En teknikk som kalles<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strong> Olymer profilering (CoMPP) for karakterisering av plante cellevegg glykaner er beskrevet. Denne metoden kombinerer spesifisitet av monoklonale antistoffer rettet mot definerte glycan-epitoper med en miniatyr microarray analytisk plattform som tillater screening av glycan forekomst i et bredt spekter av biologiske sammenhenger.
Plant celleveggene er komplekse matriser av heterogene glykaner som spiller en viktig rolle i fysiologi og utvikling av planter og gi råstoff for menneskelige samfunn (for eksempel tre, papir, tekstiler og biobrensel industri) 1,2. Men, forstå biosyntesen og funksjon av disse komponentene forblir utfordrende.
Cellevegg glykaner er kjemisk og conformationally mangfoldig på grunn av kompleksiteten i deres byggeklosser, de glykosyl rester. Disse danner bindinger ved flere posisjoner og skiller seg i ringstruktur, isomerisk eller anomere konfigurasjon, og i tillegg er substituert med en rekke ikke-sukkerrester. Glycan sammensetningen varierer i forskjellige celle-og / eller vevstyper eller selv sub-domener av en enkelt celle vegg 3. Videre er deres sammensetning også modifisert under utviklingen 1, eller i respons til miljømessige signaler 4.
I exsessen av 2000 gener har er Plant celleveggene komplekse matriser av heterogene glykaner blitt spådd å være involvert i celleveggen glycan biosyntese og modifikasjon i Arabidopsis 5. Imidlertid har relativt få av biosyntetiske gener blitt funksjonelt karakterisert 4,5. Omvendt genetikk tilnærminger er vanskelig fordi genene er ofte forskjellig uttrykk, ofte på lave nivåer, mellom celletyper 6. Dessuten er mutant studier ofte hindret av genet redundans eller kompenserende mekanismer for å sikre hensiktsmessig celleveggen funksjon opprettholdes 7. Dermed nye tilnærminger for å raskt karakterisere det varierte utvalget av sukkerkjedene strukturer og legge til rette funksjonell genomikk tilnærminger til forståelse celleveggen biosyntese og modifikasjon.
Monoklonale antistoffer (mAbs) 8,9 har dukket opp som et viktig verktøy for å bestemme glycan struktur og distribusjon i planter. Disse gjenkjenner distinct epitoper til stede innenfor store klasser av plante cellevegg glykaner, inkludert pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glukaner og arabinogalactans. Nylig bruken har blitt utvidet til store screening eksperimenter for å bestemme den relative overflod av glykaner i et bredt spekter av anlegg og vevstyper samtidig 9,10,11.
Her presenterer vi en microarray-baserte glycan screening metode som kalles Omfattende Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (figur 1 og 2) 10,11 som gjør at flere prøver (100 sek) skal skjermes ved hjelp av en miniatyrisert microarray plattform med redusert reagens og prøvevolumer. Spot signaler på microarray kan bli formelt kvantifisert å gi semi-kvantitative data om glycan epitop forekomst. Denne tilnærmingen er godt egnet til å spore endringer i sukkerkjedene komplekse biologiske systemer 12 og gir en global oversikt over celleveggen preparat spesielt når forkunnskaper of dette er utilgjengelig.
CoMPP er en rask og følsom metode for å profilere glycan sammensetningen av hundrevis plante-avledet prøver i løpet av noen dager. Denne metoden utfyller de allerede tilgjengelige bakterielle eller mammalske sukkerkjedene rekke plattformer for high-throughput screening av karbohydrat interaksjoner med glycan-bindende proteiner som lektiner, reseptorer, og antistoffer 16. Med et stort mangfold av sonder tilgjengelige for detektering cellevegg glykaner, er det mulig å få informasjon om sukkerkjedene epito…
The authors have nothing to disclose.
IEM ønsker å takke den danske Forskningsrådet (FTP og FNU) for finansiering. ERL erkjenner støtte fra en ARC DP stipend. AB erkjenner støtte fra ARC Centre of Excellence i Plant Cell Walls stipend.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |