Summary
Dit artikel beschrijft een biofabrication benadering: depositie van stimuli reagerende polysachariden in de aanwezigheid van voorgespannen elektroden biocompatibel films kan worden gefunctionaliseerd met cellen of eiwitten te maken. We tonen een bench-top strategie voor de generatie van de films en hun fundamentele toepassingen voor het maken van interactieve biofunctionalized oppervlakken voor lab-on-a-chip toepassingen.
Abstract
De vooruitgang in lab-on-a-chip technologie belofte van zowel het onderzoek en geneeskunde een revolutie door lagere kosten, betere gevoeligheid, draagbaarheid en hogere doorvoer. De integratie van biologische componenten op biologische micro-elektromechanische systemen (BioMEMS) heeft laten zien een groot potentieel voor het bereiken van deze doelstellingen. Microfabricated elektronische chips zorgen voor micrometer-schaal functies en een elektrische aansluiting voor de detectie en bediening. Functionele biologische componenten geeft het systeem de capaciteit voor de specifieke detectie van analyten, enzymatische functies en whole-cell mogelijkheden. Standaard microfabricage processen en bio-analytische technieken zijn met succes gebruikt voor decennia in de computer en de biologische industrie, respectievelijk. Hun combinatie en interfacing in een lab-on-a-chip-omgeving, maar brengt weer nieuwe uitdagingen. Er is een oproep tot technieken die een interface tussen de elektrode en biologische compo kan bouwenENT dat is mild en is eenvoudig te fabriceren en patroon.
Biofabrication, hier beschreven, is een dergelijke benadering die heeft laten zien een grote belofte voor zijn eenvoudig te monteren incorporatie van biologische componenten met veelzijdigheid in de on-chip-functies die zijn ingeschakeld. Biofabrication maakt gebruik van biologische materialen en biologische mechanismen (zelf-assemblage, enzymatische montage) voor de bottom-up hiërarchische montage. Terwijl onze laboratoria hebben aangetoond dat deze begrippen in vele formaten 1,2,3, hier tonen we de assemblage proces op basis van elektrodepositie, gevolgd door meerdere toepassingen van het signaal op basis van interacties. Het samenstel bestaat uit de elektrodepositie van biocompatibele stimuli-responsieve polymeer films elektroden en de daaropvolgende functionalisering met biologische componenten zoals DNA, enzymen of levende cellen 4,5. Elektrodepositie maakt gebruik van de pH-gradiënt gecreëerd op het oppervlak van een voorgespannen elektrode uit de elektrolysewater 6,7. Chitosan en alginaat zijn stimuli-responsieve biologische polymeren die kunnen om zelf te monteren in de hydrogel films worden geactiveerd als reactie op opgelegde elektrische signalen 8. De dikte van deze hydrogelen wordt bepaald door de mate waarin de pH gradient uitstrekt van de elektrode. Dit kan worden gewijzigd met behulp van verschillende stroomdichtheden en depositie keer 6,7. Dit protocol beschrijft hoe chitosan films worden afgezet en gefunctionaliseerd met covalent verbonden biologische componenten van de overvloedige primaire amine groepen aanwezig op de film door enzymatische of elektrochemische methoden 9,10. Alginaat films en de beknelling van levende cellen, zullen aan bod 11. Tenslotte wordt het nut van biofabrication aangetoond door voorbeelden signaal gebaseerde interactie, chemische-elektrische, cel-cel, en enzym-cel signaaloverdracht.
Zowel de elektrodepositieen funktionalisering kan onder nagenoeg fysiologische omstandigheden zonder reagentia en dus labiele biologische componenten besparen zware omstandigheden. Daarnaast hebben zowel chitosan en alginaat lang gebruikt voor biologisch relevante doeleinden 12,13. Algemeen kan biofabrication een snelle techniek die eenvoudig kan worden uitgevoerd op een werkblad, worden gebruikt voor het creëren micronschaal patronen van functionele biologische componenten elektroden en kan gebruikt worden voor verschillende lab-on-a-chip toepassingen.
Protocol
1. Alginaat Elektrodepositie
- Sluit een voeding aan op de op maat vervaardigde elektroden via patchkabels met alligator clips. Een indium tin oxide (ITO) onder glasplaatje fungeert als anode (werkzame elektrode) en platina folie dient als kathode (tegenelektrode). Plaats de elektroden de ITO oppervlak worden gefunctionaliseerd tegen het tegenelektrode en verticaal gepositioneerd worden gedompeld in een oplossing of horizontaal, zodat de neerslagoplossing wordt opgenomen op het oppervlak.
