Summary

Преодоление Био-Электронный интерфейс с Biofabrication

Published: June 06, 2012
doi:

Summary

В этой статье описывается biofabrication подход: осаждение стимулов проблематику полисахариды в присутствии предвзято электродов для создания биосовместимых фильмов, которые могут быть функциональными клетками или белками. Мы показываем, настольные стратегии для создания фильмов, а также их основных применений для создания интерактивных biofunctionalized поверхности для лабораторий-на-чипе приложений.

Abstract

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.

Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission.

Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.

Protocol

1. Альгинат Электроосаждение Подключите блок питания к пользовательским сфабриковано электродов через патч-корды использованием крокодил. Оксид индия и олова (ITO), покрытых стекло будет действовать в качестве анода (рабочий электрод) и платиновой фольги будет служить в качестве катода (контр-электрод). Расположите электроды таким образом, поверхность ITO быть функциональными против счетчик электрода и позиционируется как вертикально погружается в раствор или горизонтально, что отложение решения, содержащиеся на поверхности. Подготовить решение альгинат осаждения путем смешивания 1% альгината и 0,5% CaCO 3 (по весу) в дистиллированной воде, а затем автоклавирования решения. Рекомендуется постоянно перемешивать раствор, когда он не используется. Погрузитесь в обоих электродах осаждения раствора. Альгинат может быть использован флуоресцентно меченные флуоросфер (Invitrogen), в соответствии с Cheng и соавт. 14, для обеспечения fluorescenсе визуализации полученной пленки. Применение постоянного тока (3 / м 2) в течение 2 минут, напряжение перейдет в пределах 2-3 В. Отсоедините электроды и удалить без хранение решение. Аккуратно промойте пленку с NaCl (0,145 м), чтобы удалить лишние альгината. Инкубируйте фильме кратко (~ 1 мин) в CaCl 2 (0,1 М) в целях укрепления геля. Полоскание с NaCl (0,145 М) и инкубировать в искомое решение дополнить CaCl 2 (1 мм). Изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 1б). 2. Соосаждения Общение клеточных популяций альгинат Сигнал отправителя культуре клеток (W3110 вес E.coli), выращенных в LB средствах массовой информации, и сигнал приемника культуре клеток (MDAI2 + pCT6-LSRR – усилитель г + ПЭТ-DsRed – кан г), выращенных в средствах массовой информации LB + 50 мкг / мл каждого из канамицин и ампициллин, должны быть выращены на ночья повторно привиты для роста оптической плотности (600 нм) 1. Настройка оптической плотности культуры клеток приемника 0,4-0,6 с LB перед использованием. Подготовить осаждения 2% раствора альгината и 1% CaCO 3, и смешать с каждой культуре клеток в соотношении 1:1 до конечной концентрации 1% альгината, 0,5% CaCO 3, с клетками разводят до плотности около половины культивирования плотность. Используйте стекло с узором двумя электродами ITO содержится полидиметилсилоксана (PDMS) и (подготовлен в соответствии с инструкциями Sylgard и сократить до нужного размера) и платиновый электрод счетчика. Подключите один ITO электродов к источнику питания с платиной, как описано в процедуре 1 (альгинат электроосаждения). Погрузите электроды в осаждения раствора, содержащего приемник клеток. Установите блок питания постоянного тока при плотности 3 / м 2, где размер площади определяется один электрод, на котором depositioя не произойдет. Применить текущие в течение 2 минут, чтобы обеспечить соосаждения клеток в матрице альгината. Промойте фильм, как описано в шаге 1.5. Включите анодной связи на второй, соседний, ITO электродов. Повторите процедуру отложения (шаги 2.4 – 2.7), но на этот раз введение раствора, содержащего отправителя клеток. Инкубировать 2-электрод чип содержащие codeposited клеток и кальция альгинат ночи при 37 ° C в фосфатном буферном растворе (PBS) с добавлением 10% LB СМИ и 1 мМ CaCl 2. После инкубации изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 2В). 3. Хитозан Электроосаждение Подключите блок питания к электродам через крокодил. Золото покрытием кремниевый чип будет выступать в качестве катода (рабочий электрод) и платиновой фольги будет служить в качестве анода (контр-электрод). Установите поверхности золотого электрода, таким йна него против счетчик электрода и как расположены вертикально, чтобы быть погружают в раствор или горизонтально, что отложение решения, содержащиеся на поверхности. Приготовьте раствор хитозана путем смешивания хитозана хлопья в воду и медленно добавляя 2 М HCl для растворения полисахаридов (окончательное рН 5,6), убедившись, что следовать процедуре, описанной Мейером и соавт. 15. Установите электроды в раствор хитозана (0,8%), полностью погружая нужную область для нанесения. Хитозан используемых можно флуоресцентно меченных с 5 – (а-6)-carboxyrhodamine 6G сукцинимидил эфира (Invitrogen), а на Ву и др. 8, изображение электроосажденных фильм флуоресцентной микроскопии.. Применение постоянного тока (4 / м 2) в течение 2 минут. Напряжение будет смещаться в пределах 2-3 В. Расчет плотности тока в зависимости от золотой поверхности рабочего электрода подвергаются depositioл раствора. Промойте электрод деионизированной водой, чтобы удалить лишние хитозана. Чип может быть сохранен в воде или PBS (10 мМ, рН 7,0). Изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 3). 4. Электрохимический трансдукция с функционализированных фильм Хитозан Codeposit хитозана и глюкозооксидазы (GOX) из раствора (1% хитозана, 680 ед / мл GOX, рН 5,6) при плотности тока 4 А / м 2 на узорной электрода в соответствии с процедурой 3 (Хитозан электроосаждения). Фильм хитозана в ловушке GOX будет. Прикрепите лечение электрода трех электродной системы в качестве рабочего электрода, платиновой проволоки в качестве контр-электрода и Ag / AgCl в качестве электрода, как показано на рис 4А. Погрузите электроды в раствор фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0), содержащем NaCl (0,1 М). Электрохимически сопряженных белка хитозанаФильм, применяя постоянное напряжение (0,9 В) для использования 60-х годов chronoamperometry 10. Поместите фишки в фосфатный буфер (0,1 М, рН 7,0), а также мыть в течение 10 минут на орбитальный шейкер для удаления непрореагировавшего NaCl и неконъюгированного GOX. Повторно приложить к трех-электродной системы, как описано в пункте 4.2 и погружают в раствор 5 мМ глюкозы. Использование циклической вольтамперометрии, подметать потенциала в положительном направлении до 0,7 В. Использование контроль фильм, не содержащий глюкозооксидазы для сравнения на сумму окисления видно развертки (рис. 4В). Удалите электроды из раствора глюкозы и промыть фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0), а затем поместить электроды в 10 мл стакан, содержащий 8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0). Смещение GOX-функциональными чипа до 0,6 V в качестве рабочего электрода (рис. 4С). Добавить порции глюкозы в буфер (каждую аликвоту повышает концентрацию глюкозы на4 мм). Создание стандартной кривой между устойчивым состоянием и концентрации глюкозы в GOX-функциональными фильм хитозана. 5. Белки Функционализация помощью ферментативного Ассамблеи Используйте стекло с узором золота и смежных ITO электродов, содержащихся в так PDMS. Смещение золотого электрода с катодным потенциалом электролитическое хитозана как было показано ранее. Промыть фильма кратко DI водой, а затем PBS помощью пипетки. Добавить раствор 3 мкм синий флуоресцентно с надписью "АИ-2-синтазы" 16 (с использованием DyLight комплект этикеток) + 100 ЕД / мл тирозиназы в PBS. Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре, затем смыть пленку с PBS. Применить анодного потенциала на электрод ITO в codeposit решение альгинат осаждения содержащие приемник клеток (подготовленный с шагом 2.1-2.2). Выполните шаги 2.3-2.6 процедуры 2 (соосаждения клеточных популяций в альгинат). Для созданияпередаваемого сигнала (АИ-2) ферментативно после промывки фильмы добавить раствор 500 мкМ S-аденозил гомоцистеина (САК) в PBS, с добавлением 10% LB СМИ и 1 мМ CaCl 2. Накройте электроды для предотвращения испарения раствора и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° C. Это позволит клеточного ответа приемник, создавая красный флуоресцентный белок (DsRed). Прилегающие электроды могут быть отображены с флуоресцентной микроскопии, настраивая фильтры, чтобы захватить голубой флуоресценции АИ-2-синтазы и красной флуоресценции выраженные codeposited приемник клеток (рис. 5В). 