מאמר זה מתאר גישה biofabrication: בתצהיר של גירויים, תגובה סוכרים בנוכחות אלקטרודות משוחדים ליצור סרטים ביולוגית אשר יכולה להיות פונקציונליות עם תאים או חלבונים. אנחנו מדגימים אסטרטגיה הספסל העליון לדור של סרטים כמו גם השימושים הבסיסיים ליצירת משטחים biofunctionalized אינטראקטיביים עבור מעבדה על שבב יישומים.
התקדמות ההבטחה על שבב מעבדת הטכנולוגיה לחולל מהפכה גם מחקר ורפואה באמצעות עלויות נמוכות יותר, רגישות יותר, ניידות, ותפוקה גבוהה יותר. שילוב של רכיבים ביולוגיים על גבי מערכות מיקרו ביולוגיים (BioMEMS) הראה פוטנציאל רב להשגת מטרות אלה. שבבים אלקטרוניים Microfabricated לאפשר מיקרומטר בקנה מידה תכונות, כמו גם חיבור חשמל עבור חישה actuation. רכיבים ביולוגיים פונקציונלית לתת למערכת יכולת זיהוי ספציפי של analytes, פונקציות אנזימטיות, וכן כל תא ויכולות. Microfabrication תהליכים סטנדרטיים ביו טכניקות אנליטיות כבר נוצלו בהצלחה במשך עשרות שנים בענפי מחשב ביולוגי, בהתאמה. שילוב שלהם ממשק בסביבת מעבדה על שבב, לעומת זאת, מביאה אתגרים חדשים. יש קריאה טכניקות שיכולות לבנות ממשק בין האלקטרודה ו compon הביולוגיאף אוזן גרון, כי היא קלה קל לפברק דפוס.
Biofabrication, המתוארת כאן, היא אחת הגישות כך הראו הבטחה גדולה התאגדותה קל להרכיב רכיבים ביולוגיים עם צדדיות של פונקציות על שבב המופעלים. Biofabrication משתמש בחומרים ביולוגיים ומנגנונים ביולוגיים (הרכבה עצמית, הרכבה האנזימטית) להרכבה מלמטה למעלה היררכי. בעוד המעבדות שלנו הוכיחו את המושגים האלה בפורמטים רבים 1,2,3, כאן אנחנו מדגימים את תהליך ההרכבה מבוסס על electrodeposition ואחריו מספר יישומים של האות מבוססי אינטראקציות. תהליך ההרכבה כולל electrodeposition של גירויים, תגובה סרטים ביולוגית פולימר על אלקטרודות functionalization הבאים שלהם עם מרכיבים ביולוגיים כמו DNA, אנזימים, או תאים חיים 4.5. Electrodeposition מנצל את מפל pH נוצר על פני השטח של האלקטרודה מוטה מן אלקטרוליזהמים 6,7,. Chitosan ו אלגינט הם גירויים תגובה פולימרים ביולוגיים שניתן מופעלות עצמית יותך סרטים הידרוג'ל בתגובה לאותות חשמליים הטילה 8. עובי של הידרוג אלה נקבעת על ידי המידה בה שיפוע pH משתרע בין האלקטרודה. זה יכול להיות שונה באמצעות צפיפויות שונות הנוכחית ושעות בתצהיר 6,7. פרוטוקול זה יתאר כמה סרטים chitosan מופקדים ו פונקציונליות ידי קוולנטית מצרף מרכיבים ביולוגיים לקבוצות שפע אמין העיקריים הקיימים על הסרט בין אם באמצעות שיטות אנזימטיות או אלקטרוכימי 9,10. סרטים אלגינט ו מלכודת שלהם תאים חיים גם להתייחס 11. לבסוף, תוכנית השירות של biofabrication מודגם באמצעות דוגמאות של אינטראקציה המבוססת על אותות כימיים, כולל אל חשמלי, תא תא אל, וגם אנזים אל התא אות השידור.
שניהם electrodepositionו functionalization יכול להתבצע תחת תנאים פיזיולוגיים כמעט ללא צורך ריאגנטים ובכך לחסוך רכיבים ביולוגיים יציב ממצבים קשים. בנוסף, הן chitosan ו אלגינט כבר זמן רב למטרות ביולוגית הרלוונטיים 12,13. בסך הכל, biofabrication, טכניקה מהירה שיכולה להתבצע רק על benchtop, יכול לשמש ליצירת בקנה מידה מיקרון דפוסים של רכיבים ביולוגיים תפקודית על אלקטרודות והוא יכול לשמש עבור מגוון רחב של מעבדה על שבב יישומים.
הנהלים שלנו להפגין electrodeposition ו functionalization של סרטים biopolymer, תהליך שאנו טווח biofabrication. דרך functionalization עם תאים ביומולקולות אנחנו יוצרים משטחים ביולוגיים בעלי יכולת אינטראקציה זה עם זה ואת כתובת האלקטרודה הם התאספו על. צעד electrodeposition 1, מתרחש באמצעות הרכבה עצמית מופעלות של אלגינט, biopolymers ו chitosan במחקרים שלנו, בתגובה לאות חשמלי. כפי שצוין קודם לכן שיפוע pH מופק אשר יכול להיות נשלט על ידי צפיפות זרם וזמן בתצהיר, מתן שליטה נוספת על הממדים הסרט ומאפיינים 6,17. מצאנו כי מגוון של צפיפות הנוכחית זמן שילובים בתצהיר יכול לשמש את האלקטרודות המצוין בלוח 1. תוך שימוש באלקטרודות אחרים אינו ריאלי, התאמות ההליך יהיה צורך. לעומת טכניקות אחרות, של יצירת הסרט תהליך של electrodeposiהנחה זו היא פשוטה, מהירה reagentless. אין צורך רפרטואר רחב של ציוד יקר ההכנות מייגע. חשוב לציין כי התהליך יכול לעמוד סטיות ניסויים קטנים וניתן לעבוד בקלות מעל במקרה של בעיה.
Chitosan הוא מסוגל להגיב שיפוע pH גבוה קתודית בשל תכונות פעילות חשובים המוקנות לו לפי תוכן גבוהה של אמינים ראשוניים. ב-pH גבוה (יותר מ pKa של ~ 6.3) אמינים הם deprotonated ו chitosan הופך מסיס, המאפשר יצירת הסרט. בעקבות בתצהיר, הסרטים יישאר מחובר האלקטרודה. עם זאת, היכולת קיימת delaminate אותם אם תרצה בכך. הסרטים תישאר יציבה כל עוד ה-pH של התמיסה לא לרדת מתחת pKa. פתרונות חומציים protonate את אמינים ואת repulsions אלקטרוסטטי הבאים להתנפח ג'ל עד שהוא נמס 18. כלומר, תהליך ההרכבה / פירוק הפיך לפי דרישה AlloWS להסרת הסרטים שהופקדו ושימוש חוזר של אלקטרודות. נוח, טווח ה-pH שבו המעבר סול ג'ל מתרחש קרוב לזה שבו מרכיבים ביולוגיים ביותר לתפקד בצורה אופטימלית. זה הופך את תהליך אידיאלי עבור השמירה של פונקציונליות במהלך הרכבת 6.
הסרט היווצרות אלגינט הוא הקל על ידי אלקטרוליזה של מים anodic כמו גם נוכחות של סידן פחמתי 7. PH נמוך מקומי על האנודה solubilizes סידן פחמתי המוביל את קטיוני סידן שחרור. יונים אלה לטיפולי קלאציה של אלגינט, להקים רשת crosslinked על פני האלקטרודה. סרטים אלגינט הוא הפיך בעיקר על ידי תחרות על יוני סידן מן אחרים תרכובות chelating כגון ציטרט או EDTA, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפזר את הסרטים, המאפשר שימוש חוזר של אלקטרודות היסוד. לכן, סרטים אלגינט שבירות יחסית, כאשר נתון בתנאים פיסיולוגיים כי יוני סידן הם בקלות שלcavenged של מטריקס ג'ל, להחליש את המבנה שלה וקידום הסרט delamination או redissolution. כדי להתגבר על מגבלה זו, יש לנו כלל צעד הדגירה של הסרט ב 1 M CaCl 2 לחזק את הג'ל. בנוסף, אנו ממליצים פתרון הדגירה של הסרט (מדיה נייד וכו ') להשלים עם CaCl 2 בריכוז מ"מ מיקרומטר-3 500.
ההליך העיקרי השני הוא functionalization של הסרט שהופקדו עם רכיבים ביולוגיים רלוונטיים. זו יכולה להיות מושגת בשתי דרכים, לצמידה הראשון הוא אלקטרו, אסטרטגיה המאפשרת הרכבה מהירה reagentless של חלבונים עם שליטה מרחבית יוצא דופן 10. עם זאת, functionalization באופן זה הוא מוגבל על ידי דיפוזיה של Cl – יונים באמצעות הסרט אל האלקטרודה, כמו גם את הפצת HOCl, תגובתי שנוצר ביניים, חזרה אל הפתרון. היכולת של מולקולות פעילות electrochemically לעבורדרך הסרט מאפשר התמרה של אותות כימיים ביולוגיים לתוך קל לקרוא אותות חשמליים 15. הראינו טירוסינאז בתיווך צימוד כאסטרטגיה 2 עבור functionalization האנזים chitosan, שמפגינים קוולנטית חיבור AI-2 synthase. אסטרטגיה זו מאפשרת תהליך functionalization להיות מבוקרת סלקטיבית – תלוי מגיב מסוים, טירוסינאז, הפועל discriminately על חלבונים המכילים תג טירוזין 9.
אנחנו מראים את התועלת ואת biocompatibility של הכתובת מרובה מערכות ידי שכפול מסלולים טבעיים על שבב. ראשית ארגנו שתי אוכלוסיות תאים (כלומר, "שולחים" ו "מקלטי") על כתובות שונות, והראה כי הם אינטראקציה בין האלקטרודות הסמוכות לספק AI-2 וליצור תגובה פלואורסצנטי. תפיסה זו יש גם הוכחה על ידי נג et al. ב 14 שבבים microfluidic. אנחנו גם חיקה את האינטראקציה, אבל במקום להשתמשאנזים לסנתז AI-2 עבור משלוח. בדרך זו, מסלול תאיים סינתטי, AI-2 סינתזה, חזר על עצמו דרך biofabrication ופעל ככל שזה יהיה פתרון.
בשני המקרים הרכבה של מספר כתובות מציג את האתגר של מניעת שאינו מחייב בין כתובות ספציפיות, כי כל פתרון חייב להיות מוצג בתצהיר למערך אלקטרודות כולו, למרות electrodeposition נועד רק לכתובת אחת. כביסה עדינה אך יסודית ניתן להסיר את רוב פתרון שיורית של מוטות שאינם אלקטרודות; השימוש זרימה בערוצים microfluidic עשוי לצמצם עוד יותר את הספציפיות לא. במיוחד biofabrication הסמוך chitosan וכתובות אלגינט, מומלץ להפקיד את הסרט chitosan 1, בעקבות זאת בצעדים biofunctionalization, ואחרי זה, electrodepositing אלגינט. למרות שלא עשינו אז הנה, מצאנו כי חסימת הסרט chitosan עם חלבונים אינרטי (כגון MILK, BSA, וכו ') מפחיתה באופן משמעותי שאינם ספציפיים מחייב של מולקולות לא רצויות לפני השטח aminated של chitosan.
מצאנו כלי עזר בהקמת אלקטרודות בדוגמת, לעתים קרובות למצוא מכשירים BioMEMS, בשם "תוכניות" של הסדר מורכב של תאים ביומולקולות. השימושים של electrodeposited chitosan ב BioMEMS התקנים יכול ללכת הרבה מעבר הדוגמאות שהוזכרו כאן 19. Chitosan יכול להיות מופקד על הגיאומטריות microscale שונים – כגון microchannels ועל משטחים לא מישוריים 20,15. הסרטים יכולים להיות גם שונה עם פולימרים אחרים וכן מגוון של חלבונים, דנ"א, חלקיקים, ו חמזור פעילים מולקולות של מאפייני הרומן 21,22,23. במכשירים BioMEMS, סרטים chitosan שימשו למשלוח סמים, גילוי מולקולה חמזור וקטנים, Biocatalysis, ומחקרים סלולריים 20,23,24,25. באופן דומה, אלגינט הוא בשימוש נרחב כמו מטריקס תאים מלכודת ו נחקר על בלימה fluidic הפיך שלאוכלוסיות תאים בתוך הסרט immunoanalysis 26,27,28. סרטים מורכבים עבור יישומים הנדסת רקמות כבר מפוברק באמצעות electrodeposition אלגינט, עם מרכיבים כמו עם hydroxyapatite עבור שתלים אורתופדיים 29.
בהפגנות שלנו biofabrication, הראינו גם את יחסי הגומלין בין מרכיבים ביולוגיים על פני ממשק ביו אלקטרונית לחול במידה שווה, זה מביא את האפשרות להגיע לשלב את כל סוגי אינטראקציות עבור ביצועים מתוחכמים של העברת אותות על השבב. בהתאם לכך, עשויה להקל על biofabrication ייצור של מכשירים עם "גדלים תכונה מינימום" צומצמו המשך ישיר על ההתפתחויות מהירים microfabrication, המונעים לעתים קרובות על ידי מוצרי האלקטרוניקה. כלומר, הבא של הדור הבא התקנים עלולה למעשה לכלול רכיבים ביולוגיים יציב המציעים הרכבה מופלאה של הטבע ויכולות זיהוי באריכות SCA קטן עוד יותרles מאשר מעשה ידי אדם מערכות. אנחנו מדמיינים לטווח הקרוב יישומים מכשור אנליטי, חיישנים סביבתיים, והתקנים מושתלת ביולוגית אפילו.
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים במימון DTRA לתמיכה של כתב היד הזה ומן ONR, DTRA, ו-NSF לתמיכה חלקית של המחקר הבסיסי.
Name of the component | Company | Catalogue number |
Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 |
Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D |
RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 |
Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | |
Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 |
Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 |
Slim Line 2″ Alligator Clips | RadioShack | 270-346 |
Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 |
SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer |
Fluorescecence stereomicroscope | Olympus | MVX10 MacroView |
cellSens Standard | Olympus | version 1.3 |
Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 |
Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR | BDH3030 |
Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR | VW3247 |
Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 |
Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles |
Speciality Minerals Inc. |
100-3630-3 |
Table 2. Chitosan and alginate solution reagents.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 |
Sodium Chloride, Certified ACS crystalline |
Fischer Scientific |
S271 |
Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 |
Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich |
P4417 |
Table 3. Other solution components and buffer reagents.
Name of the reagent | Company/Source | Catalogue number |
Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 |
Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 |
LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 |
“AI2-Synthase” (HGLPT) | Lab stock 16 | |
W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | |
MDAI2 + pCT6-lsrR–ampr + pET-dsRed–kanr cells | Lab stock 30 | |
FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 |
5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 |
DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Scientific | PI-53020 |
Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents.