Reparation af en kritisk størrelse calvarial Defekt model ved hjælp af fedtvæv-afledte stromaceller høstet fra Lipoaspirate

Summary

Denne protokol beskriver isolationen af ​​adipose-afledte stromaceller fra lipoaspirate og oprettelsen af ​​en 4 mm kritisk størrelse calvarial defekt at evaluere skelet regenerering.

Abstract

Kraniofaciale skeletal reparation og regenerering har løftet om de novo vævsdannelse gennem en celle tilgang under anvendelse af stamceller. Adipøst-afledte stromaceller (ASC'er) har vist sig at være kraftigt et multipotente stamceller stand til at undergå osteogent, chondrogene, adipogeniske og myogen differentiering. Mange undersøgelser har undersøgt det osteogene potentiale af disse celler in vivo med anvendelse af forskellige stilladselementer biomaterialer til cellulær afgivelse. Det er blevet påvist, at ved anvendelse af et osteokonduktivt, hydroxyapatit-coatede poly (mælke-co-glycolsyre) (HA-PLGA) skelet podet med ASC, en kritisk størrelse calvarial defekt, en defekt, der er defineret ved sin manglende evne til at undergå spontan healing over levetiden af ​​dyret, effektivt kan udvise robust ossøse regenerering. Dette in vivo-model viser grundlag af translationelle fremgangsmåder til formål at regenerere knoglevæv - det cellulærekomponent og biologisk matrix. Denne metode tjener som en model for den endelige kliniske anvendelse af en progenitorcelle til reparation af en specifik vævsdefekt.

Protocol

1. Cell Isolation & Expansion

1. Alle patient samtykke og forsøgsprotokoller blev gennemgået og godkendt af Stanford University Institutional Review Board (protokol # 2188 og # 9999).
2. Opnå humant subkutant fedtvæv fra valgfrie lipoaspiration procedurerne under lokal / generel anæstesi.
3. Der vil være to lag i lipoaspirate (figur 1A). Supernatanten indeholder størstedelen af ​​den behandlede cellemateriale. Det nederste lag er for det meste injiceret saltvand. Adipose-afledte stromaceller kan høstes fra begge lag, men udbyttet er meget større fra supernatanten.
4. At isolere stroma vaskulære fraktion (SVF), vaskes lipoaspirate grundigt med lige store volumener af 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) indeholdende 2,5% Betadine (x2) efterfulgt af tilsvarende volumen 1X PBS (x1) uden betadin. Tillade vask med bundfaldet.
5. Vær omhyggelig med at opretholde steril technique hele processen som kontaminering med forarbejdet humant væv kan ske.
6. Aspirer det nederste lag og kasseres efter hver vask.
7. Portion 15 ml af fedtvæv i 50 ml BD Falcon koniske rør.
8. Fordøje fedtvæv med et tilsvarende volumen (15 ml) filtreret 0,075% type II collagenase i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) ved 37 ° C i et vandbad i 60 minutter under konstant omrøring (ca. 180 shakes / min) - ventilere hvert rør hvert 15. minut.
9. Neutraliser enzymaktivitet med 15 ml PBS indeholdende 10% (føtalt bovint serum) FBS, og centrifugeres ved 1.000 rpm i 5 min ved 4 ° C til opnåelse af en høj tæthed SVF pellet. Pelleten bliver en blanding af adipose-afledte stromaceller og erythrocytter.
10. Supernatanten kasseres, uden at forstyrre pelleten.
11. Pelleten genopslæmmes i 10 ml af traditionelle vækstmedium (Dulbeccos Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicillin-streptomycin-opløsning).
12. Filter affjedring sionen gennem en 100 um nylon celle filter for at fjerne cellerester.
13. Kombiner 3 rør til et rent 50 ml konisk. Der centrifugeres ved 1.000 rpm i 5 min ved 4 ° C.
14. Supernatanten kasseres, uden at forstyrre pelleten.
15. Pellet resuspenderes i 5 ml af traditionelle vækstmedier
16. Kombiner to 50 ml conicals pr en 10 cm plade eller fem 50 ml conicals for en 15 cm plade.
17. Indføre primære kulturer natten over ved 37 ° _C/21% O2, _5% CO2.
18. Efter inkubation natten over, pladerne vaskes grundigt med PBS for at fjerne tilbageværende ikke-adhærente røde blodlegemer. De resulterende cellepopulationer er adipose-afledte stromaceller.
19. Opretholde cellerne ved subkonfluente niveauer for at forhindre spontan differentiering ved 37 ° _C/21% O2, _5% CO2 i vækstmedier. Cellerne almindelighed skal deles hver tre til fire dage i almindelige vækstmedium, når udpladet ved 50% konfluens.

ve_title "> 2. Scaffold Forberedelse

1. Stilladser blev foretaget af Dr. Min Lee ved University of California, Los Angeles - School of Dentistry.
2. PLGA skeletter blev fremstillet af 85/15 poly (mælke-co-glycolsyre) (iboende viskositet = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) ved opløsningsmiddelstøbning og et partikelformigt udludningsfremgangsmåde.
3. PLGA / chloroform opløsninger blev blandet med 200 til 300 um diameter sucrose til opnåelse af 92% porøsitet (volumenfraktion), og presses til tynde ark i en Teflon form.
4. Efter frysetørring natten over, blev stilladser nedsænket i tre skift af dobbelt-destilleret (dd) _H2O til at opløse saccharosen, og forsigtigt fjernet fra teflonplade med en fin-spids spatel.
5. Efter partikelformigt udvaskning blev alle scaffolds desinficeret ved nedsænkning i 50%, 60% og 70% ethanol i 30 minutter hver, efterfulgt af tre skylninger af DDH ₂ O.
6. Alle skeletter blev tørret under en laminar strømningshætte.
7. Efter stillads fabrikation, scaffolds blev overtrukket med apatit.
   1. SBF (simuleret legemsvæske) opløsning blev fremstillet med ionkoncentrationer, som var 5 gange den for humant blodplasma. Alle opløsninger blev sterilfiltreret gennem et 0,22 um membran PES (Nalgene). Umiddelbart før overtrækningsprocessen, tørret PLGA scaffolds blev underkastet glimudladning, argon-plasma-ætsning (Harrick Scientific) for at forbedre befugtning og belægning ensartethed.
   2. Ætsede PLGA scaffolds blev derefter inkuberet i SBF ved 37 ° C i en vand-kappe forsynet inkubator i 12 timer, efterfulgt af ^{Mg2 +} og HCO ₃ ^- fri SBF 2 for yderligere 12 timer ved 37 ° C under forsigtig omrøring.
   3. Coatede PLGA scaffolds blev skyllet forsigtigt med sterilt ddH ₂ O at vaske overskydende natriumchloridopløsning, tørres i en laminar strømningshætte, og desinficeres med 70% ethanol.
   4. Integritet af apatit coating blev analyseret med et scanningselektronmikroskop (SEM). Apatit-overtrukket scaffolds blev monteret på SEM stubbe (Ted Pella) og overtrukket med carbon for at forbedre ledningsevnen. Den sekundære elektron tilstand blev anvendt under SEM (FEI / Phillips XL-30) observation. Energi dispersion røntgenspektrum opnåedes at bekræfte grundstofsammensætningen for de apatit strukturer.

3. Cellepodning

1. Efter at have nået sub-Confluence niveauer, vaske cellerne med PBS (x2) og Trypsinisér.
2. Tæl cellerne at kvantificere til såning
3. Frø på forskårne 4,0 mm i diameter stilladser med 1,5 x 10 ⁵ celler.
   1. Sted enkelte stillads til en brønd i en plade med 96 brønde
   2. Resuspender celler i regelmæssige vækstmedier med en koncentration på omkring 1,5 x 10 ⁵ celler pr 20 pi medier
   3. Pipette 20 ul direkte på stilladset og anbringes i cellekultur inkubator i 30 minutter.
   4. Efter 30 minutter tilsættes 200 pi af mediet og tillader celler at inkuberepå stilladset natten over før kirurgi
   5. Det er ikke nødvendigt at sikre vedhæftning af cellerne over på stilladset som podning et tilstrækkeligt antal celler vil sikre, at et flertal vil lægge på stilladset. Dette er blevet valideret i vores laboratorium in vivo med bioluminescens og histologisk analyse.

4. Oprettelse af calvarial Fejl og in vivo implantat

1. Bedøve voksen (60 dage gamle) CD-1 nøgne mus med bedøvelsesmiddel cocktail. (Ketamin / xylazin / acepromazin) ved 50% koncentration (1:1 fortynding med 0,9% NaCI) eller pr anbefalet anæstesiregimet pr institutionens protokoller. Disse mus er athymiske så hASCs ikke vil forårsage en immunreaktion.
   1. Dosering: ketaminhydrochlorid (80 mg / kg), xylazin (2,5 mg / kg) acepromazin (2,5 mg / kg)
   2. Varighed af virkning: ca 30 min
2. Kirurgisk drapere dyret og sterilisere det kirurgiskested med betadin og alkohol (x3) og dækker muse øjne med salve før der træffes en midtlinie sagittalt snit i hovedbunden af ​​dyret for at blotlægge højre parietal knogle. Fjern pericranium fra højre parietal knogle med stump skrabning (figur 1B).
3. Opret en ensidig 4 mm fuld tykkelse defekt i højre ikke-sutur associeret parietal knogle under anvendelse af en steril diamantbelagt trepan borekronen. Extreme skal udvises forsigtighed for ikke at forstyrre den underliggende dura mater (figur 1B) som musen calvarial tykkelse er <0,3 mm.
4. Før implantation, skylles stilladser med sterilt PBS for at forhindre overførsel af medium-afledte vækstfaktorer.
5. Placer stilladset ind i defekten.
6. Endelig sutur i huden lukket, og følge dyrets pr etablerede postoperative protokoller.
7. Brug etableret analgesi som anvist af din dyrepleje protokoller efter behov postoperativt-eg. buprenorphin 0,1 mg / kg..

5. Kvantificering af osteoid formation

1. Efter MicroCT blev udført på musen blev det tredimensionale billede rekonstrueret ved hjælp MicroView software som beskrevet tidligere ^1.
2. Ved hjælp af Adobe Photoshop, billederne var dimensioneret til en standard højde.
3. Brug Magic Wand funktionen blev pixels målt i calvarial defekt.
4. Procentvise heling af defekten blev bestemt ved efterfølgende CT-scanninger måle calvarial defekte område og bestemmelse antal pixel og dividere det med den oprindelige defekt er pixelantal
5. Betyder, at hvis MicroCT er utilgængelig, vises et alternativ ved hjælp af Adobe Photoshop og høst af calvaria med bestemte tidspunkter for histologi.
6. Brug histologiske pletter som anilinblåt og Pentachrome der betegner osteoid formation, bør flere sektioner langs span af defekten være farves
7. Ved hjælp af Adobe Photoshop, beskære alle de områder, der ikkei calvarial defekten
8. Brug tryllestaven funktionen og bestemme pixel antal de novo knogledannelse i det område af defekten og sammenligne til kontroller eller andre variabler.

6. Repræsentative resultater

Fedtvæv har potentiale til at tjene en vigtig rolle i dannelsen af ​​progenitorceller til klinisk anvendelse. Fedtvæv har en unik fordel, at der er en let tilgængelig forsyning, der kan høstes på en relativ simpel proces, der omfatter minimal sygelighed og dødelighed. Når vævet høstes og opsamles, er vores proceduren skitseret i figur 2. Adipose-afledte stromaceller isoleres gennem en række vasketrin, collagenasefordøjelse og centrifugering. Når cellerne udplades i kultur, kan de ekspanderes, anbragt i forskellige differentiering protokoller in vitro, eller anbringes direkte in vivo.

The creation af 4 mm kritiske størrelse calvarial defekt tilvejebringer en let tilgængelig og reproducerbar in vivo-model til at teste den osteogene differentiering evne vores adipose-afledte stromaceller. Gennem brug af MicroCT, er vi i stand til at følge dannelsen af knoglevæv in vivo og spore fremskridt af vores interventioner (Figur 3). Den kritiske størrelse calvarial fejl vil ikke helbrede i hele dyrets levetid, og vi ser omkring 90% af defekten forbliver patent omkring 8 uger. Stilladset selv (se diskussionen) har osteogene induktive egenskaber og har vist evnen til at inducere nogle benede regenerering. De typiske resultater af stillads placering uden celler viser, at omkring en tredjedel af defekten har de novo knogledannelse efter 8 uger. Med udvidet adipose-afledte stromaceller, to tredjedele eller flere af defekten fuldstændigt vil vise ossøse regeneration på omkring 8 uger, selv om der er variability mellem hvert dyr og kirurgi. Dannelsen af knoglevæv kan kvantificeres ved hjælp af histologi og typiske resultater viser forøget osteoid formation i prøver med ASC gennem Anilin Blå og Pentachrome farvning (figur 3C). Derudover viser vi, at de implanterede humane celler bidrager til den underliggende de novo ossøse formation ved anvendelse af GFP-mærkede hASCs der viser farvning in vivo efter 2 uger i nærheden af området for de novo knogledannelse i calvarial defekt (figur 3D) . Derudover anvender vi immunhistokemi med humant specifikt antistof til at vise human celleoverlevelse og bidrag på området af defekten (figur 3E).

Figur 1 A -. The lipoaspirate har to lag. Det øverste lag indeholder adipocytter og størstedelen af ​​processes cellulært materiale, mens det nederste lag indeholder saltvand anvendes under lipoaspiration procedure. B - oprettelsen af ​​det calvarial defekt gennem en midtlinieincision over pericranium at isolere højre parietal knogle, efterfølgende oprettelse af et 4 mm kritisk størrelse calvarial defekt uden afbrydelse af den underliggende dura mater.

Figur 2. Oversigt over høst og anvendelse af lipoaspirate fra isoleringen af adipose-afledte stromaceller til at ekspandere, differentiering og anvendelse in vitro og in vivo.

Fig. 3. A-MicroCT viser in vivo heling af kritiske størrelse calvarial defekt med anvendelsen af ASC'er gennem en hydroxyapatitie stillads (nederste række). Kontrollen omfatter ikke stillads og defekt (øverste række) og defekt med placering af stilladset uden celler (Middle Row) B - Kvantificering af knoglemasse healing fra MicroCT viser signifikant øget helbredelse i ASC-gruppen. C - Histologi viser forøget osteoid dannelsen af ​​ASC-gruppen (nederste række) gennem anilinblåt og Pentachrome farvning. For anilinblåt,. De osteoide pletter mørkeblå og for Pentachrome, de osteoide pletter gule D - hASCS mærket med GFP blev podet i et stillads og anbragt i en calvarial defekt og aflivet efter 2 uger. Farvning blev udført med et GFP-mærket antistof til at vise de humane celler, der bidrager til regenerering inden for defekten. E -. Humant nuklear antigen immunohistokemi viser forekomsten af humane celler i det område af defekten ved 2 uger Klik her for at se større figur .

Discussion

Da isoleringen af adipose-afledte stromaceller ² fra lipoaspirate, er disse celler blevet differentieret i en lang række af cellulære afstamninger. Fedtvæv er fra mesodermale oprindelser og derfor vil multipotente adipøst afledte stromaceller sandsynligvis være mest effektive med anvendelsen mod en mesodermal cellelinie. Evnen til at generere skeletvæv er især kritisk i betragtning af den mangel på donorer sites for et autotransplantat og de ​​iboende begrænsninger i syntetisk materiale, herunder infektion, afvisning, og opdelingen over tid ^3. Adipøst afledte stromaceller udgør et potentiale autogent multipotent cellelinie med et relativt stort udbytte ⁴ per kirurgisk høst.

