Studere Proteolyse af cyclin B på enkelt celle niveau i hele cellepopulationer

Summary

Metafase at anafase overgang udløses gennem anaphase-fremmende kompleks (APC / C)-afhængig ubiquitinering og efterfølgende destruktion af cyclin B. Her har vi oprettet et system, som efter puls-chase mærkning, mulighed for at overvåge cyclin B proteolyse i hele cellepopulationer og letter påvisning af indblanding fra mitotisk checkpoint.

Abstract

Ligelig fordeling af kromosomer mellem de to datterceller ved celledeling er en forudsætning for at sikre genetisk stabilitet ^1. Unøjagtigheder i kromosom separation er kendetegnende for malignitet og forbundet med progressiv sygdom ^2-4. Spindlen samling checkpoint (SAC) er en mitotisk overvågningsmekanisme, som holder tilbage celler på metafase indtil hver enkelt kromosom har etableret en stabil bipolar tilknytning til mitotiske spindel ^1. SAC udøver sin funktion ved interferens med aktiverende APC / C underenhed Cdc20 at blokere proteolyse af Securin og cyclin B og dermed kromosom separation og mitotisk exit. Forkert montering af kromosomer forhindrer silencing af SAC-signalering og forårsager fortsat hæmning af APC / C ^Cdc20 indtil problemet er løst for at undgå kromosom missegregation, aneuploidi og maligne vækster ^1.

De fleste undersøgelser, der behandles på influence af forkert kromosomal fastgørelse på APC / C-afhængige proteolyse benyttede sig af spindel forstyrrelser ved hjælp af depolymerisering eller mikrotubulus-stabiliserende medicin til at forstyrre kromosomale tilknytning til mikrotubuli. Da interferens med mikrotubuli kinetik kan påvirke transport og lokalisering af kritiske regulatorer, disse procedurer bærer en risiko for at fremkalde kunstige effekter ^5.

At undersøge, hvordan SAC interfererer med APC / C-afhængige proteolyse af cyclin B under mitose i uperturberede cellepopulationer, vi etableret et histon H2-GFP-baseret system, der tillod samtidig overvågning af metafase tilpasning af mitotiske kromosomer og proteolyse af cyclin B ⁶ .

At skildre proteolytiske profiler, genererede vi et kimært cyclin B reportermolekyle med en C-terminal SNAP del ⁶ (fig. 1). I en individuel mærkning reaktion er SNAP-delen i stand til at danne kovalente bindinger medalkylguanin-bærere (SNAP substrat) ^7,8 (figur 1). SNAP substratmolekyler er let tilgængelige og bære et bredt spektrum af forskellige fluorochromer. Kimære cyclin B-SNAP-molekyler bliver mærket ved tilsætning af membran-permeable SNAP substrat til vækstmediet ⁷ (figur 1). Efter mærkningsreaktionen, falder cyclin B-SNAP fluorescensintensitet i et puls-chase reaktion-lignende måde og fluorescensintensiteter afspejler niveauer af cyclin B nedbrydning ⁶ (fig. 1). Vores system letter overvågningen af ​​mitotiske APC / C-afhængig proteolyse i et stort antal celler (eller flere cellepopulationer) parallelt. Derved kan systemet være et værdifuldt redskab til at identificere agenter / små molekyler, der kan interferere med proteolytisk aktivitet ved metafase til anafase overgangen. Øvrigt, som det syntese af cyclin B under mitose for nylig blevet foreslået som en vigtig mechanism at fremme en mitotisk blok i mus og mennesker ved at holde cyclin B ekspressionsniveauer stabile ^9,10, dette system muligt for os at analysere cyclin B proteolyse som et element i en ligevægtssituation ^6.

Protocol

1. Såning af U2OS-baserede cyklin B-SNAP Reporter celler (klon 11 Celler ⁶⁾ på Microscope Chamber Slides

1. Trypsinisér subkonfluente SNAP reporter-celler, der fik lov til at vokse asynkront i logaritmisk fase i mindst 48 timer.
2. Arbejde med 8 brønde mikroskop kamre (konstant fordeling af celler).

Til podning af celler på 8 brønde mikroskop kamre ved en konstant fordeling over hele overfladen af ​​mikroskopet kammeret, centrifuge 10.000 celler og resuspenderes i 350 pi af phenolrødt-frit normalt vækstmedium (suppleret med 10% føtalt okseserum, penicillin / streptomycin og natriumpyruvat). Overførsel cellesuspension til mikroskopet kammer (figur 2).

Arbejde med 8 brønde mikroskop kamre (maksimal celledensitet i midten).

Til podning af celler på et højere densitet i midten af ​​mikroskopet chambis, fylde kammeret med 300 gl af phenolrødt-frit normalt vækstmedium. Tilføj 5.000 celler forsigtigt til midten af mikroskopet kammer (figur 2).

Arbejde med 96 brønde særlige optik plader (konstant fordeling af celler).

Til podning af celler på plader med 96 brønde ved en konstant fordeling over hele overfladen af ​​brønden, centrifugeres 5.000 celler og resuspenderes i 300 pi af phenolrødt-frit normalt vækstmedium. Overfør cellesuspension til en plade med 96 brønde. Afhængigt af det totale antal af celle-holdige nødvendige boringer, celleantallet og det totale volumen af suspensionen medium (figur 2) justeres.

Arbejde med 96 godt Specialoptikken plader (maksimal celledensitet i midten).

Til podning af celler på 96-brønds plader, der forsigtigt tilsættes 1.500 celler i 15 pi af phenolrødt-frit normalt vækstmedium i en small dråbe i midten af hver brønd for at opnå en begrænsning af cellevækst til centrum af brønden (figur 2).

3. Tillad podede celler til at vokse i mindst 18 timer under standard cellekultur betingelser (37 ° C, 100% luftfugtighed, _5% CO2).

2. Farvning af Reporter Cells med SNAP Substrat

1. 30 minutter før begyndelsen af ​​farvningsproceduren tillader alikvoter af phenolrødfri normalt vækstmedium at varme op til 37 ° C.
2. For nem håndtering af SNAP substratet (i vores tilfælde TMR stjerne) opløses TMR stjerne i DMSO til en koncentration i stamopløsningen af ​​400 uM, som kan opbevares ved -20 ° C.
3. Før farvning, fortyndes 0,5 pi TMR stjerne stamopløsning i 200 pi phenolrødfri normalt vækstmedium (37 ° C) til opnåelse af en endelig mærkning koncentration på 1 uM.
4. Fjern normalt vækstmedium fra de asynkront voksende celler og inkuberes i labeling medium i 25 minutter under standard dyrkningsbetingelser.
5. Fjern mærkning medium og vask cellerne fire gange med phenolrødt-frit normalt vækstmedium (37 ° C). Cellerne inkuberes i 300 pi af phenolrødt-frit normalt vækstmedium (37 ° C) i 30 min. Forud for transport til mikroskopet udskifte mediet med frisk phenolrødt-frit normalt vækstmedium (37 ° C) for at fjerne tilbageværende ubundet SNAP substrat.
6. Transport celler til mikroskop i et styrofoam æske på en forvarmet (37 ° C) varmeblok at minimere temperaturudsving.

3. Måling af fluorescensintensitet

1. To timer forud for analysen justere lufttemperatur af klimakammeret til 37 ° C i tør tilstand, for at bringe hele mikroskop med alle dens komponenter til den ønskede temperatur. Forvarmning før indstilling af fugtighed er vigtig for at undgå kondensation og efterfølgende skade på mikroskopet.
2. Juster luftfugtighed to 60% og CO ₂ til 5% forud for analysens begyndelse.
3. Start Scan ^ R Acquisition software og definere standardindstillinger (se tabel 1).
4. Definerer positionerne af brøndene, der skal analyseres.
5. Definer ATm (erhvervelse cyklus tid) og det absolutte antal af køb cyklusser.
6. Hvis analyse af et større antal brønde ønskes, vælges hardware autofokus, ellers er det tilstrækkeligt at bruge software autofokus alene.
7. Start erhvervelse og tilsyn for de to første køb cykler. Mikroskopet vil fokusere på histon H2-GFP signal, med efterfølgende erhvervelse af et første billede i den pågældende kanal før filteret ændres, og den tilsvarende TMR stjerne billedet er erhvervet (fig. 3). Dette gentages for alle positioner inden for en brønd, og for hver af de brønde, der skal undersøges, før gentagelse igen den næste cyklus.

4. Analyse af proteolytiske profiler usynge Scan ^ R

1. Start Scan ^ R Analysis-softwaren og analysere billeder med cellekerner, som visualiseret ved histon H2-GFP, defineret som hovedformål, under anvendelse af en tærskelværdi baseret på signalintensitet og et vendepunkt algoritme for at hjælpe til adskillelse af naboceller. En underobjekt bestående af en kerne med cytoplasmaet bør skabes for TMRstar analyse. (Vigtige egenskaber hovedformål er X og Y positioner, tid og maksimal og gennemsnitlig intensiteter af GFP til hovedformål og den samlede intensitet divideret med område for TMRstar underobjekt.) Denne analyse proces kan tage flere timer på grund af store data mængder.
2. Skifter til sporingstilstand at visualisere underobjekt middel TMR stjerne fluorescensintensitet med tiden (celle spor), tildeles de analyserede store objekter (figur 4). Antallet af celler, der skal undersøges, kan indsnævres ved gating på disse målinger varighed mindst 140 cykler og med en høj maksimal intensitet på H2-GFP. Served større antal celler tillader en første repræsentant og objektiv (fig. 4).
3. Markere en celle spor af interesse at visualisere histon H2-GFP og TMR stjerne fluorescens samtidig på enkeltcelle-niveau (figur 5A).
4. Brug den rigtige museklik på en celle af interesse og generere en eksporteres billedgalleri til illustration af histon H2-GFP og cyclin B-SNAP TMR stjerne for hver enkelt tidspunkt.
5. Skift til befolkningen tilstanden af Scan ^ R Analysis software og gate det område, hvor cellen af interesse er repræsenteret i X versus Y dot-plot (fig. 5B).
6. Anvende et nyt dot-plot vindue til gated region og visualisere betyder TMR stjerne fluorescensintensiteten med tiden (figur 5C).
7. Eksporter data (tid og fluorescensintensitet) til Microsoft Excel til videre beregning.

5. Repræsentative resultater

Figure 5D og 5E viser cyclin B kinetik, ved en TMR stjerne fluorescensintensitet kurve, af en celle, der fortsætter gennem en regelmæssig mitose uden tegn på kromosomalt forskydning (fig. 5E). Ved komprimering af cytoplasmaet efter kernemembranen opdeling (NEBD, som indikeret ved rød trekant), viser TMR stjerne fluorescensintensitet en brat stigning indtil isomorf vindue (lysere område i diagrammet) nås, når cellen træder ind prometaphase ^6. Fluorescensintensitet forbliver på et stabilt niveau, så længe cellen fortsætter gennem profase og metafase og derefter begynder at falde hurtigt efter alle kromosomerne har etableret en stabil metafase plade (figur 5D og 5E). Denne drop forud kromosom adskillelse under anaphase (blå prik på kurven). I slutningen af ​​mitose kromatin begynder at decondense (blå søjler) og cellen vedtager interfase morfologi mens fluorescensintensiteten kurven nærmer sig enplateau, som er lavere end plateau før mitose (fig. 5D og 5E).

Tabel 1. Standardindstillinger, som anvendes til analyse af cyclin B proteolyse. Histon-H2-GFP blev anvendt som reference struktur til at definere fokusplan for måling af cyclin B-SNAP fluorescensintensitet. Lysintensiteter under fokusering procedure er lavere sammenlignet med billedoptagelse indstillinger for at undgå kumulativ fototoksicitet.

Figur 1. Skematisk af målingen af cyclin B proteolyse ved ekspression af et kimært cyclin B derivat med nedbrydning egenskaber svarende til det endogene protein. Nedgangen i fluorescensintensitet efter puls-chase mærkning er et mål for APC / C-aktivitet.

Figur 2. Analyse af celler på 8 brønde dias eller plader med 96 brønde. Jævn fordeling afceller på tværs af overfladen af ​​brønden opnås ved resuspendering i et slutvolumen på 300 gl og anbefales, hvis kun et enkelt eller enkelte positioner manuelt er defineret til analyse. Berigelse af celler i midterområdet opnås ved tilsætning af celler til midten af ​​fyldte eller tomme brønde. Denne teknik anbefales i tilfælde af elektronisk billedoptagelse i forskellige brønde.

Figur 3. Sekvens af dataopsamling. A) Påvisning af histon H2-GFP bruges til fokusplan definition og overvågning af kromosomale tilpasning under mitose. B) Fluorescensintensitet for TMR stjerne fluorescensintensitet er et mål for den absolutte mængde af puls-chase mærket cyclin B-SNAP.

Figur 4. Repræsentant Scan ^ R Analysis software-baserede skildring af gennemsnitlig TMR stjernefluorescensintensiteter (total TMRstar intensitet divideret med areal) over tid. Valg af en repræsentant celle spor (blå). De tilsvarende billeder (vist til højre) giver samtidig visualisering af histon H2-GFP (grøn) og cyclin B-SNAP (rød). Klik her for at se større figur .

Figur 5. A + B) Eksempel på gating af prikker, der repræsenterer en celle af interesse på XY-dot-plot. C) Visualisering af den gennemsnitlige TMRstar fluorescensintensitet (total TMRstar intensitet divideret med areal) over tid ved hjælp af dot-plot. D + E) Repræsentant fluorescensintensitet kurven for cyclin B-SNAP med isomorf vindue (brigher felt på diagrammet) mellem NEBD (cellekernekappen fordeling) og chromatin dekondensering (blå bjælke) som genereres i Microsoft Excel. Anafase er angivet med than blå prik på kurven. Klik her for at se større figur .

Movie 1. Klik her for at se supplerende film .

Discussion

Vi præsenterer her en live-cell imaging tilgang letter samtidig overvågning af cyclin B proteolyse og kromosom tilpasning. Denne tilgang gør det muligt at studere mitotisk kontrol i uperturberede cellepopulationer på enkelt celle niveau. Cyclin B nedbrydning kurver lette direkte indsigt i aktiviteten af APC / C og dermed indirekte afspejler status for SAC ^6.

Denne fremgangsmåde, selvom fastsat ud fra den Scan ^ R-software, nemt kan reproduceres på nogen sammenlignelig mikroskop station. Endvidere betyder anvendelsen af ​​vores retroviral cyclin B-SNAP-ekspressionskonstruktion, kan en reporter cellelinie let fastslås af stabile retroviral integration i enhver ønsket cellelinie. For at gøre systemet endnu mere fleksibelt, kan de kimære SNAP proteiner farves med forskellige fluorochromer.

Gennemførelsen af ​​histon H2-GFP, foruden sit krav i overvågningen kromosom tilpasning, facilitates hurtig og nem autofokusering. Autofokus og intensitetsindstillingerne afhænger også af den type celle og skal etableres for hver cellelinje. Købet af proteolytiske profiler af et stort antal celledelinger bruger Scan ^ R teknologi desuden tilladt os at vælge for enlige mitose, som viste kromosom justeringsfejl. Dette gjorde det muligt at definere forskelle mellem de proteolytiske profiler for afvigende og regelmæssig divisioner ^6.

