Denna artikel beskriver en biofabrication tillvägagångssätt: deposition av stimuli-responsiva polysackarider i närvaro av partiska elektroder för att skapa biokompatibla filmer som kan vara funktionaliserad med celler eller proteiner. Vi visar en bänkbaserade strategi för generering av filmerna liksom deras grundläggande användning för att skapa interaktiva biofunctionalized ytor för lab-on-a-chip applikationer.
Framsteg i lab-on-a-chip-teknik lovar att revolutionera både forskning och medicin genom lägre kostnader, bättre känslighet, bärbarhet och högre genomströmning. Införlivandet av biologiska komponenter på biologiska mikroelektromekaniska system (bioMEMS) har visat stor potential för att uppnå dessa mål. Mikrofabricerade elektroniska chips möjliggöra mikrometer skala funktioner samt en elektrisk förbindelse för avkänning och aktivering. Funktionella biologiska komponenter ger systemet förmågan att specifikt påvisande av analyter, enzymatiska funktioner och helcell-förmåga. Standard mikrofabrikationslaboratorier processer och bio-analytiska tekniker har framgångsrikt använts för årtionden i datorn och biologiska industrier, respektive. Deras kombination och gränssnitt i en lab-on-a-chip miljö, dock frambringar nya utmaningar. Det är en uppmaning till tekniker som kan bygga ett gränssnitt mellan elektroden och biologiska komponenter tillent som är mild och är lätt att tillverka och mönster.
Biofabrication, beskrivs här, är en sådan metod som har visat mycket lovande för sin enkla att montera inkorporering av biologiska komponenter med mångsidighet i en On-chip funktioner som är aktiverade. Biofabrication använder biologiska material och biologiska mekanismer (självorganisering, enzymatisk montering) för bottom-up hierarkisk montering. Medan våra laboratorier har visat dessa begrepp i många format 1,2,3, här visar vi monteringen baserad på elektroutfällning följt av flera tillämpningar av signal-baserade interaktioner. Monteringsprocessen består av elektroavsättning av biokompatibla stimulerbara polymerfilmer på elektroder och deras efterföljande funktionalisering med biologiska komponenter, såsom DNA, enzymer, eller levande celler minst 4,5. Elektroavsättning drar fördel av det pH-gradient skapas vid ytan av en förspänd elektrod från elektrolysenvatten 6,7,. Kitosan och alginat är stimulerbara biologiska polymerer som kan utlösas för att själv montera in hydrogelfilmer som svar på ansatta elektriska signaler 8. Tjockleken av dessa hydrogeler bestäms av den utsträckning i vilken pH-gradient sträcker sig från elektroden. Detta kan ändras med hjälp av olika strömtäthet och tider nedfall 6,7. Detta protokoll kommer att beskriva hur chitosan filmer deponeras och funktionaliseras genom kovalent fästa biologiska komponenter till rikliga primära amin som är närvarande på filmen antingen genom enzymatiska eller elektrokemiska metoder 9,10. Alginat filmer och deras brottsprovokation av levande celler kommer också att behandlas 11. Slutligen är användningen av biofabrication visas genom exempel på signalen baserad interaktion, inklusive kemisk-till-elektrisk-, cell-till-cell, och även enzym-till-cell-signalöverföring.
Både elektroavsättningoch funktionalisering kan utföras under nästan fysiologiska betingelser utan behov av reagensen och sålunda spara labila biologiska komponenter från hårda betingelser. Dessutom har både kitosan och alginat länge använts för biologiskt relevanta ändamål 12,13. Totalt sett kan biofabrication, en snabb teknik som kan enkelt utföras på en bänk, användas för att skapa mönster mikroskala av funktionella biologiska komponenter på elektroderna och kan användas för en mängd olika lab-on-en-chip-applikationer.
Våra rutiner visar galvanisk och funktionalisering av biopolymerfilmer, en process vi benämner biofabrication. Genom funktionalisering med celler och biomolekyler skapar vi biologiska ytor med förmåga att interagera med varandra och elektroden adress de är monterade på. Det första steget, elektrodeposition, äger rum genom den triggade självsammansättning av biopolymerer, alginat och kitosan i våra studier, som svar på en elektrisk signal. Såsom angivits tidigare en pH-gradient genereras som kan styras av strömtätheten och avsättningstid, vilket ger ytterligare kontroll över filmen dimensioner och egenskaper 6,17. Vi har funnit att en mängd olika strömtäthet och nedfall kombinationer tid kan användas för elektroderna som anges i tabell 1. Även användning av andra elektroder är genomförbart, skulle justeringar av förfarandet vara nödvändig. Jämfört med andra tekniker för filmbildning processen för electrodeposiEkvationen är enkel, snabb och reagentless. Det finns inget behov av en bred repertoar av dyrbar utrustning och mödosamma beredningar. Viktigt kan processen tål mindre experimentella avvikelser och kan lätt startas över om ett problem uppstår.
Chitosan är kapabel att svara på ett högt katodiskt pH-gradient på grund av viktiga funktionella egenskaper som tilldelas den genom en hög halt av primära aminer. Vid högt pH (högre än dess pKa ~ 6,3) aminerna deprotoneras och kitosan blir olösligt, vilket möjliggör för filmbildning. Efter avsättning kommer filmerna förblir fäst vid elektroden. Emellertid finns det möjlighet att delaminera dem om så önskas. Filmerna kommer att förbli stabil så länge som pH för lösningen ej faller under pKa. Sura lösningar protonera aminerna och de följande elektrostatiska repulsioner svälla gelén tills den upplöses 18. Det vill säga, är montering / demontering processen reversibel på efterfrågan och allows för att avlägsna de deponerade filmer och återanvändning av elektroder. Lämpligen är pH-område vid vilket den sol-gel-övergång sker nära den vid vilken de flesta biologiska komponenter fungera optimalt. Detta gör processen idealisk för lagring av funktionaliteten under monteringen 6.
Alginat filmbildning underlättas av den anodiska elektrolys av vatten såväl som närvaron av kalcium-karbonat 7. Den lokala lågt pH vid anoden solubiliserar kalciumkarbonat som leder till katjoner frigörande kalcium. Dessa joner är kelaterad genom alginat, bildar ett tvärbundet nätverk på elektrodytan. Alginat filmer är särskilt reversibla genom konkurrens om kalciumjoner från andra kelatbildande föreningar såsom citrat eller EDTA, som kan användas för att lösa filmer, som möjliggör återanvändning av de underliggande elektroderna. Således, alginat filmer är relativt sköra när de utsätts för fysiologiska förhållanden eftersom kalciumjoner är lätt scavenged från gelmatrisen, försvaga dess struktur och främja film delaminering eller återupplösning. För att övervinna denna begränsning, har vi en inkubationssteg för filmen i 1 M CaCl2 för att förstärka gelén. Dessutom rekommenderas att filmens inkubation lösning (cellmediet etc.) kompletteras med CaCl2 vid en koncentration av 500 pM-3 mM.
Den andra stora förfarandet är funktionalisering av den avsatta filmen med relevanta biologiska komponenter. Detta kan uppnås på två sätt, det första är elektrokemiska konjugation, en strategi som möjliggör snabb, reagentless montering av proteiner med exceptionell spatial kontroll 10. Emellertid är funktionalisering på detta sätt begränsas genom diffusion av Cl – joner genom filmen till elektroden samt diffusion av HOCl, den alstrade reaktiva mellanprodukten, tillbaka ut i lösningen. Förmågan hos elektrokemiskt aktiva molekyler att passeragenom filmen tillåter för transduktion av biologiska och kemiska signaler till lätta att läsa elektriska signaler 15. Vi har visat tyrosinas-medierad koppling som en andra strategi för enzymet funktionalisering till kitosan, framgår av kovalent fästa AI-2-syntas. Denna strategi gör det möjligt för funktionalisering processen som skall styras och selektiv – beroende på en specifik reagens, tyrosinas, vilket verkar discriminately på proteiner som innehåller en tyrosin etiketten 9.
Vi visa användbarheten och biokompatibiliteten för flera Högtalaranläggningar genom att replikera naturliga vägar på ett chip. Först ordnade vi två cellpopulationer (dvs "avsändare" och "mottagare") på olika adresser, och visade att de samverkade över angränsande elektroder för att leverera AI-2 och generera en fluorescens svar. Detta koncept har också visats av Cheng et al. i en mikrofluidisk chip 14. Vi härmade också interaktionen, utan användsett enzym för att syntetisera AI-2 för leverans. På detta sätt fick en syntetisk intracellulär väg, AI-2-syntes, replikerade genom biofabrication och fungerade mycket som det skulle i lösning.
