Summary
我々は、脳脊髄液（CSF）を収集し、ゼブラフィッシュ胚の脳室系内のCSFを欠いてシステムを作成する方法を提案する。これは、胚の脳の発達中に脳脊髄液の組成とその要件の精査が可能になります。
Abstract
脳脊髄液（CSF）は脳室内に含まれるタンパク質に富む流体である。これは初期の脊椎動物の胚発生時に存在しており、生涯にわたって持続します。アダルトCSFは、脳を和らげる廃棄物を削除して、分泌される分子の1,2を運ぶと考えられている。成人と高齢胚では、CSFの大半は脈絡叢、脳の脳室3から5に隣接して位置する高度に血管分泌領域のシリーズが作られています。ゼブラフィッシュでは、脈絡叢が完全に144時間後に受精（HPF）6が形成されている。これに先立ち、マウスを含むゼブラフィッシュや他の両方の脊椎動物の胚では、胚CSF（eCSF）かなりの量が存在しています。ひよこのこれらのデータと研究は神経上皮は、開発の早い段階で分泌され、前脈絡叢開発7〜eCSFの主要な源であることが示唆された。
eCSFは約3倍以上のタンパク質トンが含まれていますそれが発展8,9時に重要な役割を持っている可能性が示唆された漢成人CSF、。ニワトリとマウスでの研究はeCSF、流体圧力、またはこれらの組み合わせで分泌された因子は、神経上皮10月20日における神経発生、遺伝子発現、細胞増殖、細胞生存のために重要であることを実証している。ヒト、ラット、マウス、ニワトリeCSFのプロテオーム解析は、CSFの機能のために必要があるかもしれない多くのタンパク質を同定した。これらは、細胞外マトリックス成 分、アポリポタンパク質、タンパク質を浸透圧調節、細胞死と増殖の21から24に関与するタンパク質を含む。しかし、eCSFの複雑な機能は不明な点が多い。
その結果、私たちはeCSFコンポーネントの識別のために、開発中のeCSF要件の分析が可能になり、ゼブラフィッシュの脳室からeCSFを除去するための方法を開発しました。もっとeCSFは他の脊椎動物システムワットから収集することができますがi番目の大きい胚、eCSFは、ゼブラフィッシュの開発の初期段階から収集され、異常な脳室の容積や形態につながる遺伝的または環境条件の下ですることができます。 eCSFの取り外しおよびコレクションは質量分析、eCSF機能の調査、およびアッセイに心室にselect into要因の再導入、それらの機能を可能にします。したがって、初期のゼブラフィッシュ胚のアクセシビリティは開発中eCSF機能の詳細な分析を可能にする。
Protocol
1。マイクロインジェクション針とセルトラムの準備
- 製造元の指示に従って、ミネラルオイルをエッペンドルフCellTramオイルマイクロインジェクター装置を記入してください。
- サッター楽器ニードルプラーを使用してキャピラリーチューブを引いて、マイクロインジェクション針を準備します。
- エッペンドルフCellTramに接続マニピュレーターに針を取り付けます。
- 慎重に針の先端を破る。均一なチップサイズについては、マイクロメーターを用いて測定したり、参照針と比較します。
- 任意の気泡を避けるように注意して、長さに沿って油をプッシュするCellTramを使用して、油で針の長さを記入してください。
2。胚の準備
- 1から200μlのピペットチップを用いて1％アガロースコーティングされた皿に穴を突く、アガロースプラグを取り外します。胚メディア（ウェスター25に従って製）で皿を埋める。
- 実体顕微鏡下でピンセット、dechorionate胚を用いた。
- dechorionated胚を転送アガロースコートディッシュに。
- 胚は（ウェスター25によれば作られる）移動を停止するまでの胚を麻酔し、アガロース皿にTricaine（0.1 mg / ml）を加える。
3。 eCSFを排出
- オリエントアガロースとその後部両側脳の背側の可視化を可能にする、マイクロマニピュレータに最も近いの穴にしっぽを持つ胚。
- rhombomere 0/1のヒンジ·ポイントまたは後脳室（ 図1A）の最も広いポイントで針を置きます。
- 後脳の脳室の慎重ピアス屋根板は、卵黄に脳の深さを通過しないように気をつけてください。
- CellTramを使用eCSFを排出し、マイクロインジェクションニードル内の流体を収集します。任意のセルを避けるように注意してください。
4。組成分析のためeCSFの収集
- eCSFが針に収集された後、慎重にCellTramから吸引を停止します。
- モー針の下から皿をVEと慎重に所望のバッファを含むチューブに針を配置します。
- CellTramを使用して、油で溶液の汚染を避けるためにしようとするバッファへの針のeCSFを流出。
- あなたは、10,000×gでeCSF、スピンeCSFと共に吸引されていることを細胞を除去するためである。収集し、さらなる分析のために-80℃でeCSF（上清）とストア°Cまで準備汚染されていない。
5。選択した因子の再導入
- 流体は、その期間内に補充されるので、所望の時間間隔の間にeCSF毎回2時間を排出します。温排水の時点までの間に、針を除去し、28.5℃で胚を保存したり、希望する。
- 試験因子と第二マイクロピペット針をロードします。
- 微量注入器に取り付けられたマイクロマニピュレーターに針を置きます。
- 油の中にドロップサイズを測定し、射出時間とpを調整することによって、1をNLに注入量を調節ressure。
- 前述の26記載脳室に1月2日NLを注入します。
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Representative Results
排水脳室の例を図1B-Cに示されている。彼らはeCSF（C対図1B）を欠いているように脳室は折りたたまれています。背側の画像に見られるように（ 図1B-C、および図2A-D）後脳の神経上皮は、その特徴的な形態を保持しないと堅牢なヒンジ点に起因する可能性が高いeCSFの欠如にもかかわらず、開いていると思われる。しかし、横方向のビュー（ 図2A'-D '）の後脳の心室が腹崩れ薄いフレキシブル屋根板上皮の存在と一致し、排出されたことを実証している。野生型の胚では、eCSF連続的に製造し、脳は2-3時間後（ 図2）水切りを心室補充されています。従って、CSFは、継続的に関心のある時間にわたって枯渇する必要があります。
24 HPFでの流体の除去はグロス形態や開発、もはや当たり以上eCSFの除去が妨げられることはありませんが開発のIODは全身の発展に悪影響を与える可能性があります。脳室に注入された要因の有効性を決定するときに考慮すべきである。さらに、発達障害がeCSFの損失や脳を穿刺針に起因した結果であるかどうかを判断するために、重要なコントロールはeCSFを削除せずに脳に針の挿入である。
我々はeCSFは全胚抽出物とは異なるタンパク質の性質を有することを証明し、SDS-PAGEタンパク質ゲル上で解析、タンパク質の検出量は、ゼブラフィッシュeCSF（ 図3）から収集することができることを実証している。このことは、神経上皮細胞の汚染物質が質量分析のために十分であることをeCSF特定のタンパク質よりも低いレベルであり、さらにそのタンパク質のかなりの量を収集することができますを示しています。
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図1：手動排水脳室。 （A）は、実験的なデザイン。マイクロインジェクションニードルを挿入する位置の（右）横（左）と背側を眺めることができます。針（黒三角）は、後脳の最も広いポイントで後脳室の屋根板に挿入されます。針は、その後さらにとして赤い矢印で指定中脳および前脳脳室に挿入されます。 （BC）24 HPFの例には、手動で胚を排出。同じ胚（B）は、排水の前またはドレイン（C）の後に結像される。 BCの（B'-C '）トレーシング。グレイラインは形態存在するが目には見えないことを示します。 F =前脳、中脳、M =、H =後脳。スケールバー=50μmである。
図2 eCSFは、時間の経過とともに脳室を補充します。水切り前（A）は24 HPFの胚（B）の直後にT = 0（C）15（D）60（E）120、（F）180、（G）の240、および（H）300分（m）を排出した後。 （AH）は背鰭と（A'-H '）を左に前方と横方向の明視野像。 F =前脳、中脳、M =、H =後脳。スケールバー=50μmである。
図3タンパク質プロファイルは50胚から24 HPF全体のゼブラフィッシュ胚（WE）エキス（0.5μgの総タンパク質）と24 HPF eCSF間で異なります。 SDSローディングバッファーは8％のTris-HCl PAGEゲル上で動作するサンプルは、タンパク質を変性させるために収集eCSFに追加され、シプロRubyで検出されました。 * eCSFにユニークなバンドを示す。
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Discussion
手動でゼブラフィッシュ脳室からeCSFを排出するために、この手法を使用するには、開発中にeCSFのための要件を決定するために有用であろう。また、この技術は、胚発生の過程でeCSFタンパク質プロファイルの説明をできるようになります。この時間の間に種々のタンパク質の同定は、CSFおよび脳の発達の間にその潜在的な役割の機能にさらに調査を可能にするでしょう。 amniotesで、eCSF（IGF2は、FGF2、レチノイン酸、およびアポリポタンパク質）で同定され、いくつかの要因は、神経上皮細胞の生存、増殖および神経新生13,17,20,23,27,28で実証的な役割を持っています。しかし、後でここに実証の時点より脈絡叢を形成した後に得られたeCSF、、に特徴づけられていない何百もの蛋白質があるように見える。さらに、我々の研究室や他の人が異常な脳室の大きさや脳の欠陥29-31、および5月HAVとゼブラフィッシュ突然変異体を同定したeCSF組成と機能の電子の異常。この方法は容易に変異または異なる環境条件下で推定異常eCSFを分離し、テストを行うことができます。
ゼブラフィッシュシステムの強力な使用は、それによって脳の発達の間にそれらの機能をテストし、eCSFを除去した後の脳室に注射を介して選択した因子を交換することです。遺伝的または化学的摂動の後に得られた小分子、タンパク質、およびeCSFをテストすることができます。他の種からeCSFの再導入は、哺乳動物の研究と補完し、インターフェース、種を越えて、そのような水頭症などのさまざまな病的状態、下の要因と機能の比較を可能にします。要約すると、、eCSFを削除するには、その組成を分析し、大幅eCSF機能の役割と規制を理解向上と脳室系のことでしょう、脳室にeCSFまたは特定の要因を再導入するゼブラフィッシュの使用。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、国立精神衛生研究所、国立科学財団によってサポートされていました。博士ジェンGutzman博士アマンダ·ディッキンソン、多くの有用な議論や建設的な批判のための他のSive研究室のメンバーに、専門家の魚飼育用のオリビエPaugoisのおかげで、特別です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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