Summary
संक्रमण Anaphase Anaphase जटिल (APC / सी) पर निर्भर ubiquitination और cyclin बी के बाद यहाँ विनाश को बढ़ावा देने, हम एक प्रणाली है, जो नाड़ी - पीछा लेबलिंग के बाद स्थापित, पूरे सेल आबादी में cyclin बी proteolysis निगरानी की अनुमति देता है और के माध्यम से शुरू हो रहा है मेटाफ़ेज़ mitotic जांच की चौकी से हस्तक्षेप का पता लगाने की सुविधा है.
Protocol
1. माइक्रोस्कोप चैंबर स्लाइड पर U2OS आधारित Cyclin बी SNAP रिपोर्टर कोशिकाओं (क्लोन 11 प्रकोष्ठों 6) की सीडिंग
- Trypsinize subconfluent SNAP संवाददाता कोशिकाओं है कि asynchronously लॉग चरण में कम से कम 48 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी गई है.
- 8 अच्छी तरह खुर्दबीन कक्षों (कोशिकाओं के निरंतर वितरण) के साथ कार्य करना.
8 अच्छी तरह खुर्दबीन कक्षों पर कोशिकाओं की खुर्दबीन कक्ष की पूरी सतह, अपकेंद्रित्र 10,000 कोशिकाओं भर में एक निरंतर वितरण और phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास के 350 μl (10% भ्रूण गोजातीय सीरम पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में बोने resuspend सोडियम और पाइरूवेट). खुर्दबीन चैम्बर (2 चित्रा) सेल निलंबन स्थानांतरण.
8 अच्छी तरह खुर्दबीन कक्षों (केंद्र में अधिकतम घनत्व सेल) के साथ कार्य करना.
एक उच्च घनत्व पर कोशिकाओं का खुर्दबीन chamb के केंद्र में बोने के लिएएर, phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास के 300 μl के साथ कक्ष लोड. 5000 कोशिकाओं ध्यान से जोड़ें खुर्दबीन के चैम्बर के केंद्र (2 चित्रा).
96 अच्छी तरह से विशेष प्रकाशिकी प्लेट (कोशिकाओं की निरंतर वितरण) के साथ कार्य करना.
अच्छी तरह से पूरी सतह भर में एक निरंतर वितरण में कोशिकाओं के साथ 96 प्लेटों पर बोने के लिए, 5000 कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास के 300 μl में resuspend. एक 96 अच्छी तरह से थाली सेल निलंबन स्थानांतरण. सेल युक्त आवश्यक कुओं की कुल संख्या पर निर्भर करता है, सेल नंबर और निलंबन मध्यम (2 चित्रा) की कुल मात्रा समायोजित करें.
96 अच्छी तरह से विशेष प्रकाशिकी प्लेट (केंद्र में अधिकतम घनत्व सेल) के साथ कार्य करना.
कोशिकाओं के साथ 96 प्लेटों पर बोने के लिए, ध्यान phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास के 15 μl में एक smal में 1,500 कोशिकाओं जोड़नेएल सेल के विकास का प्रतिबंध अच्छी तरह के केंद्र (2 चित्रा) को प्राप्त करने के लिए एक अच्छी तरह से केंद्र के लिए ड्रॉप.
- वरीय कोशिकाओं को कम से कम 18 घंटे के लिए मानक सेल संस्कृति शर्तों (37 डिग्री सेल्सियस, 100% हवा नमी, 5% सीओ 2) के तहत विकसित करने के लिए अनुमति दें.
2. तस्वीर सब्सट्रेट के साथ रिपोर्टर प्रकोष्ठों के धुंधला हो जाना
- धुंधला प्रक्रिया की शुरुआत करने से पहले 30 मिनट phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास की aliquots 37 के लिए गर्म करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस
- तस्वीर सब्सट्रेट के आसान से निपटने के लिए (हमारे मामले TMR स्टार में) TMR स्टार DMSO में भंग करने के लिए 400 सुक्ष्ममापी स्टॉक समाधान, जो -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है में एक एकाग्रता प्राप्त
- धुंधला पहले, phenol लाल मुक्त सामान्य वृद्धि मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) 1 सुक्ष्ममापी की एक अंतिम लेबलिंग एकाग्रता प्राप्त करने के 200 μl में TMR स्टार स्टॉक समाधान के 0.5 μl पतला.
- Asynchronously बढ़ कोशिकाओं से सामान्य वृद्धि मध्यम निकालें और एल में सेते हैंमानक संस्कृति शर्तों के तहत 25 मिनट के लिए मध्यम abeling.
- मध्यम और धोने कोशिकाओं phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ चार बार लेबलिंग निकालें. Phenol लाल मुक्त 30 मिनट के लिए सामान्य मध्यम विकास (37 डिग्री सेल्सियस) के 300 μl में कोशिकाओं सेते हैं. पहले माइक्रोस्कोप परिवहन करने के लिए ताजा phenol लाल मुक्त सामान्य मध्यम विकास (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ मध्यम जगह अवशिष्ट अनबाउंड SNAP सब्सट्रेट हटा.
- एक पूर्व गर्म पर एक स्टायरोफोम बॉक्स में माइक्रोस्कोप परिवहन कोशिकाओं (37 डिग्री सेल्सियस) गर्मी तापमान परिवर्तन को कम करने के लिए ब्लॉक.
3. प्रतिदीप्ति तीव्रता का मापन
- विश्लेषण करने के लिए पहले दो घंटे 37 ° C सूखी मोड में जलवायु चैम्बर के हवा के तापमान को समायोजित क्रम में वांछित तापमान के लिए अपने सभी घटकों के साथ पूरे माइक्रोस्कोप लाने. पूर्व हीटिंग नमी स्थापित करने से पहले संक्षेपण और बाद खुर्दबीन के लिए क्षति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
- हवा में नमी टी समायोजितओ 60% और सीओ 2 से 5% के विश्लेषण के शुरू करने के लिए पहले.
- स्कैन ^ आर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू और मानक सेटिंग (1 टेबल देखें) को परिभाषित करें.
- कुओं की स्थिति को परिभाषित करने के लिए विश्लेषण किया जा.
- Δt (अधिग्रहण चक्र समय) और अधिग्रहण चक्र की निरपेक्ष संख्या को परिभाषित करें.
- यदि कुओं के एक उच्च संख्या के विश्लेषण वांछित है, हार्डवेयर autofocus का चयन करें, अन्यथा यह सॉफ्टवेयर autofocus अकेले इस्तेमाल करने के लिए पर्याप्त है.
- अधिग्रहण के आरंभ और पहले दो अधिग्रहण चक्र के लिए की निगरानी. माइक्रोस्कोप histone H2-GFP संकेत पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, उस चैनल में पहली छवि के बाद अधिग्रहण के साथ पहले फिल्टर बदल गया है और इसी TMR स्टार छवि (3 चित्रा) का अधिग्रहण किया है. यह तो एक अच्छी तरह से भीतर और जांच की जा कुओं में से प्रत्येक के लिए सभी पदों के लिए दोहराया है, फिर अगले चक्र दोहरा से पहले,.
4. Proteolytic प्रोफाइल यू के विश्लेषणस्कैन ^ आर गाना
- प्रारंभ स्कैन ^ आर विश्लेषण सॉफ्टवेयर और सेल नाभिक के साथ छवियों का विश्लेषण, के रूप में histone H2 GFP, मुख्य उद्देश्य के रूप में परिभाषित द्वारा visualized, एक संकेत तीव्रता और पड़ोसी कोशिकाओं को अलग करने में सहायता करने के लिए एक जल एल्गोरिथ्म पर आधारित सीमा का उपयोग कर. Cytoplasm के साथ एक नाभिक से मिलकर एक subobject TMRstar विश्लेषण के लिए बनाया जाना चाहिए. (मुख्य उद्देश्य के महत्वपूर्ण गुण एक्स और वाई पदों, समय, और अधिकतम और GFP की मुख्य उद्देश्य और कुल TMRstar subobject के लिए क्षेत्र से विभाजित तीव्रता के लिए तीव्रता मतलब है.) इस विश्लेषण की प्रक्रिया में कई बड़े डेटा की वजह से घंटे लग सकते हैं मात्रा में.
- मोड का पता लगाने के लिए subobject मतलब समय पर TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता (सेल निशान), विश्लेषण मुख्य वस्तुओं (4 चित्रा) को सौंपा कल्पना बदलें. जांच की कोशिकाओं की संख्या उन लोगों के कम से कम 140 चक्र स्थायी माप पर gating और H2 GFP की एक उच्च अधिकतम तीव्रता के साथ नीचे संकुचित किया जा सकता है. देख रहे हैंकोशिकाओं की बड़ी संख्या में पहली बार एक प्रतिनिधि और उद्देश्य दृश्य (4 चित्रा) की अनुमति देता है.
- एकल कोशिका के स्तर (चित्रा 5A) में histone H2 GFP और TMR स्टार प्रतिदीप्ति एक साथ कल्पना के लिए ब्याज की एक सेल का पता लगाने का चयन करें.
- ब्याज की एक सेल पर सही माउस क्लिक का प्रयोग और histone H2 GFP और cyclin बी SNAP हर समय बिंदु के लिए TMR स्टार के चित्रण के लिए एक निर्यात तस्वीर गैलरी उत्पन्न.
- स्कैन ^ आर विश्लेषण सॉफ्टवेयर और गेट क्षेत्र है जहां ब्याज की सेल एक्स बनाम वाई डॉट साजिश (चित्रा 5 ब) पर प्रतिनिधित्व किया है की जनसंख्या मोड में बदलें.
- Gated क्षेत्र के लिए एक नया डॉट साजिश विंडो लागू करते हैं और समय के साथ TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 5C) मतलब कल्पना.
- Microsoft Excel में निर्यात (समय और प्रतिदीप्ति तीव्रता) आगे की गणना के लिए डेटा.
5. प्रतिनिधि परिणाम
अंजीरure 5D और 5E cyclin बी कैनेटीक्स, एक TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता वक्र द्वारा प्रतिनिधित्व एक सेल के को दर्शाती है, है कि गुणसूत्र misalignment के लक्षण (चित्रा 5E) के बिना एक नियमित रूप से पिंजरे का बँटवारा के माध्यम से आय. परमाणु लिफाफा टूटने (NEBD, के रूप में लाल त्रिकोण से संकेत) के बाद cytoplasm के संघनन पर, TMR स्टार प्रतिदीप्ति तीव्रता एक अचानक वृद्धि से पता चलता है जब तक isomorphic खिड़की (चित्र में उज्जवल क्षेत्र) तक पहुँच जाता है जब सेल 6 prometaphase में प्रवेश करती है. प्रतिदीप्ति तीव्रता prophase और मेटाफ़ेज़ सेल के माध्यम से आय के रूप में लंबे समय के रूप में एक स्थिर स्तर पर बनी हुई है और फिर तेजी से एक बार ड्रॉप शुरू होता है गुणसूत्रों की एक स्थिर मेटाफ़ेज़ प्लेट (चित्रा 5D और 5E) की स्थापना की है. यह ड्रॉप पश्चावस्था (वक्र पर नीला डॉट) के दौरान गुणसूत्र जुदाई पछाड़ दिया है. देर से पिंजरे का बँटवारा में chromatin decondense शुरू होता है (नीले सलाखों) और सेल अंतरावस्था आकारिकी adopts जबकि प्रतिदीप्ति तीव्रता वक्र एक दृष्टिकोणजो पठार पिंजरे का बँटवारा (चित्रा 5D और 5E) से पहले पठार की तुलना में कम है.
Autofocus सेटिंग्स | Histone H2 GFP (मुख्य उद्देश्य अधिग्रहण सेटिंग्स) | बी SNAP Cyclin TMR स्टार के साथ लेबल (अधिग्रहण सेटिंग्स) | अधिग्रहण चक्र समय Repetitions |
मोटे autofocus / + -39 सुक्ष्ममापी 24 परतें ठीक autofocus / + -5.4 सुक्ष्ममापी 14 परतें | GFP फिल्टर सेट: एक्स्पोज़र समय: 100 मिसे हल्की तीव्रता: 25% | TRITC फिल्टर सेट: एक्स्पोज़र समय: 150 मिसे हल्की तीव्रता: 33.3% | 2 से 5 मिनट. |
GFP फिल्टर सेट: एक्स्पोज़र समय: 12 मिसे प्रकाश तीव्रता: 12.5% | पर जारी विश्लेषण के 48 घंटे (60% की कम हवा नमी द्वारा सीमित) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
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