Profilage Glycan des polymères végétaux de la paroi cellulaire en utilisant Microarrays
Summary
Une technique appelée<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strongProfilage olymer> (COMPP) pour la caractérisation des glycanes paroi cellulaire végétale est décrit. Cette méthode combine la spécificité des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes définis glycane-avec une plate-forme puces à ADN miniature analytique permettant le dépistage de l'apparition glycane dans un large éventail de contextes biologiques.
Abstract
Parois des cellules végétales sont des matrices complexes de glycanes hétérogènes qui jouent un rôle important dans la physiologie et le développement des plantes et de fournir les matières premières pour les sociétés humaines (par exemple, les industries du bois, du papier, du textile et de biocarburants) 1,2. Cependant, la compréhension de la biosynthèse et la fonction de ces composants reste difficile.
Glycanes parois cellulaires sont chimiquement et conformation diverse en raison de la complexité de leurs blocs de construction, les résidus glycosylés. Ces liens forment en des positions multiples et diffèrent en structure cyclique, la configuration anomérique ou isomérique, et en plus, sont substitués par un réseau de résidus de sucre non. Composition Glycan varie en cellule et / ou types de tissus ou même des sous-domaines d'une seule cellule paroi 3. En outre, leur composition est également modifiée au cours du développement 1, ou en réponse à des signaux environnementaux 4.
En exprocessus de 2.000 gènes ont des parois cellulaires végétales sont des matrices complexes de glycanes hétérogènes été prévus pour être impliqués dans la biosynthèse de la paroi cellulaire et la modification glycane dans 5 Arabidopsis. Cependant, relativement peu de gènes de biosynthèse ont été fonctionnellement caractérisé 4,5. Approches de génétique inverse sont difficiles parce que les gènes sont souvent exprimés de façon différentielle, souvent à des niveaux faibles, entre les types de cellules 6. En outre, des études mutants sont souvent entravées par la redondance génique ou les mécanismes compensatoires pour assurer la fonction appropriée paroi cellulaire est maintenu 7. Ainsi, de nouvelles approches sont nécessaires pour caractériser rapidement la diversité des structures des glycanes et de faciliter approches de génomique fonctionnelle de biosynthèse de la paroi cellulaire et la compréhension de modification.
Les anticorps monoclonaux (Acm) 8,9 ont émergé comme un outil important pour déterminer la structure des glycanes et la distribution des plantes. Ceux-ci reconnaissent distInTC épitopes présents dans les principales catégories de glycanes parois cellulaires végétales, y compris les pectines, les xyloglucanes, les xylanes, les mannanes, les glucanes et arabinogalactanes. Récemment, leur utilisation a été étendue à des expériences de criblage à grande échelle pour déterminer l'abondance relative des glycanes dans un large éventail de plantes et types de tissus simultanément 9,10,11.
Nous présentons ici une méthode de dépistage basé sur un microréseau glycane appelé complète Microarray Polymer profilage (COMPP) (figures 1 et 2) 10,11 qui permet de multiples échantillons (100 sec) pour être contrôlés au moyen d'une plate-forme de puces à ADN miniaturisé avec le réactif réduit et des volumes d'échantillon. Les signaux de place sur la puce peuvent être formellement quantifié pour donner données semi-quantitatives sur glycane épitope événement. Cette approche est bien adaptée à suivre l'évolution des glycanes dans des systèmes biologiques complexes 12 et fournissant un aperçu global de la composition de la paroi cellulaire en particulier lorsque les connaissances antérieures of ce n'est pas disponible.
Protocol
Representative Results
Discussion
COMPP est une méthode rapide et sensible pour le profilage de la composition glycane de centaines d'origine végétale échantillons dans une affaire de jours. Cette méthode vient compléter les déjà bactériennes ou de mammifères plates-formes de tableaux glycanes de criblage à haut débit des interactions avec les hydrates de carbone glycane protéines de liaison telles que les lectines, des récepteurs et anticorps 16. Avec une grande diversité de sondes disponibles pour détecter glycanes paroi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM tient à remercier le Conseil de recherches en danois (FTP et FNU) pour le financement. ERL reconnaît le soutien d'une subvention ARC DP. AB reconnaît le soutien de l'ARC Centre d'excellence en parois cellulaires des végétaux subvention.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O’Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
