Studerer proteolyse av Cyclin B på Single Cell nivå i hele cellepopulasjoner

Summary

Metafase å anaphase overgang utløses gjennom anaphase-fremme kompleks (APC / C)-avhengig ubiquitinering og påfølgende ødeleggelse av cyclin B. Her har vi etablert et system som etter puls-chase merking, tillater overvåking cyclin B proteolyse i hele cellepopulasjoner og forenkler påvisning av forstyrrelse fra mitotiske sjekkpunkt.

Abstract

Jevn fordeling av kromosomene mellom de to dattercellene ved celledeling er en forutsetning for å garantere genetisk stabilitet ^1. Unøyaktigheter under kromosom separasjon er et kjennetegn på malignitet og assosiert med progressiv sykdom ^2-4. Spindelen forsamlingen sjekkpunkt (SAC) er en mitotisk overvåking mekanisme som holder tilbake cellene ved metafase til hver enkelt kromosom har etablert en stabil bipolar vedlegg til mitotisk spindel ^en. SAC utøver sin funksjon ved forstyrrelser med aktiverende APC / C subenhet Cdc20 å blokkere proteolyse av securin og cyclin B og dermed kromosom separasjon og mitotisk exit. Feil montering av kromosomer hindrer stanse SAC signalering og forårsaker fortsatt hemming av APC / C ^Cdc20 til problemet er løst, for å unngå kromosom missegregation, Aneuploidy og ondartede vekster ^en.

De fleste studier som er adressert til jegnfluence av feil kromosomal feste på APC / C-avhengige proteolyse tok fordel av spindel avbrudd med depolymerizing eller microtubule-stabiliserende medikamenter for å forstyrre kromosomal vedlegg til mikrotubuli. Siden forstyrrelser microtubule kinetikk kan påvirke transport og lokalisering av kritiske regulatorer, disse prosedyrene bære en risiko for å indusere kunstige effekter ^5.

Å studere hvordan SAC forstyrrer APC / C-avhengige proteolyse av cyclin B under mitose i uaffisert cellepopulasjoner, etablerte vi en histone H2-GFP-basert system som tillot samtidig overvåking av metafase justering av mitotiske kromosomer og proteolyse av cyclin B ⁶ .

Å skildre proteolytiske profiler genererte vi et kimært cyclin B reporter molekyl med en C-terminal SNAP moiety ⁶ (figur 1). I en selv-merking omsetningen er den SNAP-moiety stand til å danne kovalente bindinger medalkylguanine-bærere (SNAP substrat) ^7,8 (figur 1). SNAP substratmolekyler er lett tilgjengelig og har et bredt spekter av forskjellige fluorokromer. Kimære cyclin B-SNAP molekyler blir merket ved tilsetning av den membran-gjennomtrengelige SNAP substrat til vekstmediet ⁷ (figur 1). Etter merking reaksjonen synker cyclin B-SNAP fluorescensintensitet i et puls-chase reaksjon-aktig måte og fluorescensintensiteter reflekterer nivåene av cyclin B degradering ⁶ (figur 1). Vårt system forenkler overvåking av mitotiske APC / C-avhengig proteolyse i et stort antall celler (eller flere cellepopulasjoner) i parallell. Dermed kan systemet være et verdifullt verktøy for å identifisere agenter / små molekyler som er i stand til å forstyrre proteolytisk aktivitet på metafase å anaphase overgang. Videre har som syntese av cyclin B under mitose nylig blitt foreslått som en viktig mechanism for å fremme en mitotisk blokk i mus og mennesker ved å holde cyclin B uttrykk nivåer stabil ^9,10, aktivert dette systemet å analysere cyclin B proteolyse som en del av et balansert likevekt ^6.

Protocol

1. Seeding av U2OS-baserte cyclin B-SNAP Reporter Cells (Clone 11 Cells ⁶⁾ på mikroskop Chamber Slides

1. Trypsinize subconfluent SNAP reporter celler som ble tillatt å vokse asynkront i loggen fase i minst 48 timer.
2. Arbeide med 8 vel mikroskop kamre (konstant fordeling av celler).

For såing av cellene bort 8 brønnen mikroskop kamre på en konstant fordeling over hele overflaten av mikroskopet kammeret, sentrifuge 10.000 celler og resuspender i 350 pl fenol rød-fri normal vekst medium (supplert med 10% føtalt bovint serum, penicillin / streptomycin og natrium pyruvat). Overføre cellesuspensjon til mikroskopet kammeret (figur 2).

Arbeide med 8 vel mikroskop kamre (maks celletetthet i midten).

For såing av cellene ved en høyere tetthet i midten av mikroskopet Chambeh, last i kammeret med 300 pl fenol rød-fri normal vekstmedium. Legg 5.000 celler forsiktig til midten av mikroskopet kammeret (figur 2).

Arbeide med 96 godt spesielle optikk plater (konstant fordeling av celler).

For såing av cellene bort på 96 brønners plater ved en konstant fordeling over hele overflaten av brønnen, sentrifuger 5000 celler og resuspender i 300 pl fenol rød-fri normal vekstmedium. Overfør cellesuspensjonen til en 96-brønns plate. Avhengig av det totale antall celler som inneholder brønner kreves, juster cellenummer og det totale volumet av det suspensjonsmedium (Figur 2).

Arbeide med 96 godt spesielle optikk plater (maks celletetthet i midten).

For såing av cellene bort på 96 brønners plater, tilsett forsiktig 1500 celler i 15 pl fenol rød-fri normal vekst medium i en small dråpe til midten av hver brønn for å oppnå begrensning av cellevekst til midten av brønnen (figur 2).

3. Tillat seeded celler til å vokse i minst 18 timer under standard celle dyrkningsbetingelser (37 ° C, 100% luftfuktighet og 5% CO _2).

2. Farging av Reporter Cells med SNAP Substrat

1. 30 min før begynnelsen av fargingsreaksjonen prosedyren tillater aliquoter av fenolrødt-fri normal dyrkningsmedium å varme opp til 37 ° C.
2. For enkel håndtering av SNAP substrat (i vårt tilfelle TMR Star) oppløse TMR Star i DMSO for å oppnå en konsentrasjon i stamløsningen av 400 uM, som kan lagres ved -20 ° C.
3. Før farging, fortynne 0,5 ul TMR stjerne stamoppløsning i 200 ul fenol rød-fri normal vekst medium (37 ° C) for å oppnå en endelig konsentrasjon på merking 1 uM.
4. Fjern normal vekst medium fra de asynkront voksende celler og inkuber i labeling medium for 25 min under standard kultur forhold.
5. Fjern merking mellomstore og vask cellene fire ganger med fenol rød-fri normal vekst medium (37 ° C). Inkuber celler i 300 pl fenol rød-fri normal vekst medium (37 ° C) i 30 min. Før transport til mikroskopet erstatte mediet med fersk fenolrødt-fri normal vekst medium (37 ° C) for å fjerne resterende ubundet SNAP substrat.
6. Transport celler til mikroskopet i en styrofoam boksen på en forvarmet (37 ° C) varme blokk for å minimere temperatursvingninger.

3. Måling av fluorescensintensitet

1. To timer før analysen justere lufttemperaturen av klimaet kammeret til 37 ° C i tørr-modus for å bringe hele mikroskop med alle sine komponenter til ønsket temperatur. Forvarming før innstillingen luftfuktigheten er viktig for å unngå kondensasjon og påfølgende skade på mikroskopet.
2. Juster luftfuktigheten to 60% og CO _2-5% før starten av analysen.
3. Start Scan ^ R Acquisition programvare og definere standard innstillinger (se tabell 1).
4. Definer posisjonene til brønnene som skal analyseres.
5. Definer DT (kjøp syklus tid) og det absolutte antallet oppkjøp sykluser.
6. Hvis analyse av et høyere antall brønner er ønskelig, velge maskinvare autofokus, ellers er det tilstrekkelig å bruke programvare autofokus alene.
7. Start oppkjøp og tilsyn for de to første oppkjøp sykluser. Mikroskopet vil fokusere på histon H2-GFP signal, med senere kjøp av et første bilde i den kanalen før filteret endres og den tilsvarende TMR stjerne bildet tas (Figur 3). Dette gjentas deretter for alle posisjoner innenfor en brønn og for hver av brønnene for å bli undersøkt, før gjentatt på nytt neste syklus.

4. Analyse av Proteolytisk profiler usynge Scan ^ R

1. Start Scan ^ R Analyseprogram og analysere bildene med cellekjerner, som visualisert etter histon H2-GFP, definert som hovedformål, ved hjelp av en terskel basert på signalintensitet og et vannskille algoritme for å bistå i separering nabocellene. En subobject bestående av en kjerne med cytoplasma bør opprettes for TMRstar analyse. (Viktige egenskaper hovedformål er X og Y posisjonene, tid og maksimal og gjennomsnittlig intensiteter av GFP til hovedformål og den totale intensiteten dividert område for TMRstar subobject.) Denne analysen kan ta flere timer på grunn av store data mengder.
2. Endre til spore-modus for å visualisere subobject middelverdien TMR stjerne fluorescens intensitet over tid (celle spor), tilordnet de analyserte viktigste gjenstander (figur 4). Antall celler som skal undersøkes kan bli redusert ned etter gating på disse målingene varer minst 140 sykluser og med en høy maksimal intensitet av H2-GFP. Serpå større antall celler tillater en første representant og objektiv visning (figur 4).
3. Velge en celle spor av interesse å visualisere histon H2-GFP og TMR stjerne fluorescens samtidig på enkelt celle-nivå (figur 5A).
4. Bruke høyre museklikk på en celle av interesse og generere en eksportvare bildegalleri for illustrasjon av histone H2-GFP og cyclin B-SNAP TMR stjerne for hver enkelt tidspunkt.
5. Bytt til befolkningen modus på Scan ^ R Analyse programvare og gate regionen hvor cellen av interesse er representert på X vs Y prikkplott (figur 5B).
6. Påfør et nytt prikkplott vinduet til gated regionen og visualisere betyr TMR stjerne fluorescens intensitet over tid (Figur 5C).
7. Eksportere data (tid og fluorescens intensitet) til Microsoft Excel for videre beregning.

5. Representant Resultater

Figure 5D og 5E skildre cyclin B kinetikk, representert ved en TMR stjerne fluorescensintensitet kurve, av en celle som fortsetter gjennom en vanlig mitose uten tegn på kromosomal feiljustering (figur 5E). Ved komprimering av cytoplasma etter kjernefysiske konvolutt sammenbrudd (NEBD, som indikert ved den røde trekanten), viser TMR stjerne fluorescensintensitet en brå økning inntil isomorf vinduet (lysere område i diagrammet) nås når cellen trer prometaphase ^6. Fluorescensintensitet holder seg på et stabilt nivå så lenge cellen går gjennom profase og metafase og deretter begynner å falle raskt når alle kromosomene har etablert en stabil metafase plate (figur 5D og 5E). Denne nedgangen kommer før kromosom separasjon under anaphase (blå prikk på kurven). I slutten av mitose kromatin begynner å decondense (blå søyler) og cellen vedtar interfase morfologi mens fluorescensintensiteten kurven nærmer seg enplatå som er lavere enn platå før mitose (Figur 5D og 5E).

Tabell 1. Standard innstillinger som brukes til analyse av cyclin B proteolyse. Histone H2-GFP ble brukt som en referanse for å definere strukturen fokusplanet for måling av cyclin B-SNAP fluorescensintensitet. Lysintensiteter under fokusering prosedyren er lavere i forhold til bildetakingsenheter innstillingene for å unngå kumulative fototoksisitet.

Figur 1. Skjematisk av måling av cyclin B proteolyse gjennom ekspresjon av et kimært cyclin B derivat med nedbrytningsproduktene egenskaper som ligner på det endogene protein. Nedgangen i fluorescensintensitet etter puls-chase merking er et mål på APC / C-aktivitet.

Figur 2. Analyse av celler på 8 brønnen lysbilder eller 96-brønners plater. Regelmessig fordeling avceller over overflaten av brønnen oppnås ved resuspensjon i et endelig volum på 300 ul og anbefales, hvis bare en enkelt eller noen få posisjoner manuelt definert for analyse. Anrikning av celler i sentrum regionen oppnås ved tilsetning av celler til sentrum av forhåndsfylte eller tomme brønner. Denne teknikken er anbefalt ved automatisert image oppkjøpet i forskjellige brønner.

Figur 3. Sekvens av datainnsamling. A) Påvisning av histon H2-GFP brukes for fokusplanet definisjon og overvåking av kromosomal justering under mitose. B) Fluorescence intensiteten av TMR stjerne fluorescensintensiteten er et mål for den absolutte mengden av puls-chase merket cyclin B-SNAP.

Figur 4. Representant Scan ^ R Analyse programvarebasert skildring av gjennomsnittlig TMR stjernefluorescensintensiteter (totalt TMRstar intensitet delt på areal) over tid. Valg av en representant celle spor (blå). De tilsvarende bilder (vist til høyre) la samtidig visualisering av histone H2-GFP (grønt) og cyclin B-SNAP (rød). Klikk her for å se større figur .

Figur 5. A + B) Eksempel på gating av prikker som representerer en celle av interesse på XY-prikkplott. C) Visualisering av gjennomsnittet TMRstar fluorescensintensiteten (total TMRstar intensitet delt på areal) over tid ved hjelp av prikkplott. D + E) Representant fluorescensintensitet kurve av cyclin B-SNAP med isomorf vindu (brigher feltet i figuren) mellom NEBD (kjernefysisk konvolutt sammenbrudd) og kromatin decondensation (blå strek) som genereres i Microsoft Excel. Anaphase indikeres av than blå prikk på kurven. Klikk her for å se større figur .

Movie 1. Klikk her for å se supplerende filmen .

Discussion

Vi presenterer her en live-cell imaging tilnærming tilrettelegge samtidig overvåking av cyclin B proteolyse og kromosom justering. Denne fremgangsmåten gjør at studiet av mitotiske kontroll i uaffisert cellepopulasjoner på enkelt celle-nivå. Cyclin B degraderingsprodukter kurver rette direkte innsikt i aktiviteten av APC / C og dermed indirekte avspeile statusen av SAC ^6.

Denne tilnærmingen, selv om etableres basert på Skann ^ R programvare, kan lett reproduseres på ethvert sammenlignbart mikroskop stasjon. Videre, ved hjelp av vår retroviral cyclin B-SNAP uttrykk konstruere, kan en reporter cellelinje lett etableres av stabile retrovirale integrering i enhver ønsket cellelinje. For å gjøre systemet enda mer fleksibelt, kan de chimeriske SNAP proteiner være farget med ulike fluorokromer.

Gjennomføringen av histone H2-GFP, foruten dens krav i overvåking kromosom innretting, facilitates rask og enkel autofokusering. Autofokus og styrkeinnstillinger også avhenge type celle og må etableres for hver cellelinje. Oppkjøpet av proteolytiske profiler av et stort antall celledelinger med Scan ^ R teknologi videre tillatt oss å velge for enkle mitoses, som viste kromosom feil i opprettingen. Dette gjorde oss i stand til å definere forskjellene mellom de proteolytiske profiler av avvikende og regelmessig divisjoner ^6.

Mitoses viser kromosomal forskyvning kan også velges ved analyse av rå image stabler, selv om dette er mindre tidkrevende. Cyclin B-SNAP fluorescensintensiteter kan kvantifiseres ved hjelp freeware-programmer for bildeanalyse som ImageJ. Fluorescensintensitet kurver kan beregnes basert på den midlere pikselintensiteten over tid innenfor et område / gate definerer mitotiske celle (teknikk beskrevet av Wolthuis m.fl.. ^11). Innenfor en isovolumetric vindu, som har vært beskrived tidligere ^6, formen og volumet av cellen forblir nesten konstant. Dette gir en begrunnelse for å bruke det samme området / gate mellom kjernefysisk konvolutt sammenbrudd før tidlig anaphase for måling gjennomsnittlig pixel intensiteter å manuelt beregne cyclin B proteolyse under prometaphase, metafase og tidlig anaphase.

Bruke Scan ^ R-tilnærming, krever ytterligere matematiske analyser av nedbrytningsprodukter kurver med spesifikk programvare, for eksempel Microsoft Excel, gating på enkelt celle-nivå. Innovative gating strategier for å tillate automatisert data eksport av alle analyserte celler kan rette en mer tidseffektive analyse av hele cellepopulasjoner. En helautomatisk tilnærming som dekker alle celle spor kan føre til mer representative resultater, ytterligere styrke presisjon av denne teknikken og dermed legge til rette for dypere innsikt i regulering av mitotisk exit.

Rask og effektiv automatisert image oppkjøpet gjør vår modell to benyttes i stor skala screening analyser. Her kan skjermer bruker shRNA bibliotekene føre til identifisering av nye mitotiske regulatorer. Videre bør systemet være nyttig for screening små molekyler med hensyn til potens deres i forstyrrer APC / C-avhengig proteolyse for å identifisere nye medikamenter for antimitotic terapi.

Cyclin B kinetikk har blitt mye løses ved å overvåke cyclin B-GFP fluorescensintensiteter. Her presenterer vi et system som gjør det mulig avgrensning av cyclin B proteolyse fra hele protein uttrykk og utgjør derfor en verdifull endring i utbredte teknikker i mitose felt ^6.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for S. Taylor for å gi pLPCX-Histone H2-GFP plasmid. Vi takker R. Mertelsmann for kontinuerlig støtte. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Materials

Autofokus innstillinger	Histone H2-GFP (hovedformål kjøp innstillinger)	Cyclin B-SNAP merket med TMR stjerne (Kjøp innstillinger)	Oppkjøp syklus tid repetisjoner
Grov autofokus + / -39 mikrometer 24 lag Fin autofokus + / -5,4 Mikrometer 14 lag	GFP filter satt: Eksponeringstid: 100 msek Lysintensitet: 25%	TRITC filter satt: Eksponeringstid: 150 ms Lysintensitet: 33,3%	2-5 min.
GFP filter satt: Eksponeringstid: 12 ms Lysintensitet: 12,5%			Opptil 48 hr av fortsatt analyse (begrenset av redusert luftfuktighet på 60%)

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reporter cell line	generated in-house as described 6	clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells)
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector	generated in-house as described 6	pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred-free DMEM	Gibco	21063-029	Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Stock solution 400 μM in DMSO
Special Opstics Plate, 96 well	Costar	3720
μ-Slide 8 well, ibiTreat	Ibidi	80826
Microscopy unit	Olympus	IX-81 inverse microscope with climate chamber
Objective	Olympus	UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75)
Acquisition software	Olympus	Scan^R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software	Olympus	Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6)