6. Представитель Результаты Налагаемого электрических сигналов могут создавать локализованные микросреды (например, полей и градиентов) вблизи поверхности электрода, и эти стимулы могут вызвать самосборки полисахариды, такие как альгината и хитозана внести в гидрогель пленки на поверхности электрода. Поскольку тего золь-гель-переход происходит на поверхности электрода, в результате фильм electroaddressed, с его геометрией соответствующий шаблон электрод (рис. 1В, 3C). Биосовместимых таких фильмах, как альгината и хитозана обеспечивают поверхностей, которые могут быть функциональными с биологическими компонентами. Использование альгината, уникальные клеточные популяции были codeposited на отдельных адресов. Доказательства их electroaddressment наблюдается при взаимодействии между отправителем и приемником населения клетке. Молекула аутоиндуктор-2 (АИ-2) диффундирует от отправителя клеток и поглощается приемником клеток, что приводит к выражению DsRed красный флуоресцентный белок (рис. 2A). На рисунке 2B, красная флуоресценция наблюдается только на электроде, где приемники рассматриваются. Аминогрупп хитозана присутствует на обеспечить ее рН реакции, необходимые для электроосаждения, а также поверхность, подходящую для функционализации. Мыиспользовать эти уникальные свойства электрохимически сопряжения биодатчиков фермента глюкозо-оксидаза (GOX) для электролитического хитозана фильмов. Этот фермент затем предоставляет возможность для определения глюкозы через ферментативной реакции (рис. 4а) производит пероксид водорода, который затем может быть электрохимически окисляется до получения выходного тока. Таким образом, химический сигнал может быть трансдуцированных к электрическим. Рисунок 4B показывает, что фильмы, в которых GOX было электрохимически сопряженные производства анодной сильный сигнал в присутствии глюкозы в отличие от тех фильмов, не содержащих GOX. Эти результаты показывают, GOX могут быть собраны на хранение фильм хитозана и сохраняет каталитическую активность. Кроме того, рисунок 4C показывает, шаг увеличения анодного тока, в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови. Калибровочной кривой также присутствует на рисунке 4C показывает, что шаг увеличения проходили в ближайшее линейного ФАСХион зависит от количества глюкозы добавил. Эти результаты показывают, что фермент также сохраняет свою чувствительность к повышению концентрации глюкозы на сопряжении к фильму хитозана. Нижний предел обнаружения не изучалось здесь, как это ранее было характерно для этой системы в работе Мейера и др.. др.. Мы также продемонстрировали ковалентной иммобилизации ферментов интерес, спроектирован, чтобы содержать пользовательские пента-тирозин тег, чтобы хитозана в ферментативно-контролем. В частности, этот процесс при посредничестве фермента тирозиназы. Как показано на схеме на рис 5А (верхний), фермент, АИ-2-синтазы включает пяти-тирозин тегов. Тирозиназа действует на тирозин тег, окисляющие фенольные группы остатков "О-хинонов, которые затем ковалентно связываться с аминами хитозана в. Свидетельство хитозана фильм функционализации с АИ-2-синтазы тирозиназой сборки наблюдается на рис 5B </stРонг>, где АИ-2-синтазы был флуоресцентно меченных синий. Потому что АИ-2-синтазы генерирует АИ-2 от субстрата S-аденозил гомоцистеина (САК) точно так же, как отправитель клетки, ее близость к codeposited приемник клеток в присутствии САК также вызывает приемник клетки флуоресцентно реагировать, выражая DsRed (рис. 5А (ниже)). Красная флуоресценция приемник клеток (рис. 5В) в очередной раз демонстрирует взаимодействие между адресами в связи с распространением АИ-2 с одного на другой, и далее указывает, что ферменты, иммобилизованные на хитозана сохраняют активность раз ковалентно связаны. Рисунок 1. Альгинат электроосаждения. (А) механизм электроосаждения альгината: как электрод анодно предвзятым, электролиз воды происходит на ее поверхности, создавая локализованные низкий рН. Частиц карбоната кальция реагирует с избыткомпротонов, выпустив катионов кальция, как частицы растворяются. При наличии цепи полимера альгинат, ионы в хелатной "eggbox" сеть, образуя сшитый гидрогель на электроде. По мере удаления от электрода увеличивается, альгинат имеет большую тенденцию оставаться в растворе за счет снижения присутствии ионов кальция. (B) L-формы рисунком ITO электродов была использована для электролитическое альгината. PDMS и был зафиксирован на электрод содержит зеленый флуоресцентно-меченных альгината (1%) и CaCO 3 (0,5%) осаждения раствора. После электроосаждения в течение 2 мин. при плотности тока 3А / м 2, electroaddressed гидрогель альгинат удалось сфотографировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Рисунок 2. Соосаждения клеточных популяций. (А) Схема показывает взаимодействие между двумя E. палочки штамма: один население производит аутоиндуктор-2 (АИ-2), Сигнальную молекулу, и называется "АИ-2 отправителя". Остальным населением, называют "АИ-2 приемника", корреспондент АИ-2, после получения АИ-2 за счет диффузии из отправителя, она выражает красный флуоресцентный белок DsRed. (Б) красный флуоресценции изображение пары электродов с АИ-2 Отправитель населения codeposited с альгинат на левом электроде и АИ-2 приемника населения codeposited с альгинат на правом электроде. Увеличенный вид демонстрирует DsRed выражение только АИ-2 приемника. Рисунок 3. Хитозан электроосаждения. (А) Схема показывает зависит от рН электроосаждения хитозана. Электролиз воды в катодной предвзято электрода приводит к локализованным высоких значениях рН (показано локализованное изменение цвета красителя рН индикатор вблизи катода в микрофотография), который стимулирует золь-гель перехода хитозана в этом регионе. (B) амины представить на хитозана дают рН проблематику свойствами. Над рН 6.3 (рКа хитозана) амины депротонированного, способствуя переходу от его протонированных растворимой формы в нерастворимую форму ее гелем. (C) узорной золотой электрод был использован для электролитическое хитозана. Электрод, соединенный с катодной питания, была погружена в зеленый флуоресцентно-меченого хитозана (0,8%) осаждения раствора. После электроосаждения в течение 2 мин. при плотности тока 4 А / м 2, electroaddressed фильм хитозана удалось сфотографировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Рисунок 4. Электрохимический трансдукции с функциональными фильм хитозана. (А) Схематическое изображение установка из трех электродной системы. Функционализированных фильм хитозана служит в качестве рабочего электрода, платиновой проволоки, как счетчик электрода и Ag / AgCl в качестве электрода сравнения. Электрохимический трансдукции глюкозы проходит через йэлектронной ферментативных и электрохимических реакций показал, где производится перекись водорода может окисляться и обнаружил на рабочем электроде. (B) Циклические voltammagram (CV) на электрод с фильмом хитозана содержащие электрохимически сопряженных глюкозооксидазы (GOX) показывает сильный анодного сигнала в 5 мМ раствора глюкозы. Фильм, не содержащих GOX служила контролем и не проявляли сигнал в том же растворе. (C) между стандартной кривой анодного тока и концентрации глюкозы выводится почти линейная зависимость (каждую аликвоту увеличить концентрацию глюкозы на 4 мм, а также увеличение амплитуды тока на вставке в графе поэтапно). Рисунок 5. Белки функционализации использованием ферментативных сборки. (А, верхние) Схема показывает тирозин-тегом "АИ-2-синтазы" быть ковалентно привязанными к фильму хитозана сборки тирозиназы. Тирозину стали оксидized О-хинонов тирозиназой действия и может реагировать с аминогруппами на пленке хитозана, образуя ковалентную связь. (A, ниже) АИ-2-синтазы генерирует АИ-2 с подложкой (САК), приемник клетки сообщают созданные АИ-2, DsRed флуоресценции выражения. (B) Флуоресцентные изображения, показывающие фильм хитозана на золото, функциональными с голубой этикеткой АИ-2-синтазы. Смежно, АИ-2 клеток приемника codeposited с альгинат на ИТО. После добавления субстрата ферментативной к колодцу и инкубации, АИ-2 клеток приемник выражают DsRed.

Discussion

Наши процедуры демонстрируют электроосаждения и функционализации биополимер фильмов, и этот процесс мы называем biofabrication. Через функционализации с клетки и биомолекул мы создаем биологических поверхностях, способных взаимодействовать друг с другом и электродом, к которому они собираются на. Первый шаг, электроосаждение, происходит через вызвало самоорганизации биополимеров, альгината и хитозана в наших исследованиях, в ответ на электрический сигнал. Как уже говорилось ранее градиент рН создается которой можно управлять с помощью плотности тока осаждения и времени, обеспечивая дополнительный контроль за фильм размеры и свойства 6,17. Мы обнаружили, что различные плотности тока и времени осаждения комбинации могут быть использованы для электродов, указанных в таблице 1. При использовании других электродов возможно, изменения в процедуру будет необходимо. По сравнению с другими методами образования пленки в процессе electrodeposiТион простой, быстрый и безреагентной. Существует нет необходимости в обширный репертуар дорогостоящего оборудования и кропотливая подготовка. Важно отметить, что этот процесс может выдерживать незначительные отклонения экспериментальных и может быть легко началась более в случае возникновения проблем.

Хитозан способна реагировать на высоком катодной градиент рН в связи с важными функциональными свойствами присвоил ему высокое содержание первичных аминов. При высоком рН (больше, чем его рКа ~ 6.3) амины депротонированного и хитозан становится нерастворимым, что позволяет пленки. После осаждения, фильмы будут оставаться прикрепленной к электроду. Тем не менее, существует возможность расслаиваться их желанию. Фильмы будут оставаться стабильными до тех пор, как рН раствора не опускается ниже рКа. Кислотные растворы протонировать аминов и последующего электростатического отталкивания набухают гель до полного его растворения 18. То есть, сборка / разборка процесс является обратимым по требованию и аллоWS для удаления пленок и повторное использование электродов. Удобно, рН, при которой золь-гель-переход происходит близка к той, в которой большинство биологических компонентов функционировать оптимально. Это делает процесс идеально подходит для сохранения функциональности во время сборки 6.

Формирование альгинат фильм способствует анодного электролиза воды, а также наличие карбоната кальция 7. Локализованных низким рН на аноде растворяется карбонат кальция приводит к катионов кальция релизе. Эти ионы в хелатной форме альгинат, образуя сшитые сети на поверхности электрода. Альгинат фильмов заметно обратимой конкуренции для ионов кальция из других соединений, хелатирующих, такие как цитрат или EDTA, который может быть использован для растворения пленок, позволяет повторное использование основных электродов. Таким образом, альгинат фильмов относительно хрупким при воздействии на физиологические условия, потому что ионы кальция легко сcavenged из геля матрицу, ослабляя его структуру и развитие фильм отслоения или повторное растворение. Чтобы преодолеть это ограничение, мы включили инкубации для фильма в 1 М CaCl 2 для укрепления геля. Кроме того, мы рекомендуем инкубации решение фильма (ячейка СМИ и т.д.) дополнить CaCl 2 в концентрации 500 мкМ, 3 мм.

Вторая основная процедура функционализации осажденной пленки с соответствующими биологическими компонентами. Это может быть достигнуто двумя способами, первый из которых электрохимического сопряжения, стратегия, которая позволяет быстро, безреагентной сборки белков с исключительным пространственным управления 10. Тем не менее, функционализации таким образом, ограничивается распространение Cl ионов через пленку к электроду, а также распространение HOCl, созданных реактивных промежуточных обратно в раствор. Способность электрохимически активных молекул пройтичерез пленку позволяет трансдукции химических и биологических сигналов в легкой для чтения электрических сигналов 15. Мы показали, тирозиназы-опосредованной связи в качестве второй стратегии фермент функционализации в хитозан, свидетельствует ковалентного присоединения АИ-2-синтазы. Такая стратегия позволяет функционализации, чтобы процесс был контролируемым и селективные – в зависимости от конкретного реагента, тирозиназы, который действует избирательно на белки, содержащие тирозин теги 9.

Мы покажем, полезность и биосовместимость многоадресной систем репликации природных путей на чипе. Сначала мы организовали две клеточные популяции (например, "отправителей" и "приемников") в различные адреса, и показал, что они взаимодействуют между соседними электродами доставить АИ-2 и создания флуоресценции ответ. Эта концепция также была продемонстрирована Cheng и соавт. в микрожидком 14 чипов. Мы также имитировал взаимодействия, но вместо этого использоватьфермента синтеза АИ-2 для доставки. Таким образом, синтетические внутриклеточные пути, АИ-2 синтеза, была воспроизведена через biofabrication и действовал, сколько это будет в растворе.

В обоих случаях, сборка нескольких адресов представляет задача предотвращения неспецифического связывания между адресами, потому что каждое отложение решения должны быть внесены в весь массив электродов, хотя электроосаждения предназначена только по одному адресу. Нежные еще тщательной промывки можно удалить большинство остаточных решение от не-предвзятым электродов, использование потоков в микрофлюидных каналов может также свести к минимуму не-специфичность. В частности, для соседней biofabrication хитозана и альгината адресов, мы рекомендуем сдачи фильма хитозана во-первых, после этого с biofunctionalization шаги, и после этого гальванопокрытию альгината. Хотя мы еще не сделали этого здесь, мы обнаружили, что блокирование фильм хитозана с инертными белками (например, милк, BSA, и т.д.) значительно снижает неспецифического связывания нежелательных молекул аминированию поверхности хитозана в.

Мы нашли утилиту в создании узорной электродов, часто встречается в устройствах bioMEMS, как к «проекту» для комплекса расположение клеток и биомолекул. Использования хитозана в электроосажденных bioMEMS устройств выходит далеко за рамки примеры, приведенные здесь 19. Хитозан может быть нанесен на различные микромасштабной геометрии – например, в микроканалов и на не плоских поверхностей 20,15. Фильмы также могут быть изменены с другими полимерами и разнообразные белки, ДНК, наночастицы, и редокс-активных молекул на новые свойства 21,22,23. В устройствах bioMEMS, хитозан фильмов были использованы для доставки лекарств, окислительно-восстановительные и малые молекулы обнаружения, биокатализа и клеточной исследования 20,23,24,25. Кроме того, альгинат широко используется в качестве клеточного захвата и матрица была изучена для обратимых жидкостный сдерживанияклеточных популяций и в фильме иммуноанализа 26,27,28. Композитные пленки для применения тканевой инженерии были изготовлены на основе альгината электроосаждения с компонентами, такими как гидроксиапатит для ортопедических имплантатов 29.

В нашей демонстрации biofabrication, мы показали, как взаимодействие между биологическими компонентами и всей биологической электронный интерфейс, в равной степени применимо, это ставит под достичь перспективы интеграции всех разновидностей взаимодействия для работы в сложных на-чипе передачи сигнала. Соответственно, biofabrication может способствовать производству устройств с пониженным "минимальных размеров функцию" как прямое последующих на быстрое развитие микротехнологий, как это часто мотивировано потребительской электроники. То есть, рядом устройств следующего поколения может на самом деле включают лабильных биологических компонентов, которые предлагают изысканное собрание природы и признание возможности на еще меньшую длину SCAле, чем техногенных систем. Мы предполагаем, ближайшее применение в аналитической аппаратуры, экологических датчиков, и даже биосовместимых имплантируемых устройств.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем, финансирование из DTRA для поддержки этой рукописи и с ОНР, DTRA и NSF для частичной поддержке базовых исследований.

Materials

Name of the component Company Catalogue number
Power Supply Keithley SourceMeter 2400
Three electrode potentiostat CH Instruments Potentiostat/Galvanostat 600D
RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector BASi MF-2052
Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation custom fabricated  
Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist Sigma-Aldrich 578274
Platinum sheet/foil (0.002 in) Surepure Chemetals 1897
Slim Line 2″ Alligator Clips RadioShack 270-346
Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord TSElectronic B-36-02
B-24-02
SYLGARD 184 silicone elastomer kit Dow Corning NC9020938
From Fischer
Fluorescecence stereomicroscope Olympus MVX10 MacroView
cellSens Standard Olympus version 1.3

Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment.

Name of the reagent Company Catalogue number
Chitosan, medium molecular weight Sigma-Aldrich 448877
Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade VWR BDH3030
Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N VWR VW3247
Alginic acid, sodium salt Sigma-Aldrich 180947
Multifex-MM Precipitated
Calcium Carbonate, 70nm particles
Speciality
Minerals Inc.
100-3630-3

Table 2. Chitosan and alginate solution reagents.

Name of the reagent Company Catalogue number
Calcium chloride, dihydrate J.T. Baker 0504
Sodium Chloride, Certified
ACS crystalline
Fischer
Scientific
S271
Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous Sigma-Aldrich P9791
Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous Sigma- Aldrich P3786
Phosphate Buffered Saline Sigma-
Aldrich
P4417

Table 3. Other solution components and buffer reagents.

Name of the reagent Company/Source Catalogue number
Glucose oxidase from aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Tyrosinase from mushroom Sigma-Aldrich T3824
LB broth, Miller (granulated) Fischer Scientific BP9723-2
“AI2-Synthase” (HGLPT) Lab stock 16  
W3110 wildtype cells Lab stock 30  
MDAI2 + pCT6-lsrRampr + pET-dsRedkanr cells Lab stock 30  
FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 Invitrogen F8765
5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 Invitrogen C-6157
DyLight antibody labeling kit, 405 Thermo Scientific PI-53020

Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents.

References

  1. Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
  2. Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
  3. Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
  4. Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
  5. Yang, X., Shi, X. -. W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
  6. Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
  7. Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
  8. Wu, L. -. Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
  9. Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
  10. Shi, X. -. W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
  11. Shi, X. -. W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
  12. de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
  13. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
  14. Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
  15. Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
  16. Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -. C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
  17. Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
  18. Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, 61-71 (2011).
  19. Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  20. Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
  21. Spinks, G. M. A novel “dual mode” actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
  22. Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
  23. Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
  24. Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
  25. Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
  26. Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
  27. Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
  28. Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
  29. Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
  30. Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).

Play Video

Cite This Article
Gordonov, T., Liba, B., Terrell, J. L., Cheng, Y., Luo, X., Payne, G. F., Bentley, W. E. Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication. J. Vis. Exp. (64), e4231, doi:10.3791/4231 (2012).

View Video