- Bereid een alginaat neerslagoplossing door menging 1% alginaat en 0,5% CaCO 3 (in gewicht) in gedestilleerd water en de oplossing autoclaaf. Het wordt aanbevolen om voortdurend roeren de oplossing wanneer niet in gebruik.
- Dompel beide elektroden in de neerslagoplossing. De gebruikte alginaat kan fluorescent gelabeld worden met FluoroSpheres (Invitrogen), volgens Cheng et al.. 14, zodat voor fluorescence beeldvorming van de resulterende film.
- Breng een constante stroom dichtheid (3 A / m 2) gedurende 2 minuten; spanning zal binnen het bereik te verschuiven van 2-3 V.
- Maak de elektrode en verwijderen van de niet-gedeponeerde oplossing. Voorzichtig spoelen de film met NaCl (0,145 M) om overbodige alginaat te verwijderen.
- Incubeer de film kort (~ 1 min) CaCl2 (0,1 M) de gel te versterken. Spoel met NaCl (0,145 M) en incuberen in een gewenste oplossing aangevuld met CaCl2 (1 mM).
- Beeld met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 1B).
2. Codeposition van Communiceren celpopulaties in alginaat
- Een signaal-zender celkweek (W3110 gew E. coli), gekweekt in LB media, en een signaal-ontvanger celkweek (MDAI2 + pCT6-lsrR - amp r + PET-DsRed - kan r), gekweekt in LB media + 50 pg / ml kanamycine en elk van ampicilline, worden gegroeid overnacht eennd opnieuw geënt groei tot een optische dichtheid (bij 600 nm) 1. Pas optische dichtheid van de ontvanger celkweek tot 0,4-0,6 met LB voor gebruik.
- Bereid een afzetting oplossing van 2% en 1% alginaat CaCO 3 en meng met elk celkweek in een 1:1 verhouding tot een uiteindelijke concentratie van 1% alginaat 0,5% CaCO 3, met cellen verdund tot een dichtheid van ongeveer half het kweken dichtheid.
- Gebruik een glasplaatje patroon twee ITO elektroden bevatten met een polydimethylsiloxaan (PDMS) en (bereid volgens Sylgard instructies en gesneden tot de gewenste grootte) en een platina elektrode. Sluit een ITO-elektrode met een voeding met de platina zoals beschreven in Procedure 1 (Alginaat elektrodepositie).
- Dompel de elektroden in een neerslagoplossing met de ontvanger cellen. Stel de voeding een constante stroom met een dichtheid van 3 A / m 2, waarbij het oppervlak afmeting wordt bepaald door de enkele elektrode waarop deposition optreden.
- Breng de huidige 2 minuten mogelijk te maken codeposition van de cellen in de alginaat matrix.
- Spoel de film zoals beschreven in stap 1.5.
- Schakel de anodische verbinding met de tweede, naastgelegen, ITO-elektrode.
- Herhaal de depositie procedure (stappen 2.4 tot 2.7), maar deze keer de introductie van de oplossing die de afzender cellen.
- Incubeer de twee elektroden chip met codeposited cellen en calcium-alginaat nacht bij 37 ° C in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 10% LB medium en 1 mM CaCl2.
- Na incubatie afbeelding met een fluorescentiemicroscoop (Figuur 2B).
3. Chitosan Elektrodepositie
- Sluit de voeding aan op de elektroden via krokodillenklemmen. Een gouden gecoate chip zal optreden als de kathode (werkende elektrode) en een platina folie zal dienen als de anode (tegen-elektrode). Plaats de gouden elektrode oppervlak zodat eop het zich tegen de tegenelektrode en beide verticaal gepositioneerd worden gedompeld in een oplossing of horizontaal, zodat de neerslagoplossing wordt opgenomen op het oppervlak.
- Bereid een chitosan-oplossing door het mengen van chitosan vlokken in het water en langzaam toe te voegen 2 M HCl aan de polysacchariden (eind pH 5,6) te ontbinden, en zorg ervoor dat de procedure die door Meyer et al.. 15 te volgen.
- Plaats de elektroden in een chitosan-oplossing (0,8%), volledig onder te dompelen het gewenste gebied van de depositie. De gebruikte chitosan kunnen worden fluorescent gelabeld met 5 - (en-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidylester (Invitrogen), volgens Wu et al. 8 het afbeelden van de galvanische film door fluorescentiemicroscopie..
- Breng een constante stroomdichtheid (4 A / m 2) gedurende 2 minuten. Spanning verschuift in het bereik van 2-3 V. Bereken de stroomdichtheid als functie van het goud oppervlak van de werkzame elektrode blootgesteld aan deposition oplossing.
- Spoel de elektrode met DI-water om overbodige chitosan te verwijderen. De chip kan worden opgeslagen in water of PBS (10 mM, pH 7,0).
- Beeld met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 3C).
4. Elektrochemische transductie met een gefunctionaliseerd Chitosan Film
- Codeposit chitosan en glucose oxidase (GOX) van een oplossing (1% chitosan, 680 U / mL GOX, pH 5,6) bij een stroomdichtheid van 4 A / m 2 naar een patroon elektrode volgens stap 3 (Chitosan elektrodepositie). Een chitosan film gevangen zitten in GOX zal worden gegenereerd.
- Sluit de behandelde elektrode drie elektrodensysteem de werkzame elektrode een platina draad als de tegenelektrode en Ag / AgCl referentie-elektrode als zoals beschreven in figuur 4A.
- Dompel de elektroden in een fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) bevattende NaCl (0,1 M).
- Elektrochemisch conjugaat van het eiwit aan de chitosanfilm door een constante spanning (0,9 V) gedurende 60 gebruik chronoamperometry 10.
- De chip in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) en was 10 minuten op een schudapparaat elke gereageerd NaCl en geconjugeerde GOX verwijderen.
- Vervolgens plaatst de drie elektroden als beschreven in stap 4.2 en ondergedompeld in een oplossing van 5 mM glucose. Met cyclische voltametrie, vegen de potentiaal in positieve richting 0,7 V. gebruiken een controlefilm die geen glucoseoxidase als vergelijking voor de hoeveelheid oxidatie gezien in de sweep (Figuur 4B).
- Verwijder de elektroden van de glucose en spoel met fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) dan de elektroden in een 10 ml bekerglas met 8 ml fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0). Bias de GOX-gefunctionaliseerde chip 0,6 V als de werkzame elektrode (Figuur 4C).
- Voeg aliquots van glucose naar de buffer (elke hoeveelheid verhoogt de glucose concentratie4 mm).
- Genereer een standaard curve tussen de steady state stroom en de glucose concentratie voor de GOX-gefunctionaliseerde chitosan film.
5. Eiwit functionalisering Met behulp van Enzymatische Vergadering
- Gebruik een glasplaatje patroon met een aangrenzende goud en ITO-elektrode binnen een PDMS goed. Bias de gouden elektrode met een kathodische potentieel om chitosan galvanische zoals eerder aangegeven. Spoel kort film in DI-water en daarna PBS met een pipet.
- Voeg een oplossing van 3 pM blauwe fluorescent gelabelde "AI-2 Synthase" 16 (met een DyLight labeling kit) + 100 U / mL Tyrosinase in PBS.
- Incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur spoel de film met PBS.
- Breng een anodische potentieel om de ITO-elektrode een alginaat depositie oplossing die de ontvanger cellen (zoals opgesteld in de stappen 2.1 tot 2.2) codeposit. Volg de stappen 2.3-2.6 van orde 2 (Codeposition van celpopulaties in alginaat).
- Voor het genereren vanhet uitgezonden signaal (AI-2) het enzymatisch na spoelen films toevoegen van een oplossing van 500 pM S-adenosyl homocysteine (SAB) in PBS, aangevuld met 10% LB medium en 1 mM CaCl2. Bedek de elektroden om verdamping van de oplossing te voorkomen en overnacht incuberen bij 37 ° C. Dit zal voor een ontvanger celrespons door het opwekken van een rood fluorescent eiwit (DsRed).
- Aangrenzende elektroden kunnen worden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie door aanpassing van de filters met de blauwe fluorescentie van AI-2 synthase en rode fluorescentie die door de ontvanger codeposited cellen (Figuur 5B) te bepalen.
6. Representatieve resultaten
Opgelegd elektrische signalen kunt gelokaliseerde micro-omgevingen (bijvoorbeeld velden en hellingen) in de buurt een elektrode oppervlak en deze prikkels kunnen de zelf-assemblage van Polysacchariden zoals alginaat en chitosan te storten als een hydrogel film op het elektrode-oppervlak te activeren. Omdat tzijn sol-gel overgang optreedt in het elektrodemateriaal de resulterende film electroaddressed met de geometrie overeenkomen met de elektrode patroon (fig. 1B, 3C). Biocompatibele films zoals alginaten en chitosan voorzien oppervlakken kan worden gefunctionaliseerd met biologische componenten. Met behulp van alginaat, hebben unieke celpopulaties is codeposited op verschillende adressen. Het bewijs van hun electroaddressment worden waargenomen tijdens de interactie tussen de zender en ontvanger celpopulatie. De molecule autoinducer-2 (AI-2) diffundeert uit de afzender cellen en wordt door de ontvanger cellen, resulterend in expressie van de DsRed rode fluorescent eiwit (Figuur 2A). In figuur 2B, wordt rode fluorescentie alleen waargenomen bij de elektrode waar de ontvangers worden aangepakt.
De amine groepen aanwezig chitosan voorzien van de pH reactiesnelheid nodig galvanisch en een oppervlak voor functionalisering. Wijbenut deze unieke eigenschappen door elektrochemisch conjugeren van het biosensing enzym glucose-oxidase (GOX) om elektrolytisch chitosan films. Dit enzym verschaft de mogelijkheid voor de detectie van glucose door een enzymatische reactie (Figuur 4A) waterstof peroxide die dan elektrochemisch kan worden geoxideerd het produceren van een uitgangsstroom. Op deze wijze kan een chemisch signaal worden getransduceerd elektrisch. Figuur 4B toont dat films waarin GOX was geconjugeerd elektrochemisch een hard anodische signaal in de aanwezigheid van glucose in tegenstelling tot de films die geen GOX. Deze resultaten geven GOX kunnen worden gemonteerd op een gedeponeerd chitosan film en katalytische activiteit behouden. Bovendien Figuur 4C toont een stap toename anodische stroom in antwoord op toenemende concentraties glucose. De standaard curve ook in Figuur 4C toont de stap toe overgegaan in een bijna lineaire fashion afhankelijk van de hoeveelheid glucose toegevoegd. Deze resultaten tonen dat het enzym ook de gevoeligheid te verhogen glucose concentraties op conjugatie tot chitosan film blijft. De ondergrens van detectie is hier niet onderzocht zoals eerder is gekenmerkt dit systeem in het werk van Meyer et. al.
We hebben ook aangetoond dat de covalente immobilisatie van een enzym van belang, ontworpen om een aangepaste penta-tyrosine tag, om chitosan in een enzymatisch-gecontroleerde manier bevatten. Concreet wordt dit proces gemedieerd door het enzym tyrosinase. Zoals weergegeven door de regeling in fig. 5A (bovenste), een enzym, AI-2 Synthase omvat een penta-tyrosine tag. Tyrosinase werkt in op de tyrosine-tag, het oxideren van de residuen 'fenolgroepen naar O-chinonen, die covalent vervolgens binden aan chitosan's aminen. Bewijs van chitosan film functionalisering met de AI-2 Synthase door tyrosinase assemblage wordt waargenomen in figuur 5B (Figuur 5A (onderste)). Rode fluorescentie van de ontvanger cellen (figuur 5B) toont opnieuw interactie tussen adressen door de diffusie van AI-2 van een naar de ander en verder aan dat enzymen geïmmobiliseerd op chitosan behouden activiteit als covalent gebonden.
Figuur 1. Alginaat elektrodepositie. (A) Mechanisme van alginaat elektrodepositie: als een elektrode wordt anodisch bevooroordeeld, elektrolyse van water ontstaat aan het oppervlak, het genereren van een gelokaliseerde lage pH. Calciumcarbonaatdeeltjes reageren met het overschotprotonen vrij calcium kationen de deeltjes op te lossen. In aanwezigheid van alginaat polymeerketens, raken de ionen chelaatvormer een "Eggbox" netwerk, waarbij een verknoopt hydrogel bij de elektrode. Als de afstand van de elektrode toe, alginaat een grotere neiging tot in oplossing blijven door de verminderde aanwezigheid van calciumionen. (B) een L-vormige patroon ITO elektrode werd ingezet om galvanische alginaat. Een PDMS goed is bevestigd aan de elektrode een groen fluorescent gelabelde alginaat (1%) en CaCO 3 (0,5%) neerslagoplossing bevatten. Na electrodepositing gedurende 2 minuten. bij een stroomdichtheid van 3A / m 2 is het alginaat electroaddressed hydrogel afgebeeld door fluorescentiemicroscopie.