I båda fallen uppvisar sammansättning av flera adresser utmaningen att undvika icke-specifik bindning mellan adresser, eftersom varje beläggningslösning måste införas på hela elektrodgruppen, även om elektrodeposition är endast avsedd vid en adress. Mild men ändå noggrann tvättning kan avlägsna huvuddelen av kvarvarande lösningen från icke-förspända elektroder; användning av flödet i mikrofluidiska kanaler kan vidare minimera icke-specificitet. Synnerhet för den intilliggande biofabrication av kitosan och adresser alginat, rekommenderar vi avsättning av det kitosan filmen först efter detta med biofunctionalization steg, och efter detta, elektrolytisk alginat. Även om vi inte har gjort så här, har vi funnit att blockera kitosanfilm med inerta proteiner (t.ex. milk, BSA, etc) minskar i hög grad icke-specifik bindning av oönskade molekyler till kitosan s aminerad yta.
Vi har funnit användbarhet vid upprättandet mönstrade elektroder, som ofta återfinnes i bioMEMS anordningar, såsom de "ritningar" för ett komplext arrangemang av celler och biomolekyler. Användningen av elektrodeponerade chitosan i bioMEMS enheter kan gå långt utöver de exempel som nämns här 19. Kitosan kan avsättas på olika geometrier mikroskala – såsom i mikrokanaler och på icke plana ytor 20,15. Filmerna kan även modifieras med andra polymerer och olika proteiner, DNA, nanopartiklar och redox-aktiva molekyler för nya egenskaper 21,22,23. I bioMEMS anordningar har kitosan filmer har använts för avgivning av läkemedel, redox-och små-molekyl detektering, biokatalys, och studier cell 20,23,24,25. På liknande sätt är alginat används allmänt som en cell-infångning matrisen och har undersökts för reversibel fluidisk inneslutning avcellpopulationer och i film immunoanalysis 26,27,28. Kompositfilmer för tillämpningar vävnadsutvecklingssteg har tillverkats med användning av alginat elektroavsättning, med komponenter såsom med hydroxiapatit för ortopediska implantat 29.
I våra demonstrationer av biofabrication, har vi visat både samspelet mellan biologiska komponenter och över bio-elektroniska gränssnittet är lika tillämpliga, vilket sätter i nå utsikten att integrera alla sorter av interaktioner för avancerad prestanda i on-chip signalöverföring. Följaktligen kan biofabrication underlätta tillverkning av enheter med reducerad "minsta karaktäristisk storlek" som en direkt fortsättning på snabba utvecklingen inom mikrofabrikation så ofta motiverats av hemelektronik. Det är kanske nästa nästa generations enheter i själva verket omfattar labila biologiska komponenter som ger naturens utsökta montering och kapacitet erkännande på ännu mindre långa scales än konstgjorda system. Vi ser framför oss kort sikt tillämpningar inom analytisk instrumentering, miljö sensorer, och även biokompatibla implantat.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner finansiering från DTRA för stöd till detta manuskript och från ONR, DTRA och NSF för partiell stöd underliggande forskningen.
Name of the component | Company | Catalogue number |
Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 |
Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D |
RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 |
Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | |
Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 |
Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 |
Slim Line 2″ Alligator Clips | RadioShack | 270-346 |
Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 |
SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer |
Fluorescecence stereomicroscope | Olympus | MVX10 MacroView |
cellSens Standard | Olympus | version 1.3 |
Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 |
Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR | BDH3030 |
Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR | VW3247 |
Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 |
Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles |
Speciality Minerals Inc. |
100-3630-3 |
Table 2. Chitosan and alginate solution reagents.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 |
Sodium Chloride, Certified ACS crystalline |
Fischer Scientific |
S271 |
Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 |
Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich |
P4417 |
Table 3. Other solution components and buffer reagents.
Name of the reagent | Company/Source | Catalogue number |
Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 |
Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 |
LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 |
“AI2-Synthase” (HGLPT) | Lab stock 16 | |
W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | |
MDAI2 + pCT6-lsrR–ampr + pET-dsRed–kanr cells | Lab stock 30 | |
FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 |
5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 |
DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Scientific | PI-53020 |
Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents.