Summary
아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록 설계되었습니다
Abstract
바이러스 입자의 수정은 유전자 치료, oncolytic 응용 프로그램 및 백신 개발에 영향을 미치는위한 엄청난 잠재력에 대한 관심의 상당 금액을 받았습니다. 대부분은 유전학 기반입니다 바이러스 표면, 수정에 1,2,3 전류 접근법은 종종 감쇠에 걸리다 바이러스 생산, 감염 및 세포 형질 도입. 4,5 chemoselective 클릭 화학을 사용하여, 우리는 매우 유연하고 접근을 모두 유지하면서 이러한 문제를 sidesteps 간단한 대안적인 접근 방식을 개발했습니다. 1,2
이 프로토콜의 목표는 아데노 바이러스 타입 5 입자의 표면을 수정 bioorthogonal 클릭 화학을 이용의 효율성을 입증하는 것입니다. 그것이 단백질에 타겟팅 분자, 염료 또는 관심있는 다른 분자의 chemoselective 결합을 허용으로이 두 단계 프로세스는 모두 therapeutically 1 또는 analytically, 2,6 사용할 수 있습니다azide 태그로 미리 분류. 이 방법의 세 가지 주요 장점은 (1) 신진 대사 라벨링은 바이러스성 적합성에 영향, 1,7에 약간을 보여주는 것이있다 (2) 효과기 리간드의 다양한 배열이 활용될 수 있으며, (3) 그것은 매우 빠르고, 신뢰할 수있다 액세스가 용이합니다. 1,2,7
이 절차의 첫 단계에서 아데노 바이러스 입자는 기능 azide (-N 3)를 포함 둘 다 azidohomoalanine (아하, 메티오닌 대리) 또는 부자연스러운 설탕 O-연결된 N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz) 중 하나를 베어링 생산됩니다 그룹. azide으로 수정한 바이러스 입자의 정화 후, 형광 TAMRA 잔기를 포함하는 alkyne 프로브 미리 표시된 단백질이나 glycoproteins에 chemoselective 방식으로 출혈도 잡았있다. 마지막으로, SDS-PAGE 분석은 바이러스 capsid 단백질에 프로브의 성공적인 결합을 설명하기 위해 수행됩니다. 아하의 설립은 모든 바이러스 capsid를 붙여 표시됩니다단백질 (Hexon, Penton 및 섬유), 전용 섬유의 라벨에있는 O-GlcNAz의 설립 결과 동안.
이런 진화 필드에 azide - alkyne 내고 여러 가지 방법이 성공적으로 개발되었습니다 있지만 우리가 가장 편리한 것으로 나타났습니다만이 두 사람은 본 시연 - 스트레인 추진 azide - alkyne의 cycloaddition (SPAAC)과 구리 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (CuAAC) deoxygenated 분위기 하에서.
Protocol
이 프로토콜에서 참조하는 모든 미디어, 버퍼 및 솔루션의 준비를 위해 표 1을 참조하십시오.
1. AHA-라벨 아데노 바이러스의 제작
- 그들이 80에 도달하기 전까지 37 ° C에서 HEK 293 세포 성장 매체에 유지 인간의 배아 신장 세포 때문이죠 100-mm 조직 배양 접시 (HEK 293)를 (표 1 참조) 준비 - 90 % confluency. (참고 :. 90% 이상 confluency와 문화가 감염하고 원하는대로 바이러스를 생산하지 않을 수 어려울 수 있습니다)
- 첫째 후 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1 ×) 1 ML에서 한 분 동안 세포를 잠복기, TD 버퍼의 5 ML과 함께 한 rinsing, 성장 매체를 제거하여 요리 중 하나에서 셀을 풀어.
- HEK 293 세포 성장 매체 9 ML을 추가하고이 요리에서 수확 HEK 293 세포의 수를 세어 hemocytometer를 사용합니다. multiplicit를 사용하여 감염에 필요한 아데노 바이러스 타입 5 (Ad5)의 양을 계산하기 위해이 번호를 사용하여10 PFU / 세포의 감염의 Y (방어) 값. 정상 Ad5 들어, 감염 지수 (입자의 총수에 대한 전염성 입자의 비율) 일반적으로 1시 20분는 사실을위한 계정.
- 감염 버퍼의 10 ML을 준비합니다.
- 천천히 TD 버퍼의 5 ML로 씻어 다음 10 남은 문화와 요리에서 HEK 293 세포 성장 매체를 제거합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 각각의 접시와 부화 감염 버퍼 1 ML을 추가합니다. 이 감염 기간 동안 부드럽게 15 분 간격으로 측면으로 각 문화 요리 측을 신난다.
- 감염 후 18 시간 동안 37 ° C에서 신선한 HEK 293 세포 성장 매체와 부화 9 ML에 추가합니다.
- 아하 라벨 매체 (또는 컨트롤에 대한 컨트롤 매체들을 만났고) 100 ML을 준비합니다. 레이블링 미디어를 준비하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 집중 재고 솔루션을 필터링해야합니다.
- 신중하게 (그래서 같은 감염된 세포를 멀리 씻어 없습니다) 18 시간 후 HEK 293 세포 성장 매체를 제거ND는 TD 버퍼의 5 ML 각 문화 접시를 씻는다.
- TD 버퍼 세척 용액을 제거하고 각 문화 접시에 아하 라벨 매체의 10 ML에 추가합니다. 컨트롤의 경우 메티오닌 제어 매체는이 단계에서 대신 아하 라벨 매체를 사용해야합니다.
- 6 시간 동안 37 ° C에서 매체를 레이블링에 감염된 세포를 품어. 레이블은 12 사이에 언제든지 실시 가능 - 24 시간 이후 감염되지만이 기간이 6 시간 이하 여야한다. 보장 감염이 크게 줄어들되지 않는 동안이 간격은 바이러스 구조 단백질 번역과 중복을 최대화하기 위해 결정되었다 7.
- 신중하게 라벨 매체를 제거하면 이렇게 같은 세포를 중단하는 수 없습니다. 각 요리에 신선한 HEK 293 세포 성장 매체의 10 ML을 추가하고 또 다른 18 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 이 단계 동안에 감염된 세포의 손실을 최소화하기 위해서는 전적으로 라벨 솔루션을 제거할 필요는 없습니다. HEK 293 세포 성장 매체는 M의 초과를 포함동부 표준시 이는 잔여 아하을 outcompete 것입니다.
- 정화를 위해 3 단계로 진행합니다.
2. Azido - 설탕 - 라벨 아데노 바이러스의 제작
- 최대 및 단계 1.5를 포함한 AHA-라벨 아데노 바이러스 생산이라는 절차를 따르십시오.
- Azido - 설탕 라벨 매체의 100 ML을 준비합니다.
- 44 시간 동안 37 ° C에서 신선한 Azido - 설탕 라벨링 매체와 부화 10 ML과 세포를 커버.
3. Azide 라벨이 표시된 Adenoviral 입자의 정제
- 각 문화 요리와 원뿔 튜브로 전송에서 감염된 세포와 함께 미디어를 제거합니다. 4에서 10 분 동안 2천g에서 원심 ° C. 표면에 뜨는를 제거하고 TD 버퍼의 펠렛을 (10 요리 당 TD 버퍼 8 ML 사용) resuspend.
- 액체 질소와 37 ° C의 물을 욕조의 Dewar 플라스크를 사용하여 반복 (3 이상) 냉동 해동 사이클에 의해 감염된 세포를 Lyse. 10 분 동안 2천g에서 원심 분리기4에 ° C 뜨는에서 세포 파편을 분리합니다.
- 첫번째 울트라 클리어 원심 튜브에 1.25 G / ML CsCl 용액 2.5 ML을 pipetting하여 CsCl 밀도 기울기 원심 튜브를 준비합니다. 그런 다음 천천히 그라디언트 인터페이스를 방해하지 않도록 돌보는 1.4 G / ML CsCl 솔루션의 2.0 ML을 추가하는 튜브 하단에 위치의 팁과 피펫을 사용합니다.
- CsCl 밀도 구배 관의 꼭대기에서 단계 3.2에서 뜨는을 피펫 및 튜브를 채우기 위해 필요한 추가 TD 버퍼 경우. 15에서 1 시간을위한 125,000그램에서 스윙 버킷 로터 ° C ultracentrifuge에서에서 샘플을 원심 분리기.
- ultracentrifugation 완료 후, 바이러스 입자는 두 CsCl 솔루션의 인터페이스에서 두꺼운 흰색 밴드로서 표시한다. 솔루션 dropwise 드레인 수 있도록 무균 바늘과 튜브의 하단에 작은 천공을 만듭니다.
- 두꺼운 흰색 밴드를 모아서 어느 끝, 라벨 Ad5 입자를 포함한다g 보험 초과 CsCl 솔루션을 제외할 수 있습니다. 바이러스 레이어 위에 밴드 것입 세포 단백질 수집을 피하십시오. 또한 약간 두꺼운 흰색 바이러스 밴드 위에 라이터 레이어를 형성 빈 virion의 capsids을 제외할 수 있습니다.
- 선택적으로 레이블 Ad5 입자의 최종 정화를 수행합니다. 3.6 단계에서 4-ML ultracentrifuge 튜브에 수집한 분수를 추가하고 1.35 G / ML CsCl 용액으로 튜브를 입력하십시오. 15 ° C에서 18 시간 동안 12만5천그램에서 원심과 같이 3.5 및 3.6에 설명된대로 튜브의 중간에 형성 두꺼운 흰색 밴드를 수집합니다. (바이러스 titer가 낮은 경우, 흰색 밴드는 두 번째 원심 분리 후 보이지 않을 수도 있고, 그것이 표시된 바이러스를 복구할 수 없습니다됩니다.)
- 오랜 기간 동안 바이러스 입자의 저장 용량은 수집된 바이러스 추출물의 투석은 바이러스 저장소 버퍼에 대해 수행해야합니다. -80 ° C.에 dialyzed 바이러스 샘플을 저장
4. 리스트레인 프로모션 Azide-Alkyne Cycloaddition를 사용 Alkyne 프로브와 수정된 Adenoviral 입자의 gation (SPAAC)
- 바이러스 스토리지 버퍼에 azide으로 수정한 Ad5 50 μl의 솔루션으로, SPAAC의 라벨링 솔루션의 0.25 μl를 추가합니다. (상용 무한 alkynes의 venders 목록은 시약의 테이블 참조).
- 실온에서 하룻밤을 수행하기 위해 스트레인 추진의 cycloaddition 반응을 허용합니다. 불빛에 민감한 프로브 (예 TAMRA)를 사용하는 경우, 알루미늄 호일과 반응 용기를 포괄합니다.
- 6 단계에 따라 레이블이 바이러스를 정화.
5. Deoxygenated 분위기에서 구리 (I) 촉매 Azide-Alkyne의 Cycloaddition (CuAAC)를 사용 Alkyne 프로브와 수정된 Adenoviral 입자의 결합
- 구리의 장소 7.2 밀리그램 (I) Eppendorf 튜브에 브로마이드 (CuBr) 분말은 알루미늄 박으로 덮여.
- 두 번째 Eppendorf 튜브에 DMSO의 피펫 1 ML.
- 준비삼분의 일 Eppendorf 튜브에 CuAAC의 라벨링 솔루션의 50 μl. alkyne 프로브는 불빛에 민감한 경우 알루미늄 박으로 표지 (예 : TAMRA-Alkyne).
- 6 시간 동안 deoxygenated 장갑 가방 속에 세 개의 Eppendorf 튜브, uncapped를 놓습니다. 모든 샘플 CuAAC 반응의 완료까지 장갑 가방 내부에 유지됩니다.
- 5.4 단계에 따라 deoxygenated되었습니다 둘 다, CuBr 분말 7.2 MG로 DMSO의 1 ML을 추가하여 CuBr 50 × 주식 솔루션을 준비합니다.
- 5.4 단계에 따라 deoxygenated되었습니다 CuAAC 라벨 솔루션, 50 μl에이 CuBr 주식 솔루션 1 μl를 pipetting하여 CuAAC 반응을 시작하라. 장갑 가방 안에서 12 시간 동안 진행하는 반응을 허용합니다.
- 6 단계에 따라 레이블이 바이러스를 정화.
6. 라벨 바이러스 입자의 정제 및 저장
- Centri-9월 겔 여과 스핀 C를 사용하여 레이블이 붙은 바이러스 샘플을 정화제조 업체의 지침에 따라 바이러스 저장소 버퍼와 equilibrated olumns.
- 양자 택일로, 정화는 바이러스 저장소 버퍼에 대한 투석에 의해 수행 할 수 있습니다.
- 레이블이 붙은 바이러스 입자는 -80 ° C.에 저장해야합니다
7. 라벨 아데노 바이러스 및 형광등 젤 스캔 SDS-PAGE
- 10 분 대한 분류 바이러스와 종기 투석을 20 μl 20 μl Laemmli 샘플 버퍼 (2 ×)를 추가합니다. precipitates 어떤 불용성을 제거하는 30 초 동안 샘플을 원심 분리기. 잔여 구리는 정화 후 있으면 샘플을 끓고 것은 시각화하는 동안 어려움을 초래, SDS-PAGE 젤의 단백질 굵은 줄무늬가 발생할 수 있습니다. 이 경우이 단계에서 샘플의 끓는를 ...없이 지내다.
- 전기 영동 세포로 겔 카세트를 첨부하고 실행 버퍼를 추가합니다. 바이러스성 단백질 샘플 우물의 필요한 숫자를로드합니다. 물론 사전에 왠 일이야를로드하는 하나를 사용하여네드 분자량 마커. 200으로 1 시간을위한 젤을 실행 V. 전체 기간 동안에 알루미늄 박으로 덮여 전기 영동 세포가 형광단 라벨의 photobleaching 줄이기 위해 유지.
- 최고 해상도와 모든 자유 형광단를 제거하는 경우, 추적 염료는 전기 영동 중에 젤 부족 수 있습니다. 전기 영동을 중지하고 신속하게 형광등 겔 스캐너로 젤을 전송하고 적절한 파장 (TAMRA에 대한 574 nm의)에서 형광 방출을위한 젤을 검사합니다.
- 각 바이러스성 입자의 복합 염료 분자의 갯수는 몇 가지 표준 TAMRA의 농도의 형광을 측정하고 단계 7.3에서 샘플을 가지고 비교하여 계량하실 수 있습니다.
8. 대표 결과
SDS-PAGE & TAMRA - 복합 Ad5의 형광 겔 검사의 관찰된 결과는 그림 3에 표시됩니다. 이러한 형광 겔 스캔 샘플 modi에서 수행 되었으나프로브가 SPAAC 통해 출혈도 잡았 때 CuAAC 통해 얘기 들이었다, 결과는 비교할 수 있어야합니다. 이러한 겔 스캔에 따르면 세 Ad5 capsid 단백질 (Hexon, Penton 및 섬유)의 수정에 아하 라벨 결과, 설탕 라벨링에만 섬유 capsid 단백질을 수정하면서. 또한, 아하 농도의 증가 (4 MM 대 32 MM)가 아하의 정관의 큰 정도의 결과지만, 또한 감염을 줄일 보여왔다. 이전 결과 7 4mm짜리에서 생산 Ad5위한 아하, 노출 메티오닌 사이트의 대략 5 % 32 밀리미터 아하가 사용될 때이 숫자는 10 %로 증가와 함께 TAMRA - 수정된 것을 나타냅니다. 이것은 각각 약 280 및 510, Ad5 입자 당 염료 라벨이 사이트에 해당합니다. 설탕 - 라벨 1의 분석은 대략 22 Ad5에서 36 글리코 실화 사이트가 azido 설탕에 의해 점령과 이후 TAMRA으로 표시되는 지적했다.
설명된대로 열 조직 배양 플레이트는 azide으로 수정한 Ad5를 생산하기 위해 사용하는 경우 이 프로토콜에서, 200 - azide으로 수정한 바이러스 300 μl는 약 1.5의 titer × 10 12 입자 / ML로 단계 3.6에서 수집한 흰색 밴드에서 얻을 수 있습니다. 이 절차의 일반적인 난이도는 낮은 바이러스 titer에 의한 것이이 정화 단계에서 바이러스 밴드의 부재이다. 감염 후 접시에서 느슨하게지게하는 - - 1 단계 기간 동안 rinsing 동안 이것은 일반적으로 하나 이상 또는 이하 - 지류, 또는 세포를 떠내려가는하여있는 세포를 감염의 결과입니다.
그림 1. 프로토콜 개요. Azide 함유 아하 또는 GalNAz 처음 아데노 바이러스 입자에 통합됩니다. 형광 alkyne 프로브로 내고 그 다음 "클릭"화학을 통해 수행됩니다. 마지막으로, SDS-PAGE는 형광 프로브의 결합을 설명하는 데 사용됩니다.
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그림 2. 진입 alkyne 프로브의 결합 azide-수정된 드 산소 이하 () SPAAC, (B) CuAAC 그리고 (c) 산소 분위기를 통해 바이러스를.
그림 3. TAMRA - Alkyne와 CuAAC 활용 후 azide-라벨이 아데노 바이러스 타입 5 (Ad5)의 SDS-PAGE의 형광 스캔. () 아하의 두 농도를 이용하여 Ad5 AHA-라벨. 레이블이 증가 아하 농도와 함께 증가 라벨의 범위로, 아데노 바이러스 Hexon, Penton 및 섬유 capsid 단백질에서 발생하는 것으로 나타납니다. (B) AC 4 GalNAz-라벨 아데노 바이러스는 섬유 capsid 단백질을 분류하는 것 같아요.
| 용액 | 준비 | 노트 |
| Ad5 저장 버퍼 | 5 MM 트리스-HCL 버퍼 (산도 8.0)가 0.5 밀리미터를 포함 MgCl 2, 50 MM NaCl, 25 % (V / V) 글리세롤 및 0.05 % (W / V) 소 혈청 알부민 (BSA) | -20 ° C에서 저장 |
| Ad5 감염 버퍼 | 2퍼센트 (V / V) 소 송아지 혈청, 1 × TC 솔루션 Ad5 저장 버퍼 (방어 10 PFU / 전지 및 1시 20분의 감염 지수를 사용하여 결정 볼륨). TD 버퍼를 사용하여 최종 볼륨에 대한 해결책을 지참 | Ad5 농도는 자외선을 흡수를 통해 확인할 수 있습니다. |
| TC 솔루션 (200 ×) | 136 MM CaCl 2, 100 밀리미터 MgCl 2 | 4에서 저장 ° C |
| TD 버퍼 | 137 MM NaCl, 5 KCl 밀리미터, 밀리미터에게 나 2 HPO 4, 25 MM 트리스-HCL, 산도 7.5를 0.07 | 4에서 저장 ° C |
| HEK 293 세포 성장 매체 | Dulbecco의 수정일 이글 배지 (DMEM)는 10 % (V / V) 소 송아지 혈청 (BCS)와 1 % (V / V) 펜 Strep과 보충 | 4에서 저장 ° C |
| Cys 증권 솔루션 (100 ×) | DMEM는 (-메트로 /-Cys) 200 MM L-시스테인과 보충 | 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다. |
| 아하 스톡 용액 (25 ×) | DMEM는 (-메트로 /-Cys) 100 MM L-Azidohomoalanine로 보충 | 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다. |
| 아하 라벨 매체 | DMEM는 (-메트로 /-Cys) 2 MM L-시스테인 10% BCS, 아하 주식 용액 (1 ×)로 보충 | 사용하기 전에 신선한 준비합니다. 이건 4 MM C에 해당아하의 oncentration 다른 농도는 (대표 결과 참조) 사용될 수 있지만. |
| 메트로 주식 용액 (25 ×) | DMEM는 (-메트로 /-Cys) L-메티오닌 100 MM로 보충 | 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다. |
| 메트로 제어 매체 | DMEM는 (-메트로 /-Cys) 주식 용액 (1 ×)를 만나 10 % BCS와 보완이 MM L-시스테인 | 사용하기 전에 신선한 준비합니다. |
| AC 4 GalNAz 주식 솔루션 (1,000 ×) | 메탄올에서 50 밀리미터 peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) | 4 ° C.에 저장 AC 4 GalNAz은 GlcNAz으로 신진 대사 전구체이다. |
| Azido - 설탕 라벨 매체 | 100 μl AC 4 GalNAz 주식 솔루션, 100 ML HEK 293 세포 성장 매체 | 메탄올은 HEK 293 세포 성장 매체를 추가하기 전에 증발하도록 허용합니다. |
| 세슘 염화물 솔루션 | CsCl은 TD 버퍼에 녹아 : 1.25 G / ML (18.08 g / 50 ML H 2 O) 1.35 G / ML (25.60 g / 50 ML H 2 O) 1.40 G / ML (31.00 g / 50 ML H 2 O) | ultracentrifugation에 대한 밀도 기울기 |
| 바이러스 스토리지 버퍼 | 인산염은 CaCl 2, 0.9 밀리미터 MgCl 2, 10 % (V / V) 글리세롤 0.5 밀리미터를 포함, 식염수 (PBS), pH를 7.2 버퍼 | -20 ° C에서 저장 |
| TAMRA-BCN (SPAAC) 라벨링 솔루션 | DMSO의 TAMRA-BCN :
| 스트레인 추진 alkyne 프로브 SDS-PAGE, 대략 10 12 입자 / ML의 바이러스 titer가 제안되어 들어 |
| TAMRA-Alkyne (CuAAC) 라벨링 솔루션 | 바이러스 스토리지 버퍼에 azide으로 수정한 Ad5 (N Ad5 위의 같이 결정) 50 μl, 1.5 밀리미터 batho phenanthroline disulfonate (예 : 1.5 × 최종 CuBr 농도), TAMRA-Alkyne. TAMRA-Alkyne의 molarity는 (M)을 사용하여 결정됩니다 : C 하시죠 = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (5 단계에서 준비 반응 혼합물은 virion 당 100 alkyne 프로브를 포함하고 있으므로) | 트리스 버퍼는 구리의 경쟁력과 억제 리간드로 알려져있다 8. |
| Laemmli 샘플 버퍼 (2 ×) | 125 MM 트리스-HCL (산도 6.8), 4 % (W / V)은 SDS, 20 % (V / V) 글리세롤 10 % (V / V) 2 - 메르 캅 토 에탄올, 그리고 0.004 % (W / V) bromophenol 블루 | |
| 버퍼를 실행 | 187 MM 글리신, 19 MM 트리스-HCL, H 2 O 3.5 MM SDS | 4에서 저장 ° C |
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Discussion
azides의 포함 chemoselective 및 bioorthogonal 클릭 반응,의 개발 연구가 빠르게 진화 영역이며, 이후 bioconjugation 어플 리케이션에 선택할 수있는 이러한 반응의 증가가있다. 우리는 우리 자신의 실험실 및 모든 시약의 상업적인 가용성으로 인해 그들의 유용성 때문에 선택받은 단 두 가지 방법을 포함하도록이 프로토콜의 범위를 제한했습니다.
최초의 루트에서는 - 스트레인 추진 azide - alkyne의 cycloaddition (SPAAC) - alkyne은 cyclooctyne 링 (그림 2A) 내에 포함되어 있습니다. 이것은 최근에 개발된 방법은 산소 분위기 아래와 구리 촉매에 대한 필요성없이 진행하실 수 있습니다. 9,10는 최근까지이 방법 중 하나 단점은 터미널에 사용 alkynes에 비해 이러한 무한 alkynes의 힘드는 합성과 감소 상업적 가용성이었다 구리 (I) 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (잘라내기AAC는)하지만, 이러한 프로브의 증가 도서관 (시약의 테이블 참조) 현재 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는이 프로토콜의 선택의 방법으로 SPAAC을 선택하셨습니다.
또한 chelating 에이전트 (그림 2B)로 bathophenanthroline disulfonic 산 나트륨 염 (BDA)를 사용 deoxygenated 분위기 CuAAC 통해 azide-수정된 adenoviral 입자의 결합은이 프로토콜에 설명되어. 이 방법은 BDA 촉매는 상업적으로 사용 가능하고 저렴한 모두 있는지에 편리합니다. 또한, 수확량은 일반적으로 사용 가능한 방법 중 최고이며, 용액의 반응성 산소 종의 생성 (참조하라 아래, CuAAC를 산소)로 인해 발생하는 합병증을 피할 수있다보고 8.는 그러나, 구리 (I) 촉매는 세포 독성 것으로 알려져있다, 11이 절차를 구현하는 데 필요한 전문 장비를 사용하는 일부 집단을 억제 수도 있습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는이 방법이 효율적이고 유용아데노 바이러스 수정.
CuAAC의 3 분의 유용한 방법은 최근에 산소를 대기 상태 (그림 2C)에서 작동하도록 개발되었습니다. 8이 방법은 BDA-chelated 접근 방식과 동일한 혜택을 누리고 있지만의 산화 파괴하지 않고 대기 산소를 수용하기 위해 chelating업자로 대신 THPTA 사용 기판. 이 chelating 에이전트의 직접적인 syntheses가보고되어 있지만,이 접근법의 하나 작은 단점은, THPTA의 상업적인 가용성의 현재 없다는 것입니다. 8 우리가 우리 자신의 시스템이 결합 방법을 수행하지 않지만 THPTA / CuAAC가 비교 생산할 것으로 예상됩니다 산소 분위기 허용의 추가 편의와 BDA / CuAAC에 대한 결과입니다.
의도적으로 상용 자료 중심이 프로토콜의 개발에도 불구하고, 우리는 여전히 비용 장점과를 합성의 증가 유연성을 인식하고자하는azides과 본 이용 alkyne 프로브. Azidohomoalanine는 짧은 셋처럼 일 및 상업 소스보다 훨씬 적은 비용으로 준비하실 수 있습니다. 6,12가 긴장 alkyne을 준비보다 11 어렵지만 프로브 선택의 큰 자유를 살 수 있습니다했다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리 기금 (CBET-0846259)에 대한 NSF 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
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References
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