Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Fettgewebe gewonnen Stromazellen aus lipoaspirate und die Schaffung einer 4 mm kritische Größe Calvaria Defekt Skelett Regeneration zu bewerten.
Abstract
Kraniofazialen skelettalen Reparatur und Regeneration bietet das Versprechen von de novo Gewebebildung durch einen Zell-basierten Ansatz Verwendung Stammzellen. Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASC) haben sich eine reiche Quelle von multipotenten Stammzellen fähig ist, osteogene, chondrogener, adipogene und myogenen Differenzierung. Viele Studien haben die osteogene Potential dieser Zellen in vivo untersucht unter Verwendung von verschiedenen Biomaterialien Gerüst für zellulare Lieferung. Es hat sich gezeigt, dass durch Verwendung eines osteokonduktiven, Hydroxylapatit-beschichteten Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA HA-) Gerüst seeded mit ASCs eine kritische Größe Calvaria Defekt, ein Defekt, der durch seine Unfähigkeit, eine spontane definiert ist Heilung über die gesamte Lebensdauer des Tieres, kann wirksam werden zeigen, robust Knochenregeneration. Diese in vivo Modell zeigt die Grundlage für translationale Ansätze gerichtet, um den Knochen zu regenerieren - die zelluläreKomponente und biologischen Matrix. Diese Methode dient als Modell für die letztendliche klinische Anwendung einer Vorläuferzelle in Richtung der Reparatur eines Gewebedefekts bestimmten.
Protocol
Ein. Zellisolation & Expansion
- Alle Einwilligung des Patienten und experimentelle Protokolle wurden überprüft und von der Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 und # 9999) genehmigt.
- Erhalten menschlichen subkutanen Fettgewebe von elektiven lipoaspiration Verfahren unter örtlicher / Vollnarkose.
- Es wird zwei Schichten in der lipoaspirate (1A) sein. Der Überstand enthält den größten Teil des verarbeiteten Zellmaterial. Die untere Schicht wird meistens injiziert Kochsalzlösung. Adipose-abgeleiteten Stromazellen aus beiden Schichten können geerntet werden, aber die Ausbeute ist wesentlich größer aus dem Überstand.
- Die Stromazellen vaskulären Fraktion (SVF) zu isolieren, wäscht den lipoaspirate ausgiebig mit gleichen Volumina von 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 2,5% betadine (x2), die von gleichen Volumen von PBS 1X (x1) ohne betadine gefolgt. Lassen Sie die Wäsche auszufallen.
- Achten Sie darauf, sterile te zu haltenchnique während des gesamten Prozesses, da eine Verunreinigung mit verarbeitetem menschlichem Gewebe passieren kann.
- Saugen Sie die untere Schicht und entsorgen nach jeder Wäsche.
- Aliquot 15 ml Fettgewebe in 50 ml BD Falcon konische Röhrchen.
- Verdauen die Fettgewebe mit einem gleichen Volumen (15 ml) filtriert 0,075% Typ II Kollagenase in Balanced Salt Solution Hank (HBSS) bei 37 ° C in einem Wasserbad für 60 Minuten unter ständigem Rühren (ca. 180 schüttelt / min) - Belüftung jedes Rohr alle 15 min.
- Neutralisieren Enzymaktivität mit 15 ml PBS, das 10% (Fetal Bovine Serum) FBS und Zentrifuge bei 1000 UpM für 5 min bei 4 ° C, um eine mit hoher Dichte SVF Pellet zu erhalten. Das Pellet wird eine Mischung aus Fettgewebe gewonnen Stromazellen und Erythrozyten sein.
- Überstand verwerfen, ohne dass der Pellet.
- Resuspendieren des Pellets in 10 ml herkömmlichen Nährmedien (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung).
- Filter Aufhängung sion durch ein 100 um Nylon Zellsieb um Zelltrümmer zu entfernen.
- Kombinieren Sie 3 Rohre in ein sauberes 50 ml konisch. Zentrifugieren bei 1000 UpM für 5 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen, ohne dass der Pellet.
- Das Pellet in 5 ml herkömmlichen Nährmedien
- Kombinieren Sie zwei 50 ml Schrägen pro 10 cm Platte oder fünf 50 ml Schrägen für eine 15 cm Platte.
- Stellen primären Kulturen über Nacht bei 37 ° C/21% O 2, 5% CO 2.
- Nach Inkubation über Nacht, wäscht die Platten ausgiebig mit PBS, um restliche nichthaftenden roten Blutkörperchen zu entfernen. Die erhaltenen Zellpopulationen Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen.
- Pflegen Sie die Zellen bei sub-konfluenten Ebenen spontane Differenzierung bei 37 ° C/21% O 2, 5% CO 2 in Nährmedien zu verhindern. Die Zellen müssen in der Regel aufgeteilt alle drei bis vier Tage in regelmäßigen Nährmedien werden, wenn bei 50% Konfluenz.
- School of Dentistry - Gerüste wurden von Dr. Min Lee an der University of California, Los Angeles.
- PLGA Gerüste wurden von 85/15 Poly (Milch-co-Glykolsäure) (inhärente Viskosität = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) im Gießverfahren und einem teilchenförmigen Laugung hergestellt.
- PLGA / Chloroformlösungen wurden mit 200-300 Mikrometer Durchmesser Saccharose gemischt bis 92% Porosität (Volumenanteil) und komprimiert zu dünnen Blechen in einer Teflonform erhalten.
- Nach Gefriertrocknung über Nacht wurden Gerüste in drei Änderungen zweifach destilliertem (dd) H 2 O eingetaucht, um die Saccharose lösen und vorsichtig aus dem Teflon Platte mit einem feinen Spitze Spatel entfernt.
- Nach teilchenförmigen Auslaugen wurden alle Gerüste durch Eintauchen in 50%, 60% und 70% Ethanol für 30 min jeden desinfiziert, gefolgt von drei Spülungen mit ddH 2 O.
- Alle Gerüste wurden unter einer Sterilbank getrocknet.
- Nach Gerüst Fertigung, scaffolds wurden mit Apatit beschichtet ist.
- SBF (simulierter Körperflüssigkeit) Lösung wurde mit Ionenkonzentrationen, die das 5-fache von menschlichem Blutplasma wurden hergestellt. Alle Lösungen wurden sterilfiltriert durch einen 0,22 um PES-Membran (Nalgene). Unmittelbar vor dem Beschichtungsvorgang, getrocknet PLGA Gerüsten Glimmentladung, Argon-Plasma-Ätzen (Harrick Scientific) unterzogen wurden, um die Benetzung und Beschichtungsgleichmäßigkeit verbessern.
- Geätzten PLGA Gerüste wurden dann in SBF bei 37 ° C innerhalb einer Wassermantel-Inkubator für 12 Stunden, gefolgt durch Mg 2 + und HCO 3 - freien SBF 2 für weitere 12 Stunden bei 37 ° C unter leichtem Rühren.
- Beschichtete PLGA Gerüste wurden vorsichtig mit steriler ddH 2 O gespült abzuwaschen Überschuß Natriumchloridlösung, in einer Sterilbank getrocknet und desinfiziert mit 70% Ethanol.
- Integrität des Apatit-Beschichtung wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) analysiert. Apatitbeschichteten scaffolds wurden auf SEM Stubs (Ted Pella) montiert und beschichtet mit Kohlenstoff, um die Leitfähigkeit zu verbessern. Die Sekundär-Elektronen-Modus wurde während SEM (FEI / Phillips XL-30) Beobachtung angewendet. Energiedispersion Röntgenspektrum erhalten wurde, um elementaren Zusammensetzung der Apatitstrukturen bestätigen.
3. Zellaussaat
- Bei Erreichen sub-Mündung Ebenen, waschen Sie die Zellen mit PBS (x2) und trypsinieren.
- Zählen Sie die Zellen für die Aussaat zu quantifizieren
- Saatgut auf vorgeschnittenen 4,0 mm Durchmesser Gerüste mit 1,5 x 10 5 Zellen.
- Ort einzelnen Gerüst in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte
- Resuspendieren Zellen in regelmäßigen Wachstumsmedium mit einer Konzentration von etwa 1,5 x 10 5 Zellen pro 20 ul Medium
- Pipette 20 ul direkt auf das Stützgerüst aufnehmen und in Zellkulturbrutschrank für 30 min.
- Nach 30 min, 200 ul Medium und ermöglicht Zellen zu inkubierenauf dem Gerüst über Nacht vor der Operation
- Es ist nicht notwendig, um sicherzustellen, Adhäsion der Zellen auf das Stützgerüst als Impfen eine ausreichende Anzahl von Zellen wird sicherstellen, dass eine Mehrheit wird auf das Stützgerüst zu befestigen. Dies wurde in unserem Labor in vivo mit Biolumineszenz und histologische Analyse validiert.
4. Erstellung von Calvaria Mängel und in vivo-Implantation
- Anesthetize Erwachsenen (60 Tage alt) CD-1 Nacktmäusen mit Betäubung Cocktail. (Ketamin / Xylazin / Acepromazin) bei 50% Konzentration (1:1 Verdünnung mit 0,9% NaCl) oder per empfohlenen Anästhesie Therapie pro Institution Protokolle. Diese Mäuse sind athymischen so die hASCs nicht dazu führen, eine Immunreaktion.
- Dosierung: Ketaminhydrochlorid (80 mg / kg), Xylazin (2,5 mg / kg) Acepromazin (2,5 mg / kg)
- Wirkungsdauer: ca. 30 min
- Chirurgisch drapieren das Tier und sterilisieren die chirurgischeAufstellungsort mit betadine und Alkohol (x3) und decken die Mausaugen mit Salbe bevor eine Mittellinie sagittalen Schnitt in der Kopfhaut des Tieres, um den rechten parietalen Knochen freizulegen. Entfernen Sie die Perikranium von der rechten Scheitelbein mit stumpfen Schaben (Abbildung 1B).
- Erstellen Sie eine einseitige 4-mm-Dicke Defekt in der rechten Nicht-Naht verbundenen Scheitelbein mit einer sterilen diamantbeschichteten trephine Bohrer. Extreme Vorsicht zu dürfen, um die zugrunde liegenden Dura mater (Abbildung 1B) wie die Maus Calvaria Dicke stören werden ist <0,3 mm.
- Vor der Implantation spülen Gerüsten mit steriler PBS auf Übertragung von Medium-Wachstumsfaktoren verhindern.
- Legen Sie das Gerüst in den Defekt.
- Schließlich nähen die Haut geschlossen und Überwachung der Tier pro etablierten postoperative Protokolle.
- Verwenden gegründet Analgesie, wie von Ihrem animal care Protokolle nach Bedarf postoperativ-zB gerichtet. Buprenorphin 0,1 mg / kg.
5. Quantifizierung der Osteoidbildung
- Nach MicroCT an der Maus durchgeführt wurde, wurde das dreidimensionale Bild rekonstruiert MicroView Software, wie zuvor beschrieben ein.
- Mit Adobe Photoshop, waren die Bilder so bemessen, dass ein Standard-Höhe.
- Mit dem Zauberstab-Funktion wurden Pixel des Calvaria Defekt gemessen.
- Prozentsatz Heilung des Mangels durch nachfolgende CT-Scans Messung der Calvaria Defektbereich und Bestimmung Pixelzahl und dividiert sie durch die ursprünglichen Mangel der Pixelanzahl bestimmt
- Wenn folglich die MicroCT nicht verfügbar ist, wird eine alternative Verwendung von Adobe Photoshop und Ernten des Calvaria bei ermittelt Zeitpunkten für die Histologie.
- Mithilfe histologischer Flecken wie Anilin Blau und Pentachrome die Osteoidbildung bezeichnen, sollten mehrere Abschnitte entlang der Spannweite des Mangels gebeizt
- Mit Adobe Photoshop, Beschneiden, alle Bereiche, die nichtim Calvaria Defekt
- Verwenden Sie den Zauberstab Funktion und bestimmen Pixelzahlen von de novo Knochenbildung im Bereich des Defekts und vergleichen, um Steuerelemente oder andere Variablen.
6. Repräsentative Ergebnisse
Fettgewebe hat das Potenzial, eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Vorläuferzellen für die klinische Anwendung dienen. Fettgewebe hat einen einzigartigen Vorteil, dass es eine leicht verfügbar Versorgung, die in einem relativ einfachen Verfahren, das nur minimale Morbidität und Mortalität beinhaltet geerntet werden kann. Sobald das Gewebe wird geerntet und gesammelt, unser Protokoll in Abbildung 2 dargestellt. Fettgewebe-abgeleitete Stromazellen durch eine Reihe von Waschschritten Kollagenaseverdau und Zentrifugation isoliert. Sobald die Zellen in Kultur plattiert sind, können sie expandiert, in Verkehr in verschiedene Protokolle Differenzierung in vitro oder in vivo direkt platziert.
Die creation der 4 mm-kritische Größe Calvaria Defekt stellt eine leicht zugängliche und reproduzierbare in vivo-Modell um die osteogene Differenzierung Fähigkeit unserer Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen testen. Durch den Einsatz von MicroCT, sind wir in der Lage, die Bildung von Knochengewebe in vivo zu verfolgen und den Fortschritt unserer Interventionen (Abbildung 3). Die kritische Größe Calvaria Defekt wird nicht innerhalb der Lebensdauer des Tieres zu heilen und wir sehen rund 90% des Defekts Patent bleiben rund 8 Wochen. Das Gerüst selbst (siehe Diskussion) hat osteogene induktiven Eigenschaften und hat gezeigt, die Fähigkeit, einige knöcherne Regeneration induzieren. Die typischen Ergebnisse Gerüst Platzierung ohne Zellen zeigt, dass rund ein Drittel der Defekt wird de novo Knochenbildung bei 8 Wochen. Mit der Zunahme von Fettgewebe gewonnen Stromazellen, volle zwei Drittel oder mehr der Defekt wird Knochenregeneration bei rund 8 Wochen zeigen, obwohl es Variability zwischen den einzelnen Tier-und Chirurgie. Die Bildung von Knochengewebe durch Histologie quantifiziert werden und typische Ergebnisse zeigen erhöhte Osteoidbildung in Proben mit ASCs durch Anilinblau und Pentachrome Färbung (3C). Darüber hinaus zeigen wir, dass die implantierten menschlichen Zellen auf die zugrunde liegende de novo knöchernen Bildung beitragen, durch die Verwendung von GFP-markierten hASCs die Färbung zeigen in vivo nach 2 Wochen nahe dem Bereich der de-novo-Knochenbildung im Calvaria Defekt (Figur 3D) . Zusätzlich verwenden wir Immunhistochemie mit menschlichen spezifischen Antikörpers gegen menschliches Zellüberleben und Beitrag im Bereich des Defektes (3E) zu zeigen.
Abbildung 1 A -. Die lipoaspirate hat zwei Schichten. Die oberste Schicht enthält die Adipozyten und die Mehrheit der processes Zellmaterial während die untere Schicht die Salzlösung während der lipoaspiration Verfahren verwendet. B - die Schaffung des Calvaria Defekt durch eine Inzision über dem Perikranium die richtige Scheitelbein, anschließende Einrichtung einer 4 mm kritische Größe Calvaria Defekts ohne Unterbrechung des zugrunde liegenden Dura mater zu isolieren.
Abbildung 2. Übersicht der Erntemaschine und Anwendung lipoaspirate aus der Isolierung von Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen, um ihre Expansion, Differenzierung und Verwendung in vitro und in vivo.
Abbildung 3. Ein-MicroCT zeigt in vivo Heilung der kritischen Größe Calvaria Defekt mit der Anwendung über eine ASCs hydroxyapatitie Gerüst (untere Reihe). Die Kontrollen umfassen keine Gerüst und Defekt (obere Reihe) und Defekt mit der Platzierung des Gerüsts ohne Zellen (mittlere Reihe) B - Quantifizierung der Knochenheilung vom MicroCT zeigt deutlich erhöht Heilung in der ASC-Gruppe. C - Histologie zeigt erhöhte Osteoidbildung der ASC-Gruppe (untere Reihe) durch Anilin Blau und Pentachrome Färbung. Für Anilin Blau, die Osteoid Flecken dunkelblau und für Pentachrome, die Osteoid Flecken gelb. D - hASCS mit GFP-markierten wurden auf einem Gerüst ausgesät und in eine Calvaria Defekt gelegt und opferte bei 2 Wochen. Die Färbung wurde mit einem GFP-markierten Antikörper, die menschlichen Zellen Beitrag zur Regeneration in der Stelle des Defekts anzuzeigen getan. E -. Menschliche nuclear antigen Immunhistochemie zeigt Prävalenz von menschlichen Zellen im Bereich des Defektes nach 2 Wochen Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Da die Isolation von Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen 2 ab lipoaspirate wurden diese Zellen in einer Vielzahl von zellulären Abstammungslinien differenziert. Fettgewebe ist aus mesodermalen Ursprungs und daher multipotent Fettgewebe gewonnene Stromazellen wird wahrscheinlich am effektivsten mit der Anwendung zu einem mesodermalen Linie. Die Fähigkeit, Skelettgewebe erzeugen ist besonders kritisch, da der Mangel an Entnahmestellen für eine autologe und die damit verbundenen Einschränkungen aus Kunststoff einschließlich Infektion, Ablehnung und Aufteilung im Laufe der Zeit 3. Fettgewebe-abgeleitete Stromazellen bieten Potential autogenem multipotente Zell-Linie mit einem relativ großen Ausbeute 4 pro chirurgischen Ernte.
Während der Verarbeitung des stromalen vaskulären Fraktion und Adipozyten Gewebe, ist es wichtig, sterilen Technik hervorragende aufrechtzuerhalten. Es gibt ein großes Risiko der Kontamination der Primärkultur angesichts der Natur des Bulk Lipoaspirate kombiniert mit den mehreren Schritten des Waschens, Verdauung und Zentrifugation mit Stufen außerhalb des sterilen Zellkultur Haube. Nachdem das Pellet auf die Schale ausgestrichen wird, wird der Großteil der sichtbaren Zellen eyrthrocytes sein. Dies kann mit sterilem PBS gewaschen werden, sobald das Fettgewebe-abgeleitete Stromazellen wurden an der Platte oder rote Blutkörperchen Lysepuffer angeklebt können hinzugefügt werden. Es ist wichtig, dass die Zellen konfluent sind relativ zu der anfänglichen Plattierungsschritt, um einen ordnungsgemäßen Wachstum und Differenzierung zu gewährleisten.
Es gibt keinen Konsens darüber, wie genau zu definieren Fettgewebe gewonnene Stromazellen. Zwar gibt es bereits Studien versucht haben, diese Population von Zellen auf der Zelloberfläche Markierungen durch Durchflusszytometrie zu definieren, hat der Suche nach einem definierten Satz oder Marker schwierig gewesen. Dies ist wahrscheinlich auf die Variabilität in der Patientenpopulation und den phänotypischen Drift, dass diese Zellen in vitro Erfahrung unter verschiedenen Umgebungen Zellkultur und Variabilität in pasSalbei Zahlen. Die International Society for Cellular Therapy festgestellt, dass bei der mindestens eine mesenchymale Stammzellen müssen bestimmte Merkmale wie die Expression von CD105, CD90, CD73 haben, während fehlt CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19 und HLA-DR 5. Die ursprüngliche Definition des multipotente Natur dieser Zellen stammten aus ihrer Fähigkeit zur Differenzierung zu Zellen von mesodermalen Abstammungslinien in vitro und diese Protokolle sind leicht verfügbar.
Die kritische Größe Calvaria Mangels Modell als Modell wurde validiert, um Skelett Regeneration mit sowohl murine Fettgewebe gewonnene Stromazellen 6 und Menschen stammenden Fettgewebe gewonnene Stromazellen 1 studieren. Die Schaffung einer 4 mm Defekt im rechten parietalen Schädelkalotte einer Maus wird nicht in der gesamten Lebenszeit des Tieres zu heilen. Daher ist jede Heilung gesehen aufgrund der Behandlung im Calvaria Defekt platziert. Während des chirurgischen Verfahrens, ist es besonders wichtig, nicht Injuwieder die zugrunde liegende Dura mater. Die Dura mater selbst stimulieren kann Osteogenese und jede Verletzung erheblich behindern den Heilungsprozess der Calvaria Mangels 7.
Die Verwendung f das Gerüst als Lieferung Mechanismus für Stammzellen ist besonders wichtig in der Welt des Skeletts Engineering. Die Funktion der Skelettgewebe eindeutig der dreidimensionalen Struktur des Makroumfeld verwandt. Die ordnungsgemäße Gerüst kann nicht nur in Stammzelle Abgabe in vivo zu unterstützen, sondern auch ergänzen Osteogenese durch verstärkte osteogenen Eigenschaften des Gerüsts sich. Unser Labor verfügt über Hydroxylapatit, einem Calcium-Derivat, auf die PLGA-Backbone durch die osteoinduktiven und osteokonduktiven Eigenschaften dieses Materials. Allerdings gibt es viele andere Möglichkeiten für Gerüst Schöpfung, die starke osteoinduktiven und osteokonduktiven Eigenschaften 8, 9 haben kann. Zusätzlich kann das Gerüst auch zur leistungsfähigen Adjuvantien wie liefernals kleine Moleküle 10, 11 und Vektoren, um knock down oder regulieren Gen-Targets 12, 13.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten Dr. George Commons und Dr. Dean Vistnes für ihre Unterstützung und Zusammenarbeit unserer Forschung danken. Diese Arbeit wird von National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung Zuschüsse 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 und RC2 DE020771-02, der Oak Foundation und Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medizin zum MTL Dr. Hyun unterstützt wird von der Saint Joseph Mercy Hospital GME unterstützt .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipoaspirate Harvest | |||
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Cellgro | 21-023-CV | |
| Collagenase | Sigma | C6885-500MG | |
| Cell Strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 | |
| Steri-top 500 ml .22 μm filter | Millipore | SCGPT05RE | |
| Calvarial Defect | |||
| Z500 Brushless MicromotorsUM50C | NSK | NSKZ500 | |
| Circular Knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
References
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