Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie van vet-afgeleide stromale cellen van lipoaspirate en de oprichting van een 4 mm kritische grootte calvarial defect aan het skelet regeneratie te evalueren.
Abstract
Craniofaciale skelet herstel en regeneratie biedt de belofte van de novo weefselvorming door een cel benadering gebruik stamcellen. Vet-afgeleide stromale cellen (ASC's) hebben bewezen een rijke bron van multipotente stamcellen kunnen ondergaan osteogene, chondrogene, adipogene en myogene differentiatie. Vele studies hebben onderzocht de osteogene potentieel van deze cellen in vivo met gebruik van steigers verschillende biomaterialen voor cellulaire levering. Het is aangetoond dat door gebruik van een osteoconductief, hydroxyapatiet beklede poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA-HA) scaffold gezaaid met ASC, een kritische grootte calvarial defect, een defect dat wordt gedefinieerd door de onmogelijkheid om ondergaan spontane genezing gedurende de levensduur van het dier, kan effectief worden tonen robuuste ossale regeneratie. Dit in vivo model toont basis van translationele werkwijzen om het botweefsel regenereren - de cellulairecomponent en biologische matrix. Deze werkwijze dient als model voor de uiteindelijke klinische toepassing van een progenitor cel naar de reparatie van een specifiek weefsel defect.
Protocol
1. Cell Isolatie en Expansie
- Alle toestemming van de patiënt en de experimentele protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door Stanford University Institutional Review Board (Protocol # 2188 en # 9999).
- Zorg voor menselijk onderhuids vetweefsel van electieve lipoaspiratie ingreep onder plaatselijke / algemene verdoving.
- Er zullen twee lagen in de lipoaspirate (Figuur 1A). De supernatant bevat het overgrote deel van de verwerkte celmateriaal. De onderste laag wordt meestal geïnjecteerd zoutoplossing. Adipose-afgeleide stromale cellen kunnen worden geoogst uit beide lagen, maar de opbrengst is veel groter uit de supernatant.
- De stromale vasculaire fractie (SVF) isoleren uitgebreid wassen lipoaspirate met gelijke volumes 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2,5% betadine (x2), gevolgd door gelijk volume 1X PBS (x1) zonder betadine. Laat de was neer te slaan.
- Wees voorzichtig om steriel te houdenchnique gedurende het gehele proces als verontreiniging met verwerkte menselijk weefsel kan gebeuren.
- Zuig de onderste laag en gooi na elke wasbeurt.
- Aliquot 15 ml van vetweefsel in 50 ml BD Falcon conische buizen.
- Digereren van het vetweefsel met een gelijk volume (15 ml) gefiltreerd 0,075% collagenase Type II in Balanced Salt Solution Hank's (HBSS) bij 37 ° C in een waterbad gedurende 60 minuten onder constant roeren (ca. 180 schudt / min) - ventileren elke buis om de 15 minuten.
- Neutraliseer enzymactiviteit met 15 ml PBS dat 10% (foetaal runderserum) FBS en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C tot een hoge dichtheid SVF pellet te verkrijgen. De pellet wordt een mix van vet-afgeleide stromale cellen en erytrocyten zijn.
- Giet het supernatans zonder verstoring van de pellet.
- Resuspendeer de pellet in 10 ml van de traditionele groeimedia (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicilline-streptomycine oplossing).
- Filter schorsing sie door een 100 um nylon cel zeef om cellulaire vuil te verwijderen.
- Combineer 3 tubes in een schone 50 ml conische. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Giet het supernatans zonder verstoring van de pellet.
- Resuspendeer de pellet in 5 ml van de traditionele groeimedia
- Combineer twee 50 ml conicals per een 10 cm plaat of vijf 50 ml conicals voor een 15 cm plaat.
- Overnacht vast primaire kweken bij 37 ° C/21% O2, 5% CO2.
- Na incubatie gedurende de nacht, uitgebreid wassen van de platen met PBS om de resterende niet-hechtende rode bloedcellen te verwijderen. De resulterende celpopulaties zijn adipose afgeleide stromacellen.
- Handhaaf de cellen op sub-confluente niveaus aan spontane differentiatie voorkomen bij 37 ° C/21% O2, 5% CO2 in groeimedia. De cellen moeten normaal verdeeld drie tot vier dagen in normale groeimedia bij het uitplaten op 50% confluentie.
- Steigers werden gemaakt door Dr Min Lee aan de Universiteit van Californië, Los Angeles - School voor Tandheelkunde.
- PLGA scaffolds zijn vervaardigd van 85/15 poly (melkzuur-co-glycolzuur) (inherente viscositeit = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) door oplosmiddelgieten en een deeltjesvormig uitloogproces.
- PLGA / chloroform oplossingen werden gemengd met 200-300 urn diameter sucrose tot 92% porositeit (volumefractie), en samengeperst tot dunne vellen in een Teflon vorm te verkrijgen.
- Na vriesdrogen nacht werden scaffolds ondergedompeld in drie veranderingen tweevoudig gedestilleerd (dd) H 2 O de sucrose op te lossen en voorzichtig uit de Teflon plaat met een fijne punt spatel.
- Na deeltjes uitlogen, werden alle scaffolds gedesinfecteerd door onderdompeling in 50%, 60% en 70% ethanol gedurende 30 minuten elk, gevolgd door drie spoelingen van ddH 2 O.
- Alle scaffolds werden gedroogd onder een laminaire stroming kap.
- Na scaffold fabricage, scaffolds werden bekleed met apatiet.
- SBF (gesimuleerde lichaamsvloeistof) oplossing werd bereid met ion concentraties waren 5 keer die van menselijk bloedplasma. Alle oplossingen werden steriel gefiltreerd door een 0,22 urn PES membraan (Nalgene). Onmiddellijk voor het bekleden, gedroogd PLGA scaffolds werden onderworpen aan glimontlading, argon-plasma etsen (Harrick Scientific) bevochtiging en coating uniformiteit te verbeteren.
- Geëtste PLGA scaffolds werden vervolgens geïncubeerd in SBF bij 37 ° C in een watermantel incubator gedurende 12 uur, gevolgd door Mg 2 + en HCO 3 - free SBF 2 nog 12 uur bij 37 ° C onder rustig roeren.
- PLGA scaffolds werden voorzichtig gespoeld met steriel ddH 2 O wegwassen overmaat natriumchlorideoplossing, gedroogd in een laminaire stroming kap en ontsmet met 70% ethanol.
- Integriteit van de coating apatiet werd geanalyseerd met een scanning elektronenmicroscoop (SEM). Apatiet gecoate scaffolds werden op SEM stompjes (Ted Pella) en bekleed met koolstof om de geleidbaarheid te verbeteren. De secundaire elektronen-modus werd toegepast tijdens SEM (FEI / Phillips XL-30) observatie. Energie dispersie röntgenspectrum verkregen om elementaire samenstelling van apatiet structuren te bevestigen.
3. Cel Zaaien
- Bij het bereiken van sub-samenvloeiing niveaus, was de cellen met PBS (x2) en trypsinize.
- Tel de cellen te kwantificeren voor het zaaien
- Zaad op voorgesneden 4,0 mm diameter scaffolds met 1,5 x 10 5 cellen.
- Plaats individuele steiger in een well van een 96-wells plaat
- Resuspendeer cellen in normale groeimedia met een concentratie van ongeveer 1,5 x 10 5 cellen per 20 pi media
- Pipet 20 ul direct op de steiger en plaats in celkweek incubator gedurende 30 minuten.
- Na 30 min, voeg 200 ul media en laat cellen te incuberenop het schavot nacht vóór de operatie
- Het is niet nodig om de hechting van de cellen op de scaffold als enten van een voldoende aantal cellen zorgt ervoor dat een meerderheid wordt vastgemaakt aan de steiger. Dit is gevalideerd in ons laboratorium in vivo met bioluminescentie en histologische analyse.
4. Creatie van Calvarial Gebreken en in vivo implantatie
- Anesthetize volwassen (60 dagen oude) CD-1 naakt muizen met verdoving cocktail. (Ketamine / xylazine / acepromazine) bij 50% concentratie (1:1 verdunning met 0,9% NaCl) of per aanbevolen dosering per orgaan verdoving protocollen. Deze muizen zijn athymische zodat de hASCs zal niet leiden tot een immuunreactie.
- Dosering: Ketamine hydrochloride (80 mg / kg), xylazine (2,5 mg / kg) Acepromazine (2,5 mg / kg)
- Duur van het effect: ongeveer 30 min
- Chirurgisch draperen het dier en steriliseer de chirurgischesite met betadine en alcohol (x3) en omvatten de muis ogen zalf alvorens een middellijn sagittale insnijding in de hoofdhuid van het dier naar rechts wandbeen bloot. Verwijder de pericranium van rechts wandbeen met stompe schrapen (Figuur 1B).
- Maak een unilaterale 4-mm volledige dikte defect in het recht niet-hechting verbonden wandbeen met behulp van een steriele diamant-gecoate trephine boor. Uiterste voorzichtigheid is geboden om de onderliggende dura mater (Figuur 1B) verstoren als de muis calvarial dikte is <0,3 mm.
- Voor implantatie spoelen met steriel PBS scaffolds de overdracht van medium afgeleide groeifactoren voorkomen.
- Plaats de steiger in het defect.
- Tot slot hechten van de huid gesloten en toezicht houden op de dieren per vastgestelde postoperatieve protocollen.
- Gebruik gevestigd analgesie zoals voorgeschreven door uw dier zorgprotocollen als post-operatief-bv nodig. buprenorfine 0,1 mg / kg.
5. Kwantificering van osteoid Vorming
- Na microCT werd uitgevoerd op de muis werd de driedimensionaal beeld gereconstrueerd door middel MicroView software zoals eerder beschreven 1.
- Met behulp van Adobe Photoshop, de beelden waren ontworpen om een standaard hoogte.
- Met behulp van de Magic Wand functie, werden pixels gemeten van de calvarial defect.
- Percentage genezing van het defect werd bepaald door de daaropvolgende CT-scans meten van het calvarial gebrek gebied en het bepalen van het aantal pixels te delen door pixel het oorspronkelijke defect nummer
- Indien derhalve de microCT niet beschikbaar is, wordt een alternatief met Adobe Photoshop en oogsten van de calvaria op vastgestelde tijdstippen voor histologie.
- Met behulp van histologische kleuringen zoals aniline blauw en Pentachrome dat osteoïd vorming aan te duiden, moet meerdere secties langs de spanwijdte van het defect te zijn gebrandschilderde
- Met behulp van Adobe Photoshop, gewas uit alle gebieden die nietin de calvarial defect
- Gebruik de toverstaf functie en bepalen aantal pixels van de novo botvorming op het gebied van het gebrek en te vergelijken met controles of andere variabelen.
6. Representatieve resultaten
Vetweefsel heeft het potentieel om een vitale rol dienen bij het genereren van progenitorcellen voor klinische toepassing. Vetweefsel heeft een uniek voordeel in dat er een voorziening beschikbaar die kunnen worden geoogst in een relatief eenvoudige procedure die minimale morbiditeit en mortaliteit omvat. Zodra het weefsel geoogst en verzameld, wordt ons protocol beschreven in figuur 2. Vet-afgeleide stromale cellen worden geïsoleerd door een reeks wasstappen, collagenase vertering en centrifugatie. Zodra de cellen uitgeplaat in cultuur kunnen zij worden uitgebreid, geplaatst in verschillende protocollen differentiatie in vitro of in vivo direct geplaatst.
De creation van de 4 mm kritische grootte calvarial defect zorgt voor een gemakkelijk toegankelijk en reproduceerbaar in vivo model om de osteogene differentiatie vermogen van onze vet-afgeleide stromale cellen te testen. Door het gebruik van microCT, kunnen we de vorming van botweefsel in vivo te volgen en de voortgang van de interventies (Figuur 3) te volgen. De kritische-size calvarial defect zal niet genezen binnen de levensduur van het dier en we zien ongeveer 90% van het defect octrooi blijft rond de 8 weken. De steiger zelf (zie bespreking) heeft osteogene inductieve eigenschappen en heeft laten zien de mogelijkheid om een aantal benige regeneratie te induceren. De typische resultaten van scaffold plaatsen zonder cellen toont aan dat ongeveer een derde van het defect zal de novo botvorming na 8 weken. Bij de uitbreiding van vetweefsel-afgeleide stromacellen, volledig tweederde of meer defect zal ossale regeneratie ongeveer 8 weken hoewel er variabiliteit tussen elk dier en chirurgie. De vorming van botweefsel kan worden gekwantificeerd door histologie en standaard tonen toegenomen osteoid vorming in monsters met ASCs door Aniline Blue en Pentachrome kleuring (Figuur 3C). Bovendien tonen wij dat de geïmplanteerde menselijke cellen bijdragen tot de uiteindelijke vorming de novo beenweefsel door het gebruik van GFP-gelabelde hASCs dat kleuring vertonen in vivo na 2 weken bij het gebied van de novo botvorming in de calvarial defect (figuur 3D) . Bovendien gebruiken we immunohistochemie met humaan specifieke antilichamen tegen humaan celoverleving en bijdrage geven in het gebied van het defect (figuur 3E).
Figuur 1 A -. Lipoaspirate De twee lagen. De bovenste laag bevat de adipocyten en de meerderheid van de processes celmateriaal terwijl de onderste laag bevat het zout tijdens de lipoaspiratie procedure. B - de oprichting van de calvarial defect door middel van een incisie over de pericranium naar rechts pariëtale bot, vervolgens het opzetten van een 4 mm kritische afmetingen calvarial defect te isoleren zonder verstoring van de onderliggende dura mater.
Figuur 2. Overzicht van de oogst en toepassing van lipoaspirate uit de isolatie van vetweefsel-afgeleide stromacellen hun expansie, differentiatie en het gebruik in vitro en in vivo.
Figuur 3. A-microCT die in vivo herstel van de kritieke omvang calvarial defect met de toepassing van ASCs door een hydroxyapatitie steiger (onderste rij). Controles omvatten geen steiger en defect (bovenste rij) en defect met de plaatsing van de steiger zonder cellen (middelste rij) B - Kwantificering van ossale genezing van de microCT met sterk toegenomen genezing in de ASC-groep. C - Histologie die verhoogde osteoid vorming van de ASC groep (onderste rij) door Aniline Blue kleuring en Pentachrome. Voor Aniline blauw, de osteoïd vlekken donker blauw en voor Pentachrome, de osteoïd vlekken geel. D - hASCS gelabeld met GFP werden gezaaid op een steiger en in een calvarial defect en opgeofferd na 2 weken. Kleuring werd uitgevoerd met een GFP gemerkt antilichaam aan de menselijke cellen die bijdragen aan de regeneratie in plaats van het defect vertonen. E -. Human kernantigeen immunohistochemie geeft prevalentie van menselijke cellen in de plaats van het defect van 2 weken Klik hier om groter bedrag bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aangezien de isolatie van vet-afgeleide stromacellen 2 van lipoaspirate zijn deze cellen gedifferentieerd zijn in een grote verscheidenheid van cellulaire lijnen. Vetweefsel is van mesodermale oorsprong en daarom multipotente vetweefsel-afgeleide stromale cellen zullen waarschijnlijk het meest effectief met toepassing naar een mesodermale afstamming. De mogelijkheid om skeletweefsel genereren is vooral van belang gezien het tekort aan donor sites voor een autotransplantaat en de inherente beperkingen van synthetisch materiaal met inbegrip van infectie, afwijzing en afbraak na verloop van tijd 3. Vet-afgeleide stromale cellen bieden een potentieel autogeen multipotente cellijn met een relatief grote opbrengst 4 per chirurgische oogst.
Bij de verwerking van de stromale vasculaire fractie en adipocyten weefsel is belangrijk om uitstekende steriele techniek. Er is een groot risico van vervuiling van de primaire cultuur gezien de aard van de bulk lipoaspirate in combinatie met de verschillende stappen van wassen, de spijsvertering, en centrifugeren met stappen buiten de steriele celkweek kap. Nadat de pellet wordt uitgeplaat op de schotel zal het grootste deel van het zichtbare cellen eyrthrocytes. Deze kunnen worden gewassen met steriele PBS als de vet-afgeleide stromale cellen gehecht aan de plaat of rode bloedcellen lysis buffer worden toegevoegd. Het is belangrijk dat de cellen relatief confluent de eerste stap plating om een goede groei en differentiatie waarborgen.
Er is geen consensus over de manier waarop exact te omschrijven vet-afgeleide stromale cellen. Hoewel er studies proberen deze populatie van cellen op basis van celoppervlaktemarkers door flowcytometrie definiëren, het vinden van een gedefinieerde set markers of moeilijk geweest. Dit komt waarschijnlijk door de variabiliteit van de patiëntenpopulatie en de fenotypische drift dat deze cellen ervaring in vitro onder verschillende omgevingen celkweek en variabiliteit in passalie nummers. De International Society for Cellular Therapy verklaard dat op het minimum, een mesenchymale stamcellen moeten bepaalde kenmerken en het uiten van CD105, CD90, CD73, terwijl gebrek aan CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19 en HLA-DR 5. De oorspronkelijke definitie van de multi-potente karakter van deze cellen afkomstig van hun vermogen om te differentiëren in cellen van mesodermale lijnen in vitro en deze protocollen zijn beschikbaar.
De kritische grootte calvarial defect model is gevalideerd als model om het skelet regeneratie met behulp van zowel muizen vet-afgeleide stromale cellen 6 en de mens afkomstige vet-afgeleide stromale cellen 1 te bestuderen. De oprichting van een 4 mm defect in het recht pariëtale calvaria van een muis zal niet genezen tijdens het leven van het dier. Derhalve gezien een genezing is door de behandeling geplaatst binnen calvarial defect. Tijdens de chirurgische procedure, is het bijzonder belangrijk om niet tiefondsopnieuw de onderliggende dura mater. De dura mater zelf kunnen stimuleren osteogenesis en eventuele schade kan het genezingsproces aanzienlijk bemoeilijken om de calvarial defect 7.
Het gebruik f de steiger als toedieningsmechanisme voor stamcellen is vooral belangrijk in de wereld van skelet engineering. De functie van skeletweefsel is uniek gerelateerd aan de driedimensionale structuur van de macro-omgeving. De juiste steiger kan niet alleen helpen bij het stamcel levering in vivo, maar ook vergroten osteogenese door de verbeterde osteogene eigenschappen van de steiger zelf. Ons laboratorium bevat hydroxyapatiet, een calcium derivaat op de PLGA backbone door het osteo-inductieve en osteoconductief eigenschappen van dit materiaal. Echter, er zijn vele andere opties voor steiger creatie die kunnen sterke osteo-inductief en osteoconductief eigenschappen 8, 9. Bovendien kan de steiger ook worden gebruikt om krachtige adjuvantia leverenals kleine moleculen 10, 11 en vectoren af te breken of upregulate gen doelen 12, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Dr George Commons en Dr Dean Vistnes bedanken voor hun steun en medewerking van ons onderzoek. Dit werk wordt ondersteund door National Institute of Dental en Craniofaciale Onderzoek vergoedingen 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 en RC2 DE020771-02, de Oak Foundation en Hagey Laboratorium voor Pediatrische regeneratieve geneeskunde voor de MTL Dr Hyun wordt ondersteund door de Saint Joseph Mercy Hospital GME .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipoaspirate Harvest | |||
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Cellgro | 21-023-CV | |
| Collagenase | Sigma | C6885-500MG | |
| Cell Strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 | |
| Steri-top 500 ml .22 μm filter | Millipore | SCGPT05RE | |
| Calvarial Defect | |||
| Z500 Brushless MicromotorsUM50C | NSK | NSKZ500 | |
| Circular Knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
References
- Levi, B., James, A. W., Nelson, E. R. Human adipose-derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defect. PLoS One. 5, (2010).
- Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjia, P. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Keefe, M. S., Keefe, M. A. An evaluation of the effectiveness of different techniques for intraoperative antibiotics into alloplastic implants for use in facial reconstruction. Arch Facial Plastic Surg. 11, 246-251 (2009).
- Mitchell, J. B., McIntosh, K., Zvonic, S. Immunophenotype of human adipose-derived cells: Temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
- Dominici, M., Blanc, K. L. e, Mueller, I. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stroma cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Cowan, C. M., Shi, Y. Y., Aalami, O. O. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size calvarial defects. Nat Biotechnol. 22, 560-567 (2004).
- Levi, B., Nelson, E. R., Li, S. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29, 1241-1255 (2011).
- Phipps, M. C., Clem, W. C., Catledge, S. A. Mesenchymal stem cells responses to bone-mimetic electrospun matrices composed of polycaprolactone, collagen I and nanoparticulate hydroxyapatite. PLoS One. 6, (2011).
- Yuan, H., Zang, Z., Li, Y. Osteoinduction by calcium phosphate biomaterials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 9, 723-726 (1998).
- Wei, G., Jun, Q., Giannobile, W. V. The enchancement of osteogenesis by nano-fibrous scaffolds incorporating rhBMP-7 nanospheres. Biomaterials. 28, 2087-2096 (2007).
- Li, C., Verpari, C., Jin, H. J. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
- Zhang, Y., Fan, W., Nothdurft, L. In vitro and in vivo evaluation of adenovirus combined silk fibroin scaffolds for bone morphogenetic protein-7 gene delivery. Tissue Eng Part C Methods. 17, 789-797 (2011).
- Levi, B., Hyun, J. S., Nelson, E. R. Non-integrating knockdown and customized scaffold design enhances human-adipose-derived stem cells in skeletal repair. Stem Cells. 29, 21028-21029 (2011).