Figuur 2. Codeposition van celpopulaties. (A) Regeling met interactie tussen twee E. coli-stammen: Een populatie produceert autoinducer-2 (AI-2), Een signaalmolecule wordt en aangeduid als "Al-2 zender". De overige bevolking, aangeduid als "AI-2-ontvanger", is een verslaggever van AI-2; na ontvangst van AI-2 door diffusie vanuit de afzender, het drukt de rode fluorescerende eiwit DsRed. (B) rode fluorescentie beeld van de elektrode paar met de AI-2 afzender bevolking codeposited met alginaat op de linker elektrode en AI-2-ontvanger bevolking codeposited met alginaat rechts elektrode. Vergrote weergave toont de DsRed uitdrukking van alleen de AI-2 ontvangers.
Figuur 3. Chitosan elektrodepositie. (A) met de regeling pH-afhankelijke electrodepositie van chitosan. Water elektrolyse bij een kathodisch voorgespannen elektrode veroorzaakt gelokaliseerde hoge pH (aangegeven door een gelokaliseerde kleurverandering van een pH-indicator kleurstof bij de kathode in microfoto) waarin de sol-gel overgang van chitosan stimuleert in dit gebied. (B) De aminen te presenteren over chitosan te geven it pH-responsieve eigenschappen. Boven een pH van 6,3 (pKa van chitosan) de amines gedeprotoneerd, waardoor een overgang van de geprotoneerde oplosbare vorm op onoplosbare gelvorm. (C) een patroon goud elektrode werd ingezet om galvanische chitosan. De elektrode kathodisch aangesloten op de voeding, werd ondergedompeld in een groen fluorescent gelabelde chitosan (0,8%) neerslagoplossing. Na electrodepositing gedurende 2 minuten. bij een stroomdichtheid van 4 A / m 2 is de electroaddressed chitosan film afgebeeld door fluorescentiemicroscopie.
Figuur 4. Electrochemical transductie met een gefunctionaliseerd chitosan film. (A) Schematische met de set-up van een drie elektrodesysteem. Gefunctionaliseerde chitosan film dient als de werkzame elektrode een platina draad als de tegenelektrode en Ag / AgCl referentie-elektrode als. Elektrochemische transductie van glucose verloopt via ee enzymatische elektrochemische reacties weergegeven werden geproduceerd waterstofperoxide kan worden geoxideerd en gemeten op de werkzame elektrode. (B) Cyclische voltammagram (CV) in elektrode met een chitosan film met elektrochemisch geconjugeerde glucose oxidase (GOX) toont een sterk anodische signaal in 5 mM glucose-oplossing. Een film die geen GOX diende als controle en vertoonde geen signaal in dezelfde oplossing. (C) Een standaard curve tussen anodische de huidige en de glucoseconcentratie wordt een bijna lineair verband (elk aliquot verhoogde de glucoseconcentratie van 4 mm en verhoogde ook de huidige amplitude in de inzet grafiek in een stapsgewijze manier).
Figuur 5. Protein functionalisering met behulp van enzymatische montage. (A, boven) regeling met tyrosine-tag "AI-2 Synthase" wordt covalent gebonden aan een chitosan film van tyrosinase montage. De tyrosine residuen worden oxidevan rond O-chinonen door tyrosinase actie kan reageren met aminegroepen de chitosan film, een covalente binding. (A, lager) De AI-2 Synthase genereert AI-2 van een substraat (SAB), de ontvanger cellen verslag van de gegenereerde AI-2 door DsRed fluorescentie expressie. (B) Fluorescentie beelden die een chitosan film op goud, gefunctionaliseerd met blauw-gelabeld AI-2 synthase. Naast elkaar zijn AI-2 cellen ontvanger codeposited met alginaat op ITO. Na toevoeging van de enzymatische substraat de put incubatie drukken de AI-2 cellen ontvanger DsRed.
Discussion
Onze procedures aan te tonen de elektrodepositie en functionalisering van biopolymeer films, een proces dat we begrip biofabrication. Door functionalisering met cellen en biomoleculen maken we biologische oppervlakken kunnen interactie met elkaar en de elektrode adres ze geassembleerd op. De eerste stap, elektrodepositie, geschiedt door de geactiveerde zelfassemblage van biopolymeren, alginaat en chitosan in studies, in reactie op een elektrisch signaal. Zoals eerder een pH-gradiënt worden gegenereerd die worden bestuurd door de stroomdichtheid en depositietijd, waardoor extra controle op de film afmetingen en eigenschappen 6,17. Wij hebben gevonden dat een aantal stroomdichtheid depositietijd combinaties kunnen worden gebruikt voor de elektroden in tabel 1. Hoewel het gebruik van andere elektroden haalbaar zou aanpassing van de procedure noodzakelijk. Vergeleken met andere technieken van filmvorming het proces electrodeposiTIE is eenvoudig, snel en reagentless. Er is geen noodzaak voor een uitgebreide repertoire van dure apparatuur en bewerkelijk preparaten. Bovendien kan het proces tegen geringe afwijkingen experimentele en kan gemakkelijk worden begonnen als een probleem voordoet.
Chitosan kan reageren op een hoge kathodische pH gradient door belangrijke functionele eigenschappen verleent haar door een hoog gehalte aan primaire aminen. Bij hoge pH (groter dan de pKa van ~ 6.3) de amines gedeprotoneerd en chitosan onoplosbaar, waardoor filmvorming. Na afzetting wordt de films blijven aan de elektrode. De mogelijkheid bestaat om te delamineren indien gewenst. De films stabiel blijft zolang de pH van de oplossing niet beneden de pKa. Zure oplossingen protoneren de aminen en de daarop volgende elektrostatische afstoting zwellen van de gel tot het oplost 18. Dat wil zeggen dat de montage / demontage proces is omkeerbaar op de vraag en allows voor het verwijderen van gedeponeerde films en hergebruik van elektroden. Gunstig is de pH waarbij de sol-gel overgang plaats dicht bij die in de meeste biologische componenten optimaal functioneren. Dit maakt de werkwijze geschikt voor het bewaren van functionaliteit gedurende samenstel 6.
Alginaat filmvorming wordt vergemakkelijkt door de anodische elektrolyse van water en de aanwezigheid van calciumcarbonaat 7. De plaatselijke lage pH op de anode solubiliseert de calciumcarbonaat ertoe leiden dat de calcium kationen. Deze ionen zijn chelaatvormer alginaat, die een verknoopt netwerk van het elektrodemateriaal. Alginaat films name omkeerbaar door competitie voor calciumionen andere chelaterende verbindingen zoals citraat of EDTA, die gebruikt kunnen worden om de films te lossen, zodat hergebruik van de onderliggende elektroden. Zo, alginaat films zijn relatief kwetsbaar wanneer het wordt blootgesteld aan fysiologische omstandigheden, omdat calcium-ionen zijn gemakkelijk scavenged uit de gel matrix, verzwakking van de structuur en de bevordering van film delaminatie of redissolution. Om deze beperking te overwinnen, hebben wij een incubatiestap de film in 1 M CaCl2 de gel te versterken. Bovendien te bevelen de film incubatie-oplossing (celmedium, enz.) worden aangevuld met CaCl2 in een concentratie van 500 uM-3 mM.
De tweede belangrijke ingreep is de functionalisering van de gedeponeerde film met relevante biologische componenten. Dit kan op twee manieren, waarvan de eerste elektrochemische conjugatie een strategie dat een snelle, reagentless montage van eiwitten met bijzondere ruimtelijke controle 10. Echter functionalisering op deze wijze beperkt door de diffusie van Cl - ionen door de film op de elektrode en de verspreiding van HOCl de gegenereerde reactief tussenproduct terug in oplossing. Het vermogen van elektrochemisch actieve moleculen te passerendoor de film kan zijn voor de transductie van chemische en biologische signalen in gemakkelijk te lezen elektrische signalen 15. We hebben laten zien tyrosinase-gemedieerde koppeling als tweede strategie voor het enzym functionalisering naar chitosan, aangetoond door covalent het bevestigen van AI-2 synthase. Deze strategie staat de functionalisering te regelen proces en selectieve - afhankelijk van een specifiek reagens, tyrosinase, die inwerkt op discriminately eiwitten met een tyrosine tag 9.
We tonen het nut en de biocompatibiliteit van multi-adres systemen door te repliceren natuurlijke paden op een chip. Eerst hebben we twee celpopulaties (dat wil zeggen "afzenders" en "ontvangers") georganiseerd op verschillende adressen, en liet zien dat ze in wisselwerking over aangrenzende elektroden op AI-2 te leveren en een fluorescentie respons te genereren. Dit concept is eveneens aangetoond door Cheng et al.. in een microfluïdische chip 14. We hebben ook nagebootst van de interactie, maar in plaats daarvan gebruikteen enzym om AI-2 te synthetiseren voor levering. Op deze wijze werd een synthetisch intracellulaire weg, AI-2 synthese gerepliceerd door biofabrication en fungeerde veel aangezien het in oplossing.
In beide gevallen samenstel van meerdere adressen worden de uitdaging vermijden niet-specifieke binding tussen de adressen omdat elk neerslagoplossing wordt ingevoerd om de gehele elektrode, terwijl elektrodepositie alleen bedoeld op een adres. Gentle maar grondig wassen kan verwijderen van de meerderheid van de resterende oplossing van niet-biased elektroden, het gebruik van de stroming in microfluïdische kanalen kan verder minimaliseren van niet-specificiteit. Vooral voor de aangrenzende biofabrication van chitosan en alginaat-adressen, raden wij aan de neerlegging van de chitosan film eerst na deze met biofunctionalization stappen, en na deze, electrodepositing alginaat. Hoewel we hier niet gedaan, hebben we gevonden dat blokkering van de chitosan film inert eiwitten (zoals milk, BSA, etc.) vermindert aanzienlijk niet-specifieke binding van ongewenste moleculen aan het oppervlak geamineerd chitosan's.
We hebben nut bij het vaststellen van patronen elektroden, vaak gevonden in BioMEMS apparaten, zoals de "blauwdrukken" voor een complex geheel van cellen en biomoleculen. Het gebruik van elektrolytisch chitosan in BioMEMS apparaten kunnen veel verder gaan dan de voorbeelden die hier genoemd 19. Chitosan kan worden afgezet op verschillende microschaal geometrieën - zoals in microkanalen en op niet-vlakke oppervlakken 20,15. De films zijn ook worden gemodificeerd met andere polymeren en een verscheidenheid van eiwitten, DNA, nanodeeltjes en redox-actieve moleculen nieuwe eigenschappen 21,22,23. In BioMEMS apparaten zijn chitosan films zijn gebruikt voor drug delivery, redox en kleine molecule detectie, biokatalyse, en cel studies 20,23,24,25. Evenzo is alginaat schaal gebruikt als cel-opsluiting matrix en is onderzocht voor omkeerbare vloeibare insluiting vancelpopulaties en in-film immunoanalysis 26,27,28. Samengestelde films voor weefseltechniek aanvragen vervaardigd met behulp alginaat elektrodepositie, met componenten zoals bij hydroxyapatiet voor orthopedische implantaten 29.
In onze demonstraties van biofabrication, hebben we laten zien zowel de interacties tussen biologische componenten en over de bio-elektronische interface te zijn van overeenkomstige toepassing, dit brengt in het vooruitzicht te bereiken van de integratie van alle rassen van de interacties voor geavanceerde prestaties in on-chip signaaloverdracht. Daarom biofabrication kan de fabricage van apparaten te vergemakkelijken met een verminderde "minimale functie maten" als een direct vervolg op de snelle ontwikkelingen in microfabricage, zoals vaak ingegeven door consumentenelektronica. Dat wil zeggen, de volgende keer zou de volgende generatie apparaten in feite zijn labiele biologische componenten die de natuur prachtige montage en erkenning mogelijkheden op nog kleinere lengte sca biedenles dan de mens gemaakte systemen. We zien op korte termijn toepassingen in analytische instrumentatie-, milieu-sensoren, en zelfs biocompatibel implanteerbare apparaten.
Disclosures
Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door de Verenigde Staten Defense Threat Reduction Agency.
Acknowledgments
Wij erkennen de financiering van DTRA voor de ondersteuning van dit manuscript en van ONR, DTRA, en NSF voor gedeeltelijke ondersteuning van de onderliggende onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
References
- Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
- Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
- Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
- Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
- Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
- Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
- Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
- Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
- Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
- Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
- Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
- de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
- Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
- Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
- Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
- Yi, H.
- Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
- Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
- Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
- Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
- Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
- Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
- Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
- Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
- Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
- Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
- Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
- Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).