Mitose viser kromosomal forskydning kan også vælges ved analyse af rå billedstakke, selv om dette er mindre tid-effektiv. Cyclin B-SNAP fluorescensintensiteter kan kvantificeres ved hjælp af freeware-programmer til billedbehandling analyse såsom ImageJ. Fluorescensintensitet kurver kan beregnes ud fra den gennemsnitlige pixelintensitet over tid inden for et område / gate definerer den mitotiske celler (teknikken beskrevet af Wolthuis et al. ^11). Inden for en isovolumetrisk vindue, som har været beskrived hidtil ^6, formen og mængden af cellen forbliver næsten konstant. Dette giver en begrundelse for at anvende det samme område / gate mellem nuklear kuvert opdeling indtil begyndelsen anaphase til måling af gennemsnitlige pixel intensiteter for manuelt at estimere cyclin B proteolyse under prometaphase, metafase og tidlig anaphase.

Brug af Scan ^ R tilgang, yderligere matematiske analyser af nedbrydnings-kurver ved hjælp af særlig software, såsom Microsoft Excel, kræver gating på enkelt celle niveau. Innovative gating strategier til at tillade automatiseret data eksport af alle analyserede celler kunne lette en mere tidsbesparende analyse af hele cellepopulationer. En fuldt automatiseret metode, der dækker alle celle spor kan føre til mere repræsentative resultater, yderligere forbedre præcisionen af ​​denne teknik og dermed lette dybere indsigt i reguleringen af ​​mitotisk exit.

Hurtig og effektiv automatiseret billedanalyse opkøbet får vores model to anvendes i stor målestok screeningsanalyser. Her kan skærme med shRNA bibliotekerne føre til identifikation af nye mitotiske tilsynsmyndigheder. Desuden bør systemet være nyttige ved screening af små molekyler med hensyn til deres styrke i interferere med APC / C-afhængig proteolyse for at finde nye lægemidler til antimitotisk behandling.

Cyclin B kinetik har været almindeligt behandlet ved at overvåge cyclin B-GFP-fluorescensintensiteter. Her præsenterer vi et system, der gør det lettere at afgrænsningen af cyclin B proteolyse fra hele proteinekspression og derfor udgør en værdifuld ændring udbredte teknikker i mitose feltet ^6.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for S. Taylor for at tilvejebringe den pLPCX-histon H2-GFP plasmid. Vi takker R. Mertelsmann til kontinuerlig support. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Materials

Autofokus-indstillinger	Histon H2-GFP (hovedformål erhvervelse indstillinger)	Cyclin B-SNAP mærket med TMR stjerne (Erhvervelse indstillinger)	Acquisition cyklustid Repetitions
Grov autofokus + / -39 um 24 Lag Fin autofokus + / -5,4 Um 14 Lag	GFP filter indstilles: Ekspositionsvarighed: 100 ms Lys intensitet: 25%	TRITC filter indstilles: Ekspositionsvarighed: 150 ms Lys intensitet: 33,3%	2-5 min.
GFP filter indstilles: Ekspositionsvarighed: 12 ms Lys intensitet: 12,5%			Op til 48 h med fortsat analyse (begrænset af reduceret luftfugtighed på 60%)

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reporter cell line	generated in-house as described 6	clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells)
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector	generated in-house as described 6	pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred-free DMEM	Gibco	21063-029	Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Stock solution 400 μM in DMSO
Special Opstics Plate, 96 well	Costar	3720
μ-Slide 8 well, ibiTreat	Ibidi	80826
Microscopy unit	Olympus	IX-81 inverse microscope with climate chamber
Objective	Olympus	UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75)
Acquisition software	Olympus	Scan^R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software	Olympus	Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6)