Denne artikkelen beskriver en biofabrication tilnærming: avsetning av stimuli-responsive polysakkarider i nærvær av tendensiøse elektroder for å skape biokompatible filmer som kan functionalized med celler eller proteiner. Vi viser en benk-top strategi for generering av filmene så vel som deres grunnleggende bruk for å lage interaktive biofunctionalized overflater for lab-on-a-chip-applikasjoner.
Fremskritt i lab-on-a-chip teknologi lover å revolusjonere både forskning og medisin gjennom lavere kostnader, bedre følsomhet, bærbarhet, og høyere gjennomstrømning. Inkorporering av biologiske komponenter inn på biologiske mikroelektromekaniske systemer (BioMEMS) har vist stort potensial for å nå disse målene. Microfabricated elektroniske brikker tillate mikrometer skala funksjonene samt en elektrisk tilkobling for sensing og betjening. Funksjonelle biologiske komponenter gi systemet kapasitet for spesifikk påvisning av analytter, enzymatisk funksjoner og hel-celle evner. Standard microfabrication prosesser og bio-analytiske teknikker har blitt brukt i årtier i datamaskinen og biologisk industri, henholdsvis. Deres kombinasjon og grensesnitt i en lab-on-a-chip miljø, derimot, bringer frem nye utfordringer. Det er en oppfordring til teknikker som kan bygge et grensesnitt mellom elektroden og biologiske component som er mild og er lett å dikte og mønster.
Biofabrication, beskrevet her, er en slik tilnærming som har vist store løftet for sin lett-å-montere inkorporering av biologiske komponenter med allsidighet i on-chip funksjoner som er aktivert. Biofabrication bruker biologisk materiale og biologiske mekanismer (selv-montering, enzymatisk montering) for bottom-up hierarkisk montering. Mens våre laboratorier har vist disse begrepene i mange formater 1,2,3, her vi demonstrere montering prosessen basert på electrodeposition etterfulgt av flere anvendelser av signal-baserte interaksjoner. Oppsettingen består av electrodeposition av biokompatible stimuli-responsive polymer filmer på elektroder og deres påfølgende funksjonalisering med biologiske komponenter som DNA, enzymer, eller levende celler 4,5. Electrodeposition tar nytte av pH gradient opprettet på overflaten av en partisk elektrode fra elektrolyseav vann 6,7,. Kitosan og alginat er stimuli-responsive biologiske polymerer som kan utløses til selv montere inn hydrogel filmer i respons til pålagte elektriske signaler 8. Tykkelsen på disse hydrogeler bestemmes av i hvilken grad den pH gradient strekker seg fra elektroden. Dette kan endres ved hjelp av varierende strømtettheter og avsetning ganger 6,7. Denne protokollen vil beskrive hvordan kitosan filmene er avsatt og functionalized ved kovalent feste biologiske komponenter til de rike primære amin grupper tilstede på filmen gjennom enten enzymatiske eller elektrokjemisk metoder 9,10. Alginat filmer og deres entrapment av levende celler vil også bli behandlet 11. Endelig er nytten av biofabrication demonstrert gjennom eksempler på signal-basert samhandling, herunder kjemisk-til-strøm-, celle-til-celle, og også enzym-til-celle signaloverføring.
Både electrodepositionog funksjonalisering kan utføres under nær-fysiologiske forhold uten behov for reagenser og dermed spare labile biologiske komponenter fra tøffe forhold. I tillegg har både kitosan og alginat lenge blitt brukt for biologisk relevante formål 12,13. Generelt kan biofabrication, en rask teknikk som kan ganske enkelt utføres på en stasjonær, brukes for å lage mikron skala mønstre av funksjonelle biologiske komponenter på elektroder og kan brukes til en rekke lab-on-a-chip-applikasjoner.
Våre prosedyrer demonstrere electrodeposition og funksjonalisering av biopolymer filmer, en prosess vi kaller biofabrication. Gjennom funksjonalisering med celler og biomolekyler skaper vi biologiske overflater som kan samhandle med hverandre og elektroden adressen de er montert på. Det første trinnet, electrodeposition, skjer gjennom utløste selv-montering av biopolymerer, alginat og kitosan i våre studier, som svar på et elektrisk signal. Som nevnt tidligere en pH gradient genereres som kan kontrolleres av den nåværende tetthet og avsetning tid, gir ekstra kontroll over filmen dimensjoner og egenskaper 6,17. Vi har funnet at en rekke nåværende tetthet og deponering tid kombinasjoner kan brukes til elektrodene angitt i tabell 1. Mens bruk av andre elektroder er gjennomførbart, vil justeringer prosedyren være nødvendig. Sammenlignet med andre teknikker for filmdannelse prosessen med electrodeposisjon er enkel, rask og reagentless. Det er ikke behov for en omfattende repertoar av kostbart utstyr og arbeidskrevende forberedelser. Viktigere, kan prosessen tåler mindre eksperimentelle avvik og kan lett startes på nytt hvis det oppstår et problem.
Chitosan er i stand til å svare på et høyt katodisk pH gradient på grunn viktige funksjonelle egenskaper overdratt til det ved et høyt innhold av primære aminer. Ved høy pH (større enn pKa av ~ 6,3) aminene er deprotonated og kitosan blir uløselig, noe som åpner for film formasjon. Etter deponering, vil filmene forbli festet til elektroden. Imidlertid finnes muligheten til å delaminate dem hvis ønskelig. Filmene vil være stabil så lenge pH av løsningen faller ikke under pKa. Sure løsninger protonate aminene og de påfølgende elektrostatiske repulsions hovne opp geleen til den oppløses 18. Det er, er det montering / demontering prosessen reversibel ved etterspørsel og allows for fjerning av avsatt filmer og gjenbruk av elektroder. Beleilig, er pH-område hvor sol-gel overgang skjer nær det som de fleste biologiske komponenter fungere optimalt. Dette gjør prosessen ideelle for oppbevaring av funksjonaliteten under montering seks.
Alginat filmdannelse er tilrettelagt av anodisk elektrolyse av vann, samt tilstedeværelse av kalsiumkarbonat 7. Den lokaliserte lav pH ved anoden solubilizes den kalsiumkarbonat som fører til utgivelsen kalsium kationer. Disse ionene er chelated av alginat, og danner en krysskoblet nettverk på elektroden overflaten. Alginat filmene er særlig reversible ved konkurranse om kalsiumioner fra andre chelaterande forbindelser som citrat eller EDTA, som kan brukes til å oppløse filmene, slik at for gjenbruk av de underliggende elektrodene. Dermed alginat filmene er relativt skjøre når de utsettes for fysiologiske forhold fordi kalsiumioner er lett scavenged fra gel matrix, svekke dens struktur og fremme film delaminering eller redissolution. For å overkomme denne begrensningen, har vi inkludert en inkubasjon steg for filmen i en M CaCl 2 å styrke gel. I tillegg anbefaler vi at filmens inkubasjonstiden løsning (celle media osv.) suppleres med CaCl 2 i en konsentrasjon på 500 mM-3 mm.
Den andre store Prosedyren er funksjonalisering av det deponerte filmen med relevante biologiske komponenter. Dette kan oppnås på to måter, den første var elektrokjemiske konjugering, en strategi som gir mulighet for rask, reagentless montering av proteiner med eksepsjonell romlig kontroll 10. Men funksjonalisering på denne måten begrenses av spredningen av Cl – ioner gjennom filmen til elektroden samt spredning av HOCl, den genererte reaktive mellomliggende, tilbake ut i løsningen. Muligheten av elektrokjemisk aktive molekyler å passeregjennom filmen åpner for transduksjon av kjemiske og biologiske signaler inn i lett-å-lese elektriske signaler 15. Vi har vist tyrosinase-mediert kobling som andre strategi for enzymet funksjonalisering til kitosan, demonstrert ved kovalent feste AI-2 syntase. Denne strategien gjør at funksjonalisering prosessen skal være kontrollert og selektiv – avhengig av en bestemt reagens, tyrosinase, som virker discriminately på proteiner inneholder en tyrosin tag ni.
Vi viser nytten og biokompatibilitet av multi-adresse systemer ved å kopiere naturlige trasé på en chip. Først vi arrangert to celle populasjoner (dvs. "avsendere" og "mottakere") på ulike adresser, og viste at de samhandlet over tilstøtende elektroder for å levere AI-2 og generere en fluorescens respons. Dette konseptet har også blitt demonstrert av Cheng et al. i en microfluidic chip 14. Vi har også etterlignet samspillet, men i stedet bruktet enzym for å syntetisere AI-2 for levering. På denne måten ble en syntetisk intracellulær vei, AI-2 syntese, replikeres gjennom biofabrication og fungerte mye som det ville gjort i løsningen.
I begge tilfeller presenterer montering av flere adresser utfordringen å unngå ikke-spesifikk binding mellom adressene fordi hver deponering løsning må innføres for hele elektroden array, selv om electrodeposition er kun ment til én adresse. Lett likevel grundig vask kan fjerne de fleste gjenværende løsning fra ikke-partisk elektroder, bruk av flyten i microfluidic kanaler kan ytterligere redusere ikke-spesifisitet. Spesielt for tilstøtende biofabrication av kitosan og alginat adresser, anbefaler vi å deponere kitosan filmen først, etter dette med biofunctionalization trinn, og etter dette, electrodepositing alginat. Selv om vi ikke har gjort det her, har vi funnet at blokkering av kitosan filmen med inerte proteiner (for eksempel milk, BSA, etc.) reduserer sterkt ikke-spesifikk binding av uønskede molekyler til kitosan er aminated overflate.
Vi har funnet nytte i å etablere mønstrede elektroder, ofte funnet i BioMEMS enheter, som "blåkopier" for en kompleks ordning av celler og biomolekyler. Bruken av el kitosan i BioMEMS enheter kan gå langt utover de eksemplene som er nevnt her 19. Chitosan kan deponeres på ulike mikroskala geometrier – for eksempel i microchannels og på ikke-plane overflater 20,15. Filmene kan også endres med andre polymerer og en rekke proteiner, DNA, nanopartikler, og redoks-aktive molekyler for romanen egenskaper 21,22,23. I BioMEMS enheter, har kitosan filmer blitt brukt for levering av legemidler, redoks og lite molekyl deteksjon, biocatalysis, og cellestudier 20,23,24,25. Tilsvarende er alginat mye brukt som en celle-entrapment matrise og har blitt undersøkt for reversibel fluidic containment avcelle populasjoner og i-film immunoanalysis 26,27,28. Composite filmer for tissue engineering applikasjoner har blitt fabrikkert ved hjelp av alginat electrodeposition, med komponenter som med hydroksyapatitt for ortopediske implantater 29.
I våre demonstrasjoner av biofabrication, har vi vist både samspillet mellom biologiske komponenter, og over bio-elektronisk grensesnitt for å være like aktuelt, og dette bringer inn nå utsikter til å integrere alle varianter av interaksjoner for sofistikert ytelse i on-chip signaloverføring. Følgelig kan biofabrication lette fabrikasjon av enheter med reduserte "Minimum funksjonen størrelser" som en direkte oppfølging på å raske utviklingen i microfabrication, som ofte motivert av forbrukerelektronikk. Det er, kanskje neste neste generasjons enheter faktisk er labile biologiske komponenter som tilbyr naturens utsøkt montering og anerkjennelse evner på enda mindre lengde SCAles enn menneskeskapte systemer. Vi ser kort sikt programmer i analytisk instrumentering, miljø sensorer, og selv biokompatible implanterbare enheter.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner midler fra DTRA for støtte for denne manuskript og fra ONR, DTRA, og NSF for delvis støtte av underliggende forskning.
Name of the component | Company | Catalogue number |
Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 |
Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D |
RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 |
Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | |
Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 |
Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 |
Slim Line 2″ Alligator Clips | RadioShack | 270-346 |
Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 |
SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer |
Fluorescecence stereomicroscope | Olympus | MVX10 MacroView |
cellSens Standard | Olympus | version 1.3 |
Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 |
Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR | BDH3030 |
Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR | VW3247 |
Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 |
Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles |
Speciality Minerals Inc. |
100-3630-3 |
Table 2. Chitosan and alginate solution reagents.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 |
Sodium Chloride, Certified ACS crystalline |
Fischer Scientific |
S271 |
Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 |
Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich |
P4417 |
Table 3. Other solution components and buffer reagents.
Name of the reagent | Company/Source | Catalogue number |
Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 |
Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 |
LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 |
“AI2-Synthase” (HGLPT) | Lab stock 16 | |
W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | |
MDAI2 + pCT6-lsrR–ampr + pET-dsRed–kanr cells | Lab stock 30 | |
FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 |
5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 |
DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Scientific | PI-53020 |
Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents.