Summary
We een methode om cerebrospinale vloeistof (CSF) te verzamelen en een systeem dat CSF mist in de embryonale zebravis hersenen ventriculaire systeem. Dit maakt voor verder onderzoek van CSF samenstelling en de eis tijdens de embryonale ontwikkeling van de hersenen.
Abstract
Cerebrospinale vloeistof (CSF) is een eiwit rijke vloeistof die in de hersenen ventrikels. Het is aanwezig tijdens de vroege gewervelde embryonale ontwikkeling en blijft gedurende het hele leven. Adult CSF wordt gedacht dat de hersenen vangen, afval verwijderen en uitgescheiden moleculen 1,2 dragen. In de volwassen en oudere embryo, de meeste CSF van de choroid plexus, een reeks sterk gevasculariseerde secretorische gebieden die grenzen ligt ten hersenventrikels 3-5. In zebravis, is het vaatvlies plexus volledig gevormd op 144 uur na de bevruchting (HPF) 6. Daarvoor in zowel zebravis embryo's en andere gewervelde waaronder muis, een aanzienlijke hoeveelheid embryonale CSF (ECSF) aanwezig. Deze gegevens en studies over kuiken suggereren dat de neuro-epitheel is secretoire vroeg in de ontwikkeling en kan de belangrijkste bron van ECSF te zijn vóór de choroidea plexus ontwikkeling 7.
ECSF bevat ongeveer drie keer meer eiwit than volwassen CSF, suggereert dat het een belangrijke rol spelen tijdens de ontwikkeling 8,9. Studies in chick en muis aangetoond dat uitgescheiden factoren in de ECSF, vloeistofdruk of een combinatie daarvan, belangrijk zijn voor neurogenese, genexpressie, celproliferatie en celoverleving in het neuroepitheel 10-20. Proteoomanalyse van menselijk, rat, muis en chick ECSF geïdentificeerd vele eiwitten die nodig kunnen zijn voor CSF functie. Deze omvatten extracellulaire matrixcomponenten, apolipoproteïnen, osmotische druk regulerende eiwitten, en eiwitten die betrokken zijn bij celdood en proliferatie 21-24. De ingewikkelde functies van de ECSF grotendeels onbekend.
We hebben een methode ontwikkeld voor het verwijderen van ECSF van zebravis hersenen ventrikels, waardoor voor de identificatie van ECSF componenten en voor de analyse van de ECSF eis tijdens de ontwikkeling. Hoewel er meer ECSF kunnen worden verzameld van andere gewervelde systemen wet grotere embryo's, kan ECSF ophalen in de vroegste stadia van ontwikkeling van de zebravis, en onder genetische of omgevingsfactoren die leiden tot abnormale hersenactiviteit ventrikel volume of morfologie. Verwijdering en het verzamelen van ECSF zorgt voor massaspectrometrische analyse, onderzoek van ECSF functie, en de herintroductie van bepaalde factoren in de ventrikels naar test hun functie. Dus de toegankelijkheid van de vroege zebravis embryo kunnen gedetailleerde analyse van ECSF functie tijdens ontwikkeling.
Protocol
1. Voorbereiden Micro-injectie Naalden en Cell Tram
- Vul Eppendorf CellTram olie microinjector apparaat met minerale olie volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid micro-injectie naalden door te trekken capillaire buizen met behulp van Sutter instrumenten naald trekker.
- Monteer naald op micromanipulator aangesloten Eppendorf CellTram.
- Voorzichtig breken de punt van de naald. Voor een uniforme formaat tip, te meten met een micrometer, of vergelijk met een referentie naald.
- Vul de lengte van de naald met olie, met behulp van de CellTram om olie naar beneden drukken van de lengte en voorzichtig om geen luchtbellen te voorkomen.
2. Voorbereiden van de Embryo's
- Poke gaten in een 1% agarose gecoate schaal met 1-200 pl pipetpunt en verwijder agarose pluggen. Vul schotel met embryo media (gemaakt op basis van Westerfield 25).
- Behulp van een tang, dechorionate embryo's onder stereomicroscoop.
- Overdracht dechorionated embryo'sin agarose gecoate schaal.
- Om embryo verdoven, voeg Tricaine (0,1 mg / ml) aan agarose schotel totdat embryo stopt met bewegen (gemaakt volgens Westerfield 25).
3. Aftappen van de ECSF
- Plaats de embryo's met hun staarten in de gaten van de agarose en de achterste zijde het dichtst bij de micromanipulator, waardoor visualisatie van de dorsale zijde van de hersenen.
- Plaats de naald op de rhombomere 0/1 scharnier-punt of het breedste punt van achterhersenen ventrikel (Figuur 1A).
- Voorzichtig doorboren dakplaat van achterhersenen ventrikel zorg ervoor dat u door middel van de diepte van de hersenen gaan in de dooier.
- Tap de ECSF met behulp van de CellTram en het verzamelen van vloeistof in micro-injectie naald. Wees voorzichtig om alle cellen te voorkomen.
4. Het verzamelen van de ECSF voor Compositie Analyse
- Zodra de ECSF wordt verzameld in de naald, stop voorzichtig afzuigen de CellTram.
- Move de schotel van onder de naald en zorgvuldig de naald in een buis met de gewenste buffer.
- Met behulp van de CellTram, tap de ECSF uit de naald in de buffer proberen te voorkomen dat besmetting van de oplossing met olie.
- Om cellen die u afgezogen met de ECSF, spin ECSF bij 10.000 x g verwijderd. Verzamel niet-verontreinigd ECSF (supernatant) en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor verdere analyse.
5. Herintroductie van geselecteerde factoren
- Giet de ECSF iedere 2 uur gedurende de gewenste tijdsinterval, omdat de vloeistof is bijgevuld binnen die periode. Tussen drainage tijdstippen, verwijder de naald en bewaar de embryo's bij 28,5 ° C of gewenste temperatuur.
- Laad de tweede micropipet naald met test-factor.
- Plaats de naald in micromanipulator aan microinjector.
- Pas injectievolume tot 1 nl door het meten van de druppelgrootte van de olie-en afstellen van injectie tijd en pressure.
- Injecteer 1 tot 2 nl in de hersenen ventrikels zoals eerder 26 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van een lege hersenventrikel wordt getoond in figuur 1B-C. Hersenventrikels zijn ingestort omdat ze niet ECSF (Figuur 1B vs C). Zoals te zien in dorsale beelden (fig. 1B-C en Figuur 2A-D) de achterhersenen neuroepitheel doet behouden hun kenmerkende morfologie en lijkt open ondanks het gebrek aan ECSF waarschijnlijk door robuuste scharnierpunten. Echter, een zijdelings uitzicht (Figuur 2A'-D ') aantonen dat de achterhersenen ventrikel is afgetapt, in overeenstemming met de aanwezigheid van een dunne flexibele dakplaat epitheel die ventraal instort. In wildtype embryo's, wordt ECSF continu geproduceerd en vult de hersenen ventrikels 2-3 uur na het aftappen (figuur 2). Daarom CSF voortdurend moet worden uitgeput over de tijd van belang.
Terwijl het verwijderen van de vloeistof bij 24 hpf heeft grove morfologie of de ontwikkeling, het verwijderen van ECSF niet verstoren gedurende een langere per iod van ontwikkeling nadelige gevolgen kunnen hebben voor het hele lichaam ontwikkeling. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de werkzaamheid van factoren geïnjecteerd in de hersenen ventrikels. Verder te bepalen of ontwikkelingsstoornis het gevolg van verlies van ECSF of door een naald aanprikken van de hersenen, een belangrijke controle inbrengen van een naald in de hersenen zonder verwijdering ECSF.
We toonden aan dat ECSF een ander proteïneprofiel dan hele embryo extract en analyse heeft op een SDS-PAGE gel eiwit toont aan dat een detecteerbare hoeveelheid eiwit kan worden vanuit zebravis ECSF (figuur 3). Dit toont aan dat neuro cellulaire verontreinigingen lager liggen dan ECSF specifieke eiwitten, en voorts dat een aanzienlijke hoeveelheid eiwit kan worden verzameld dat voldoende is voor massaspectrometrische analyse.
3/4243fig1.jpg "/>
Figuur 1. Handmatig afgevoerd hersenventrikels. (A) Experimental design. Lateral (links) en dorsale (rechts) ziet van waar te micro-injectie naald. Needle (zwarte driehoek) wordt in het dak van de achterhersenen ventrikel op het breedste punt van de achterhersenen. De naald wordt dan verder ingevoegd in de middenhersenen en voorhersenen ventrikels zoals aangewezen door de rode pijlen. (BC) Voorbeelden van 24 hpf handmatig geleegd embryo. Dezelfde embryo gemaakt vóór afvoer (B) of na afvoer (C). (B'-C ') Tracings van BC. Grijze lijn geeft morfologie aanwezig maar niet zichtbaar. F = voorhersenen, M = middenhersenen, H = achterhersenen. Schaal bar = 50 um.
Figuur 2. ECSF vult de hersenen ventrikels in de tijd. (A) 24 hpf embryo alvorens af (B) onmiddellijk na t = 0 (C) 15 (D) 60 (E) 120 (F) 180, (G) 240 en (H) 300 min (m) na het uitlekken. (AH) en Dorsale (A'-H ') laterale helderveld beelden met anterior naar links. F = voorhersenen, M = middenhersenen, H = achterhersenen. Schaal bar = 50 um.
Figuur 3. Protein profiel wijkt tussen 24 hpf geheel zebravis embryo (WE) extract (0,5 ug totaal eiwit) en 24 hpf ECSF van 50 embryo's. SDS laadbuffer toegevoegd aan verzamelde ECSF aan eiwitten, monster op een 8% Tris-HCl PAGE gel denatureren, en gedetecteerd met Sypro Ruby. * Geven bands uniek ECSF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gebruik van deze techniek handmatig ECSF afvoer van zebravis hersenventrikels bruikbaar is voor het bepalen van de vereiste ECSF tijdens de ontwikkeling. Daarnaast is deze techniek beschrijving van de ECSF eiwitprofiel kunnen in de loop van de embryonale ontwikkeling. Identificatie van verschillende eiwitten gedurende deze tijd zal nader onderzoek naar de functie van de CSF en zijn potentiële rol tijdens hersenontwikkeling. In amnioten er factoren die in ECSF (IGF2, FGF2, retinoïnezuur, en apolipoproteïnen) een rol aangetoond in neuro celoverleving, proliferatie en neurogenese 13,17,20,23,27,28. Er blijken honderden ongekarakteriseerde eiwitten in de ECSF, die werd verkregen na choroid plexus vorming later dan de tijdstippen hier aangetoond. Daarnaast hebben ons lab en anderen geïdentificeerd zebravismutanten met abnormale hersenventrikel grootte of hersenafwijkingen 29-31, en kan have afwijkingen in ECSF samenstelling en functie. Deze methode maakt het mogelijk gemakkelijk voor het isoleren en testen van mogelijke abnormale ECSF van mutanten of onder verschillende omstandigheden.
Een krachtige gebruik van de zebravis systeem is gekozen factoren via injectie te vervangen in de hersenen ventrikels na verwijdering van ECSF, waardoor het testen van hun functie tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Kleine moleculen, eiwitten en ECSF verkregen na genetische of chemische verstoring kan worden getest. Herinvoering van ECSF van andere species zal vergelijking van factoren en functies tussen soorten en onder verschillende pathologische omstandigheden, zoals hydrocephalus, aanvulling en interfacing met zoogdieren studies. Samengevat, het gebruik van de zebravis om ECSF te verwijderen, te analyseren de samenstelling en ECSF of specifieke factoren in de hersenen ventrikels weer invoert, zal aanzienlijk toenemen begrijpen van de rol en regulering van ECSF functie en dat van de hersenen ventriculaire systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Geestelijke Gezondheid en National Science Foundation. Met dank aan Dr Jen Gutzman, Dr Amanda Dickinson en andere Sive lab leden voor vele nuttige discussies en opbouwende kritiek, en Olivier Paugois voor deskundige vis veeteelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. The blood-cerebrospinal fluid barrier. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