Under behandlingen af ​​det stromale vaskulære fraktion og adipocyt væv, er det vigtigt at opretholde god steril teknik. Der er en stor risiko for forurening af den primære kultur betragtning hovedparten karakter lipoaspirate kombineres med flere trin for vask, fordøjelse, og centrifugering med skridt uden for sterile cellekultur hætte. Når pelleten udpladet på fadet, vil størstedelen af ​​de synlige celler være eyrthrocytes. Disse kan vaskes med sterilt PBS når fedt-afledte stromaceller er klæbet til pladen eller røde blodlegemer lysisbuffer kan tilføjes. Det er vigtigt, at cellerne er relativt sammenflydende på den indledende udpladning trin for at sikre korrekt vækst og differentiering.

Der er ikke enighed om, hvordan man præcist definerer adipøst afledte stromaceller. Selv om der er blevet undersøgelser forsøgt at definere disse population af celler baseret på celleoverflademarkører ved flowcytometri, har finde et defineret sæt eller markører været vanskeligt. Dette skyldes sandsynligvis variabilitet i patientpopulationen og den fænotypiske drift at disse celler erfaring in vitro under forskellige cellekultur miljøer og variabilitet i passage numre. Den internationale Society for Cellulær Therapy erklærede, at på et minimum, skal en mesenkymale stamcelle have visse karakteristika, herunder ekspressionen af CD105, CD90, CD73, mens mangler CD45, CD34, CD14, CD11, CD79α, CD19 og HLA-DR ^5. Den oprindelige definition af multi-potente karakter af disse celler kom fra deres evne til at differentiere til celler af mesodermale slægter in vitro og disse protokoller er let tilgængelige.

Den kritiske størrelse calvarial defekt model er blevet valideret som model til at studere regeneration skelet anvendelse af både murine adipose-afledte stromaceller ⁶ og human-derived adipose-afledte stromaceller ^en. Oprettelsen af ​​et 4 mm defekt i højre parietal calvaria af en mus vil ikke helbrede i hele dyrets levetid. Derfor ethvert ses healing skyldes behandlingen placeret inden i calvarial defekten. Under den kirurgiske proces, er det især vigtigt at ikke injure den underliggende dura mater. Dura mater selv kan stimulere osteogenese og enhver skade kan væsentligt hæmme helingsprocessen til calvarial defekt ^7.

Brugen f stilladset som en leverance mekanisme til stamceller er især vigtigt i en verden af ​​skelet teknik. Funktionen af ​​knoglevæv er unikt relateret til den tredimensionelle struktur af makro-miljø. Den korrekte stillads kan ikke blot hjælpe med stamceller levering in vivo, men også forøge osteogenese gennem de forbedrede osteogene egenskaber i stilladset selv. Vores laboratorium indbefatter hydroxyapatit, en calcium-derivat, på PLGA skelettet på grund af de knogleinduktive og osteokonduktive egenskaber af dette materiale. Men der er mange andre muligheder for stillads skabelse, der kan have stærke osteoinduktive og osteokonduktivt egenskaber ^{8, 9.} Desuden kan stilladset også anvendes til at levere effektive adjuvanser sådannesom små molekyler ^{10, 11} og vektorer til at vælte eller opregulere genmål ^{12, 13.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipoaspirate Harvest
PBS	Gibco	10010-023
Hank's Balanced Salt Solution	Cellgro	21-023-CV
Collagenase	Sigma	C6885-500MG
Cell Strainer 100 μm	BD Falcon	352360
Steri-top 500 ml .22 μm filter	Millipore	SCGPT05RE
Calvarial Defect
Z500 Brushless MicromotorsUM50C	NSK	NSKZ500
Circular Knife 4.0 mm	Xemax Surgical	CK40