la termoestabilidad de ingeniería a las proteínas típicamente consiste en sustituciones de aminoácidos relativamente pocos aminoácidos. Las altas tasas de mutación puede provocar dramáticas alteraciones estructurales de moléculas particulares que definitivamente puede resultar en mal plegamiento estructural y las discrepancias funcionales. Por ejemplo, la incorporación de residuos de prolina y glicina pueden interrumpir alfa estructuras secundarias helicoidales 21. Segundo, las tasas altas de mutación de nucleótidos aumentar las posibilidades de incorporación de codones de parada prematuros, lo que resulta en moléculas truncadas que son biológicamente inactivos. En general, la disminución de las tasas de mutación son preferidos debido a las tasas de error más baja en el resultado accumulción de mutaciones de adaptación mientras que los altos índices de mutación generar mutaciones neutrales o nocivas 22.
Para cada ronda de mutagénesis al azar, otra variable crítica que se debe optimizar la temperatura de incubación implica utilizado durante el proceso de selección. Selección de la experimental no permisiva temperatura es relativamente difícil. Inicialmente se utiliza una temperatura de incubación que era 10 ° C más alta que la temperatura no permisiva de PlyC, sin embargo después de filtrar las 3.000 mutantes, no hemos podido identificar cualquier mutaciones ventajosas. Teniendo en cuenta la evolución dirigidas metodologías consisten en identificar secuencialmente beneficiosos sustituciones de aminoácidos que tienen efectos aditivos, se determinó que una temperatura menos rigurosas debe utilizarse durante el proceso de selección, aún si no aumentó la posibilidad de generar falsos positivos. Como tal, se utilizó una temperatura de incubación que era sólo unos pocos grados por encima de la no-permissive temperatura y volvieron a seleccionar los candidatos seleccionados para descartar los falsos positivos.
Decidimos utilizar una temperatura de incubación que no era demasiado templado (≤ 1 ° C más alta que la más baja temperatura no tolerable) y por el contrario no dura demasiado (≥ 5 ° C más alta que la más baja temperatura no permisiva). La temperatura ideal se decidió utilizar en este ensayo particular era un moderado 2 ° C más alta que la determinada experimentalmente temperatura no tolerable. Elegir una temperatura que es demasiado suave dará lugar a una mucho mayor tasa de falsos identificación positiva que el ~ 20% se observó (Tabla I) cuando se utiliza una temperatura de incubación moderada. Además, utilizando una temperatura de incubación que es demasiado duro podría resultar en la imposibilidad de identificar mutantes con comportamiento térmico mejorado de manera significativa. Por ejemplo, utilizando una temperatura de incubación de ≥ 5 ° C habría dado lugar a la incapacidad de identificar laprometiendo mutante 29C3, así como la mayoría de los otros candidatos seleccionados en la primera ronda de selección.
En resumen, se proporciona un protocolo para la ingeniería de enzimas bacteriolíticas para adquirir estabilidad cinética mejorada. Por otra parte, este mismo ensayo, sin los pasos de calentamiento, se puede utilizar para la detección de mutaciones que aumentan la actividad catalítica. Aumentar tanto la actividad catalítica y la estabilidad térmica es un obstáculo importante en el desarrollo frente a cualquier enzima terapéutica. Aunque los detalles de este protocolo son específicos de la PlyC endolisina, la metodología se puede adaptar a cualquier enzima bacteriolítica con sólo unas pocas modificaciones. Se presentaron los resultados preliminares a partir de sólo la primera ronda de mutagénesis que valida que la funcionalidad del ensayo, lo que resulta en la aplicación y la identificación de mutaciones que generan un aumento de la termoestabilidad molecular de magnitud significativa.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Emilija Renke y Yu Janet de asistencia técnica. DCN con el apoyo de subvenciones del Departamento de Defensa estadounidense (DR080205, DM102823, OR09055, y OR090059). RDH es apoyado por una beca de la Estación Experimental de Agricultura de Maryland y una Beca de Formación NIH en Biología Celular y Molecular.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78260 |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 200500 |
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid | BD Vacutainer Labware Medical | 353072 |
96 Well Nonskirted PCR Plates | Fisher Scientific | 14-230-232 |
Swing-bucket Rotor | Eppendorf | A-2-DWP |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760 |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904 |
Arabinose | Fisher Scientific | BP2504 |
pBAD24 Expression Vector | ATCC | 87399 |
pBAD33 Expression Vector | ATCC | 87402 |