Summary
Adenovirus कणों या तो अप्राकृतिक एमिनो एसिड अनुरूप azidohomoalanine या azido चीनी शामिल करने के लिए इंजीनियर हैं
Protocol
सभी मीडिया बफ़र्स, और समाधान इस प्रोटोकॉल में संदर्भित की तैयारी के लिए 1 तालिका देखें.
1. Adenovirus अहा लेबल का उत्पादन
- 37 ° C पर ग्यारह मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं के 100 मिमी टिशू कल्चर बर्तन (293 HEK) HEK 293 सेल के विकास के माध्यम से बनाए रखा (देखें तालिका 1) की तैयारी जब तक वे 80 - 90% तक पहुँच चुके हैं confluency. (नोट: confluency साथ 90% से अधिक संस्कृति मुश्किल हो संक्रमित हैं और उत्पादन के रूप में वांछित नहीं हो सकता है वायरस हो सकता है.)
- एक बर्तन में पहले मध्यम विकास को हटाने के, एक बार टीडी बफर के 5 मिलीलीटर के साथ rinsing, तो trypsin EDTA (1 ×) के 1 मिलीग्राम में एक मिनट के लिए कोशिकाओं incubating के द्वारा कोशिकाओं थोड़ा ढीला.
- HEK 293 सेल विकास मध्यम 9 मिलीलीटर जोड़ें, और इस पकवान से काटा HEK 293 कोशिकाओं की संख्या गिनती एक hemocytometer का उपयोग करें. इस नंबर का उपयोग करने के लिए adenovirus 5 प्रकार (Ad5) संक्रमण के लिए आवश्यक राशि की गणना एक multiplicit का उपयोगसंक्रमण के 10 Pfu सेल / y मूल्य (MOI),. तथ्य यह है कि Ad5 सामान्य के लिए, संक्रामकता सूचकांक (संक्रामक कणों के कणों की कुल संख्या के अनुपात में) आम तौर पर 1:20 के लिए खाता है.
- संक्रमण बफर के 10 मिलीलीटर तैयार.
- धीरे HEK 293 सेल विकास मध्यम दस शेष संस्कृति बर्तन से दूर है, तो टीडी बफर के 5 मिलीलीटर से धो. प्रत्येक और 37 ° C पर पकवान सेते हैं 1 घंटे के लिए संक्रमण बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें. इस संक्रमण अवधि के दौरान, धीरे 15 मिनट के अंतराल पर पक्ष को प्रत्येक संस्कृति पकवान की ओर रॉक.
- संक्रमण के बाद 18 घंटे के लिए, 37 ° C पर ताजा HEK 293 सेल के विकास मध्यम और सेते हैं 9 मिलीलीटर जोड़ें.
- अहा लेबलिंग मध्यम (या नियंत्रण के लिए नियंत्रण मध्यम मेट) की 100 मिलीलीटर तैयार. 0.2 माइक्रोन बाँझ सिरिंज फिल्टर साथ लेबलिंग मीडिया की तैयारी से पहले केंद्रित स्टॉक समाधान फ़िल्टर करने के लिए सुनिश्चित करें.
- ध्यान से (इतनी के रूप में दूर धोने के लिए नहीं संक्रमित कोशिकाओं) 18 घंटे बाद HEK 293 सेल विकास मध्यम हटायेंएन डी टीडी बफर के 5 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक संस्कृति पकवान धो लो.
- टीडी बफर धोने समाधान निकालें और प्रत्येक संस्कृति पकवान अहा लेबलिंग मध्यम की 10 मिलीलीटर जोड़ें. नियंत्रण के लिए, इस कदम पर methionine नियंत्रण मध्यम अहा लेबलिंग मध्यम के बजाय किया जाना चाहिए.
- 37 ° C पर 6 घंटे के लिए मध्यम लेबलिंग में संक्रमित कोशिकाओं को सेते हैं. लेबलिंग बाहर किया जा सकता है कभी भी 12 के बीच 24 के बाद संक्रमण घंटा लेकिन अवधि में 6 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए. इस अंतराल के लिए वायरल संरचनात्मक प्रोटीन अनुवाद के साथ ओवरलैप को अधिकतम निर्धारित किया गया है, जबकि यह सुनिश्चित करने के संक्रामकता काफी कम नहीं है 7.
- ध्यान से लेबलिंग मध्यम हटा तो बाधित नहीं कोशिकाओं. प्रत्येक पकवान ताजा HEK 293 सेल मध्यम विकास के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 37 ° C पर एक और 18 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. इस कदम के दौरान संक्रमित कोशिकाओं के नुकसान को कम करने के लिए, यह लेबलिंग समाधान पूरी तरह से हटाने के लिए आवश्यक नहीं है. HEK 293 सेल विकास मध्यम एम के एक अतिरिक्त हैएट जो किसी भी अवशिष्ट अहा outcompete.
- शुद्धि के लिए 3 कदम आगे बढ़ें.
2. Azido चीनी लेबल Adenovirus का उत्पादन
- अहा - लेबल और 1.5 कदम सहित Adenovirus का उत्पादन शीर्षक की प्रक्रिया का पालन करें.
- Azido चीनी लेबलिंग मध्यम के 100 मिलीलीटर तैयार.
- ताजा लेबलिंग Azido चीनी मध्यम और सेते हैं के 10 मिलीग्राम के साथ कोशिकाओं को 44 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कवर.
3. Azide लेबल adenoviral कण की शुद्धि
- प्रत्येक संस्कृति पकवान और शंक्वाकार ट्यूबों के लिए हस्तांतरण से संक्रमित कोशिकाओं के साथ साथ मीडिया निकालें. 4 में 10 मिनट के लिए 2,000 जी पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला निकालें और resuspend टीडी बफर में गोली (टीडी बफर के 10 व्यंजन प्रति 8 मिलीग्राम का उपयोग).
- दोहराया (3 या अधिक) फ्रीज पिघलना तरल नाइट्रोजन और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान के देवर कुप्पी का उपयोग चक्र से संक्रमित कोशिकाओं Lyse. 10 मिनट के लिए 2,000 g पर अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला से सेल मलबे अलग करने के लिए.
- पहले एक अल्ट्रा साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1.25 ग्राम / एमएल CsCl समाधान के 2.5 मिलीग्राम pipetting द्वारा CsCl घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार. अगला, अपने टिप ट्यूब के तल पर तैनात साथ एक विंदुक उपयोग करने के लिए धीरे धीरे 1.4 छ / एमएल CsCl समाधान के 2.0 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, देखभाल करने के लिए ढाल अंतरफलक परेशान नहीं.
- CsCl घनत्व ढाल ट्यूब के शीर्ष पर 3.2 कदम से सतह पर तैरनेवाला पिपेट, और यदि आवश्यक जोड़ने टीडी बफर ट्यूब भरने के लिए. अपकेंद्रित्र 125,000 जी पर झूल 1 घंटे के लिए बाल्टी में 15 ° रोटर ultracentrifuge एक में सी में नमूने.
- Ultracentrifugation के पूरा होने के बाद, वायरस के कणों दो CsCl समाधान के इंटरफेस में एक मोटी सफेद बैंड के रूप में दिखाई होना चाहिए. समाधान dropwise निकास के लिए अनुमति देने के लिए एक बाँझ सुई के साथ एक ट्यूब के नीचे एक छोटा सा छिद्र बनाओ.
- मोटी सफेद बैंड ले लीजिए, जो लेबल Ad5 कणों के होते हैं, ताकिन चाहिएजी देखभाल अतिरिक्त CsCl समाधान बाहर. सेलुलर प्रोटीन जो वायरस परत के ऊपर बैंड का संग्रह करने से बचें. इसके अतिरिक्त खाली virion capsids जो मोटी सफेद वायरस बैंड से थोड़ा ऊपर एक लाइटर परत के रूप में बाहर.
- वैकल्पिक रूप से, लेबल Ad5 कणों पर अंतिम शुद्धि करते हैं. 3.6 कदम से एक 4 मिलीलीटर ultracentrifuge के ट्यूब एकत्र अंश जोड़ें और 1.35 ग्राम / एमएल CsCl समाधान के साथ ट्यूब भरने के. 18 घंटा के लिए 125.000 ग्राम में 15 डिग्री सेल्सियस पर और मोटी सफेद बैंड है जो 3.5 कदम और 3.6 में वर्णित के रूप में ट्यूब के बीच में रूपों अपकेंद्रित्र इकट्ठा. (ध्यान दें कि अगर वायरल अनुमापांक कम है, एक सफेद बैंड दूसरे centrifugation के बाद दिखाई नहीं देता हो, और यह संभव नहीं हो लेबल वायरस ठीक हो सकते हैं).
- वायरस कणों से अधिक समय की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एकत्र वायरस निकालने की डायलिसिस वायरस भंडारण बफर के खिलाफ प्रदर्शन किया जाना चाहिए. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर dialyzed वायरस के नमूने
4. लीalkyne तनाव में प्रचारित Cycloaddition azide-alkyne का उपयोग जांच के साथ संशोधित adenoviral कण की gation (SPAAC)
- वायरस भंडारण बफर में 50 Ad5 के azide - संशोधित μl के समाधान के लिए, 0.25 SPAAC लेबलिंग समाधान की μl जोड़ें. (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तनावपूर्ण alkynes venders की एक सूची के लिए अभिकर्मकों की तालिका देखें).
- Cycloaddition तनाव प्रचार के लिए कमरे के तापमान पर रातोंरात आगे बढ़ना प्रतिक्रिया की अनुमति दें. यदि एक जांच प्रकाश के प्रति संवेदनशील (जैसे Tamra) प्रयोग किया जाता है, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रतिक्रिया पोत को कवर.
- लेबल के लिए 6 कदम के अनुसार वायरस शुद्ध.
5. संशोधित adenoviral कण की alkyne deoxygenated वायुमंडल में (मैं) कॉपर उत्प्रेरित Cycloaddition azide-alkyne (CuAAC) का उपयोग जांच के साथ ligation
- जगह तांबे का 7.2 मिलीग्राम (मैं) ब्रोमाइड पाउडर (CuBr) के एक Eppendorf ट्यूब, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया.
- विंदुक एक दूसरे Eppendorf ट्यूब में 1 DMSO के मिलीलीटर.
- तैयार करनाएक तीसरे Eppendorf ट्यूब में 50 CuAAC लेबलिंग समाधान की μl. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर अगर alkyne जांच प्रकाश के प्रति संवेदनशील है (जैसे Tamra-alkyne).
- 6 घंटे के लिए एक deoxygenated दस्ताने बैग में तीन Eppendorf ट्यूबों, uncapped, रखें. सभी नमूनों CuAAC प्रतिक्रिया के पूरा होने तक दस्ताने बैग के अंदर रहना चाहिए.
- एक 50 × CuBr स्टॉक समाधान की तैयारी के 7.2 मिलीग्राम का CuBr पाउडर DMSO के 1 मिलीग्राम जोड़ने, दोनों जिनमें से 5.4 कदम के अनुसार deoxygenated है.
- आरंभ 50 CuAAC लेबलिंग समाधान है, जो 5.4 कदम के अनुसार किया गया deoxygenated है μl इस CuBr स्टॉक समाधान की 1 μl pipetting द्वारा CuAAC प्रतिक्रिया. प्रतिक्रिया दस्ताने बैग के अंदर 12 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें.
- लेबल के लिए 6 कदम के अनुसार वायरस शुद्ध.
6. और लेबल वायरस कण की शुद्धि भंडारण
- लेबल वायरस के नमूने का उपयोग कर जेल Centri - Sep निस्पंदन स्पिन ग शुद्धवायरस का भंडारण बफर के साथ equilibrated olumns, निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन.
- वैकल्पिक रूप से, शुद्धि वायरस भंडारण बफर के खिलाफ डायलिसिस से बाहर ले सकते हैं.
- लेबल वायरस कणों -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए
7. एसडीएस लेबल Adenovirus और फ्लोरोसेंट जेल स्कैन के पृष्ठ
- लेबल और 10 मिनट के लिए वायरस फोड़ा शुद्ध 20 μl 20 μl Laemmli नमूना बफर (2 ×) जोड़ें. 30 सेकेंड के लिए किसी भी precipitates अघुलनशील निकालने के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. यदि अवशिष्ट तांबे के शोधन के बाद मौजूद है, नमूना उबलते जेल एसडीएस पृष्ठ पर प्रोटीन की मोटी धारियाँ में, दृश्य के दौरान कठिनाई पैदा कर सकते हैं. इस मामले में, इस चरण में नमूना के उबलते छोड़.
- वैद्युतकणसंचलन सेल जेल कैसेट संलग्न है और चल रहा है बफर जोड़ें. वायरल प्रोटीन के नमूने के साथ कुओं की अपेक्षित संख्या लोड. एक का प्रयोग करें अच्छी तरह से पूर्व stai लोड करने के लिएनेड वजन आणविक मार्करों. 200 में 1 घंटे के लिए जेल भागो वी. वैद्युतकणसंचलन संपूर्ण अवधि के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर सेल की fluorophore लेबल की photobleaching को कम करने के लिए रखें.
- सबसे अच्छा संकल्प और सभी मुफ्त की fluorophore निकालने के लिए, ट्रैकिंग डाई बाहर जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान चलाने के लिए अनुमति देते हैं. वैद्युतकणसंचलन बंद करो और जल्दी से एक फ्लोरिसेंट जेल स्कैनर जेल हस्तांतरण और उचित तरंगदैर्ध्य (Tamra के लिए 574 एनएम) में प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन के लिए जेल स्कैन.
- प्रत्येक वायरल कण संयुग्मित डाई अणुओं की संख्या कई मानक Tamra सांद्रता के प्रतिदीप्ति मापने और 7.3 कदम से नमूना के साथ तुलना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
8. प्रतिनिधि परिणाम
एसडीएस पृष्ठ और Tamra संयुग्मित Ad5 फ्लोरोसेंट जेल स्कैनिंग मनाया परिणाम 3 चित्र में दिखाया जाता है. हालांकि इन फ्लोरोसेंट जेल स्कैन के नमूने मोदी पर प्रदर्शन किया गयाCuAAC के माध्यम से fied, परिणाम बराबर हो जब जांच SPAAC के माध्यम से ligated रहे हैं चाहिए. ये जेल स्कैन से संकेत मिलता है कि अहा तीन Ad5 capsid प्रोटीन (Hexon,, Penton, और फाइबर) के संशोधन में लेबलिंग का परिणाम है, जबकि चीनी लेबलिंग केवल फाइबर प्रोटीन capsid को संशोधित. इसके अलावा, अहा निगमन का एक बड़ा डिग्री में अहा एकाग्रता में वृद्धि परिणाम (4 मिमी बनाम 32 मिमी), लेकिन यह भी संक्रामकता कम करने के लिए दिखाया गया है. पिछले 7 परिणामों से संकेत मिलता है कि Ad5 4mm में उत्पादन के लिए अहा, उजागर methionine साइटों की लगभग 5% Tamra यह संख्या 10% से बढ़ रही है जब 32 मिमी अहा प्रयोग किया जाता है के साथ संशोधित कर रहे हैं. यह लगभग 280 और 510, क्रमशः, डाई लेबल Ad5 कण प्रति साइटों से मेल खाती है. चीनी 1 लेबलिंग का विश्लेषण संकेत दिया है कि 36 Ad5 पर ग्लाइकोसिलेशन साइटों की 22 मोटे तौर पर एक azido चीनी द्वारा कब्जा कर रहे हैं और बाद में Tamra के साथ लेबल.
यदि दस टिशू कल्चर प्लेट Ad5 azide संशोधित उत्पादन किया जाता है के रूप में वर्णित इस प्रोटोकॉल में, 200 - 300 azide संशोधित वायरस की μl सफेद 3.6 चरण में एकत्र बैंड से प्राप्त किया जाना चाहिए लगभग 1.5 की अनुमापांक × 10 12 कणों / एमएल के साथ. इस प्रक्रिया के एक सामान्य कठिनाई इस शुद्धि कदम है, जो कम वायरल अनुमापांक के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है पर एक वायरल बैंड का अभाव है. जो संक्रमण के बाद थाली से ढीला हो जाते हैं - जबकि rinsing के चरण 1 के दौरान यह आम तौर पर कोशिकाओं है जो या तो से अधिक या कम मिला हुआ है, या कोशिकाओं को दूर धोने से संक्रमण का एक परिणाम है.
चित्रा 1. प्रोटोकॉल सिंहावलोकन. Azide - युक्त अहा या GalNAz के पहले adenovirus कणों में शामिल किया है. एक फ्लोरोसेंट alkyne जांच के साथ ligation तो "पर क्लिक करें" रसायन शास्त्र के माध्यम से किया जाता है. अंत में, एसडीएस पृष्ठ फ्लोरोसेंट जांच के बंधाव प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
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चित्रा 2 पर alkyne जांच की Ligation azide संशोधित () SPAAC, (ख) के तहत डे - से oxygenated CuAAC और (ग) ऑक्सीजन वातावरण के माध्यम से वायरस.
चित्रा 3 azide - adenovirus लेबल 5 साथ Tamra - alkyne CuAAC विकार के बाद प्रकार (Ad5) के एसडीएस पृष्ठ की प्रतिदीप्त स्कैन. (क) Ad5 अहा लेबल, अहा की दो सांद्रता का उपयोग कर. लेबलिंग adenovirus Hexon, Penton और फाइबर capsid प्रोटीन पर होते लेबलिंग की हद तक बढ़ अहा एकाग्रता के साथ बढ़ रही है के साथ प्रकट होता है. (ख) एसी 4 GalNAz लेबल adenovirus फाइबर प्रोटीन capsid पर ही लेबल किया जाना प्रतीत होता है.
| समाधान | तैयारी | नोट्स |
| Ad5 भंडारण बफर | 5 मिमी Trisएचसीएल बफर (8.0 पीएच) 0.5 मिमी युक्त 2 MgCl, 50 मिमी, NaCl 25 (v / v)% ग्लिसरॉल, और 0.05% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम albumin (BSA) के | -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर |
| Ad5 संक्रमण बफर | 2% (v / v) गोजातीय बछड़ा सीरम, 1 × टीसी समाधान, भंडारण बफर में Ad5 (10 pfu / सेल और 1:20 की संक्रामकता सूचकांक MOI का उपयोग करके निर्धारित मात्रा). अंतिम मात्रा टीडी बफर का उपयोग करने के लिए समाधान लाओ | Ad5 एकाग्रता यूवी अवशोषण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है. |
| टीसी समाधान (200 ×) | 136 मिमी 2 CaCl, 100 मिमी 2 MgCl | स्टोर 4 में डिग्री सेल्सियस |
| टीडी बफर | 137 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, मिमी ना 2 4 HPO, और 25 मिमी Tris - एचसीएल, पीएच 7.5 0.07 | स्टोर 4 में डिग्री सेल्सियस |
| HEK 293 सेल विकास मध्यम | Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10 (v / v%) गोजातीय बछड़ा सीरम (BCS) और 1% (v / v) पेन Strep के साथ पूरक | स्टोर 4 में डिग्री सेल्सियस |
| Cys स्टॉक समाधान (100 ×) | DMEM (मौसम / Cys) 200 मिमी एल Cysteine के साथ पूरक | 0.2 माइक्रोन उपयोग करने से पहले बाँझ सिरिंज फिल्टर के साथ नए सिरे से और फिल्टर तैयार करते हैं. |
| अहा स्टॉक समाधान (25 ×) | DMEM (मौसम / Cys) 100 मिमी एल Azidohomoalanine के साथ पूरक | 0.2 माइक्रोन उपयोग करने से पहले बाँझ सिरिंज फिल्टर के साथ नए सिरे से और फिल्टर तैयार करते हैं. |
| अहा लेबलिंग मध्यम | DMEM (मौसम / Cys) 10% BCS, अहा स्टॉक समाधान (1 ×), 2 मिमी एल Cysteine के साथ पूरक | उपयोग करने से पहले ताजा तैयार. यह एक 4 मिमी ग से मेल खाती हैअहा की oncentration, हालांकि अलग सांद्रता (प्रतिनिधि परिणाम देखें) इस्तेमाल किया जा सकता है. |
| मौसम स्टॉक समाधान (25 ×) | DMEM (मौसम / Cys) 100 एल Methionine मिमी के साथ पूरक | 0.2 माइक्रोन उपयोग करने से पहले बाँझ सिरिंज फिल्टर के साथ नए सिरे से और फिल्टर तैयार करते हैं. |
| मौसम नियंत्रण मध्यम | (मौसम / Cys) DMEM BCS 10% के साथ पूरक, स्टॉक (1 ×) समाधान, मौसम 2 मिमी एल Cysteine | उपयोग करने से पहले ताजा तैयार. |
| एसी 4 GalNAz स्टॉक समाधान (+१००० ×) | मेथनॉल में 50 मिमी peracetylated एन azidoacetylgalactosamine (एसी GalNAz 4) | 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर एसी 4 GalNAz GlcNAz एक चयापचय अग्रदूत है. |
| Azido चीनी लेबलिंग मध्यम | 100 μl एसी 4 GalNAz स्टॉक समाधान, 100 मिलीलीटर HEK 293 सेल विकास मध्यम | मेथनॉल पूर्व HEK 293 सेल विकास मध्यम जोड़ने के लिए लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देते हैं. |
| सीज़ियम क्लोराइड समाधान | CsCl टीडी बफर में भंग: 1.25 छ / एमएल (18.08 छ / 50 मिलीलीटर एच 2 हे) 1.35 छ / एमएल (25.60 छ / 50 मिलीलीटर एच 2 हे) 1.40 ग्राम / एमएल (31.00 छ / 50 मिलीलीटर एच 2 हे) | Ultracentrifugation के लिए gradients घनत्व |
| वायरस भंडारण बफर | फास्फेट (पीबीएस) खारा, पीएच 7.2, 0.5 मिमी बफर युक्त 2 CaCl, 0.9 मिमी 2 MgCl, और 10% (v / v) ग्लिसरॉल | -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर |
| Tamra बीसीएन (SPAAC) लेबलिंग समाधान | DMSO में Tamra बीसीएन:
| तनाव पदोन्नत alkyne जांच के एसडीएस पेज, लगभग 10 12 कणों / मिलीलीटर की एक वायरल अनुमापांक सुझाव दिया है |
| Tamra alkyne (CuAAC) लेबलिंग समाधान | Ad5 azide वायरस भंडारण बफर में संशोधित (Ad5 एन ऊपर के रूप में निर्धारित किया है) के 50 μl, 1.5 मिमी batho phenanthroline (1.5 यानी × अंतिम CuBr एकाग्रता) disulfonate, Tamra-alkyne. Tamra-alkyne molarity का (एम) का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है: ग ALK 2 = 6 × 10 × (एन avo / Ad5 एन) (ताकि प्रतिक्रिया चरण 5 में तैयार मिश्रण virion प्रति 100 alkyne जांच शामिल है) | Tris बफर करने के लिए तांबे का एक प्रतिस्पर्धी और निरोधात्मक ligand हो जाता है 8. |
| Laemmli नमूना बफर (2 ×) | 125 मिमी Tris - एचसीएल (6.8 पीएच), 4% (w / v) एसडीएस, 20% ग्लिसरॉल (v / v), 10% (v / v) 2 - mercaptoethanol, और 0.004% (w / v) नीले bromophenol | |
| बफर रनिंग | 187 मिमी ग्लाइसिन, 19 मिमी Tris - एचसीएल, एच 2 हे में 3.5 मिमी एसडीएस | स्टोर 4 में डिग्री सेल्सियस |
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Discussion
chemoselective और bioorthogonal azides की उन सहित क्लिक प्रतिक्रियाओं, के विकास अनुसंधान का एक तेजी से विकसित क्षेत्र है, और बाद में इन प्रतिक्रियाओं के एक बढ़ती संख्या से bioconjugation अनुप्रयोगों के लिए चुनाव है. हम इस प्रोटोकॉल के दायरे से प्रतिबंधित करने के लिए केवल दो तरीकों जो उनकी उपयोगिता की वजह से हमारी अपनी प्रयोगशाला और सभी अभिकर्मकों की वाणिज्यिक उपलब्धता में चुना गया था शामिल हैं.
पहले इस तरह के मार्ग में तनाव से पदोन्नत cycloaddition azide alkyne (SPAAC) - alkyne एक cyclooctyne अंगूठी (2a चित्रा) के भीतर निहित है. यह हाल ही में विकसित विधि के oxygenated वातावरण के अंतर्गत और एक तांबे उत्प्रेरक के लिए जरूरत के बिना आयोजित किया जा सकता है 9,10. हाल ही में जब तक, इस पद्धति का एक दोष के साथ तुलना में टर्मिनल में इस्तेमाल किया alkynes श्रमसाध्य और इन तनावपूर्ण alkynes के कम वाणिज्यिक उपलब्धता संश्लेषण (मैं) तांबे उत्प्रेरित azide alkyne (cycloaddition घनAAC), लेकिन, अब इन जांच की एक बढ़ती पुस्तकालय है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध (अभिकर्मकों तालिका देखें). इन कारणों के लिए, हम इस प्रोटोकॉल में पसंद की विधि के रूप में SPAAC चुना है.
इसके अलावा इस प्रोटोकॉल में वर्णित है azide deoxygenated एक chelating एजेंट के रूप में (चित्रा 2b) bathophenanthroline disulfonic एसिड disodium नमक (BDA) का उपयोग वातावरण में CuAAC के माध्यम से संशोधित adenoviral कणों के बंधाव. इस विधि में है कि BDA उत्प्रेरक दोनों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और सस्ती है सुविधाजनक है. इसके अलावा सूचना दी, पैदावार आम तौर पर उपलब्ध तरीकों का उच्चतम है, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के समाधान में पीढ़ी (cf. CuAAC से oxygenated, नीचे) से उत्पन्न होने वाली जटिलताओं से परहेज कर रहे हैं 8 हालांकि, तांबा उत्प्रेरक (मैं) करने के लिए साइटोटोक्सिक हो जाता है. 11 और विशेष करने के लिए इस प्रक्रिया को लागू करने के लिए आवश्यक उपकरण का उपयोग करने से कुछ समूहों को रोक सकता है. बहरहाल, हम को खोजने के लिए इस विधि के लिए कुशल और उपयोगीadenovirus संशोधन.
एक तिहाई CuAAC की उपयोगी विधि हाल ही में किया गया है oxygenated वातावरण की स्थिति (चित्रा -2 सी) के तहत काम 8 यह विधि विकसित की है. BDA - chelated दृष्टिकोण के रूप में एक ही लाभ प्राप्त है लेकिन एक chelating एजेंट के रूप में उपयोग करता है बजाय THPTA वायुमंडलीय ऑक्सीजन के oxidative विनाश के बिना समायोजित सब्सट्रेट. इस दृष्टिकोण का एक छोटा सा दोष THPTA की वाणिज्यिक उपलब्धता की मौजूदा कमी है, हालांकि इस chelating एजेंट का सीधा syntheses सूचित कर दिया गया है 8. हालांकि हम हमारे अपने सिस्टम पर इस बंधाव विधि नहीं किया है, / THPTA CuAAC है तुलनीय उत्पादन की उम्मीद होगी oxygenated वातावरण सहिष्णुता की अतिरिक्त सुविधा के साथ BDA / CuAAC से, परिणाम है.
जानबूझकर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्री के चारों ओर इस प्रोटोकॉल के विकास के बावजूद, हम अभी भी लागत लाभ और synthesizing के की वृद्धि लचीलापन पहचान करना चाहते हैंazides और alkyne जांच के साथ साथ इस्तेमाल किया. Azidohomoalanine के रूप में छोटा रूप में तीन दिनों में और वाणिज्यिक स्रोतों की तुलना में काफी कम समय के लिए तैयार किया जा सकता 6,12 रिपोर्टेड तनावपूर्ण alkyne तैयारी अधिक 11 मुश्किल है लेकिन जांच के चयन के अधिक से अधिक स्वतंत्रता वहन कर रहे हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम धन के लिए NSF के (CBET 0,846,259) स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
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References
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