Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

doi: 10.3791/4246 Published: August 19, 2012

Summary

Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker bevatten

Abstract

De wijziging van virusdeeltjes heeft een aanzienlijk deel van de aandacht voor zijn enorme potentieel voor invloed gentherapie, oncolytische toepassingen en de ontwikkeling van vaccins. 1,2,3 huidige aanpak op de wijziging van virale oppervlakken, die meestal op basis van de genetica, vaak last van demping van het virus productie, infectiviteit en cellulaire transductie. 4,5 Met behulp van chemoselectieve klik chemie, hebben we een duidelijke alternatieve benadering, waarin deze aspecten omzeilt, terwijl de resterende zowel zeer flexibel en toegankelijk. 1,2

Het doel van dit protocol is om aan te tonen de effectiviteit van het gebruik van bioorthogonal klik chemie aan de oppervlakte van adenovirus type 5 deeltjes te wijzigen. Deze twee stappen kunnen zowel therapeutisch 1 of analytisch, 2,6 worden gebruikt als het zorgt voor chemoselectieve ligatie van targeting moleculen, kleurstoffen of andere moleculen van belang op eiwittengelabelde met azide tags. De drie grote voordelen van deze methode zijn dat (1) metabole etikettering weinig tot geen invloed op de virale fitness, 1,7 laat zien (2) een brede waaier van effector liganden kan worden gebruikt, en (3) het is opmerkelijk snel, betrouwbaar en makkelijk te bereiken. 1,2,7

In de eerste stap van deze procedure worden adenoviruspartikels geproduceerd met een azidohomoalanine (Ha een methionine surrogaat) of onnatuurlijke suiker O-gekoppelde N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), die beide de azide (N-3) functionele groep. Na zuivering van azide gemodificeerde virus deeltjes wordt een alkyn probe met de fluorescerende TAMRA groep geligeerd in chemoselectieve wijze de pre-gemerkte eiwitten of glycoproteïnen. Tenslotte is een SDS-PAGE analyse uitgevoerd om de succesvolle ligatie van de probe aangetoond op het virale capside eiwitten. Aha opname wordt getoond aan alle virale capside-labeleiwitten (Hexon, Penton en Fiber), terwijl O-GlcNAz opname resulteert in de etikettering van Fiber alleen.

In deze ontwikkelende gebied zijn er verschillende methoden voor het azide-alkyn ligatie met succes ontwikkeld, maar alleen de twee die we hebben gevonden zijn meest handige handleiding worden aangetoond - stam-bevorderd azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) en koper-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) onder zuurstofarme atmosfeer.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zie tabel 1 voor de bereiding van alle media, buffers en oplossingen die in dit protocol.

1. Productie van Aha-gelabelde adenovirus

  1. Bereid elf 100 mm weefselkweekschalen menselijke embryonale niercellen (HEK 293) gehandhaafd HEK293 cellen groeimedium (zie tabel 1) bij 37 ° C tot het bereiken 80 - 90% confluentie. (Opmerking:. Cultures met confluentie dan 90% kan moeilijk te infecteren en mogelijk niet virussen gewenst)
  2. Draai de cellen in een van de schotels door eerst het groeimedium spoelen eenmaal met 5 ml buffer TD vervolgens de cellen te incuberen gedurende een min in 1 ml trypsine-EDTA (1 x).
  3. Voeg 9 ml van HEK293 cellen groeimedium en gebruikt een hemocytometer het aantal geoogste HEK293 cellen tellen van de schotel. Dit nummer de hoeveelheid adenovirus type 5 (Ad5) vereist voor infectie berekenen volgens een multiplicity van infectie (MOI) 10 pfu / cel. Rekening met het feit dat voor normale Ad5 de infectiviteit index (verhouding van infectieuze deeltjes tot het totale aantal deeltjes) typisch 1:20.
  4. Bereid 10 ml infectie buffer.
  5. Verwijder langzaam de HEK 293 celgroei medium uit de tien overgebleven cultuur gerechten, daarna wassen met 5 ml van TD buffer. Voeg 1 ml buffer infectie elke schaal en incuberen bij 37 ° C gedurende 1 uur. Tijdens deze infectie periode, schud elke cultuur schotel kant naar de andere op 15-min intervallen.
  6. Na infectie, voeg 9 ml verse HEK293 cellen groeimedium en incuberen bij 37 ° C gedurende 18 uur.
  7. Bereid 100 ml Aha etikettering medium (of Met controle medium voor de controle). Zorg ervoor dat de geconcentreerde stamoplossing te filteren met een 0,2-um steriele spuit filter voor de voorbereiding van de etikettering media.
  8. Voorzichtig (om niet weg te wassen van de geïnfecteerde cellen) te verwijderen van de HEK 293 cellen groeimedium na 18 uur eennd wassen elke cultuur schotel met 5 ml van TD buffer.
  9. Verwijder de TD buffer wasoplossing en voeg 10 ml van Aha etikettering medium om elke cultuur gerecht. Voor een controle, moet methionine controle medium in plaats van de Aha etikettering medium gebruikt worden bij deze stap.
  10. Incubeer de geïnfecteerde cellen labelen medium bij 37 ° C gedurende 6 uur. Labeling kan worden uitgevoerd elk tussen 12 - 24 uur na infectie maar niet langer dan 6 uur duren. Dit interval is vastgesteld om overlappingen te maximaliseren met virale structurele eiwitten vertaling en tegelijkertijd besmettelijkheid is niet significant verminderd. 7
  11. Verwijder voorzichtig het etiket medium om te voorkomen dat de cellen verstoren. Voeg 10 ml vers HEK293 cellen groeimedium elke schotel en incuberen van de cellen bij 37 ° C gedurende nog eens 18 uur. Om verlies van geïnfecteerde cellen te minimaliseren deze stap is niet noodzakelijk etikettering oplossing volledig verwijderen. De HEK 293 cellen groeimedium bevat een overmaat van Met die wegconcurreren resten Aha.
  12. Ga verder met stap 3 voor zuivering.

2. Productie van azido-Sugar-gelabelde adenovirus

  1. Volg de procedure met de titel De productie van Aha-label Adenovirus tot en met stap 1.5.
  2. Bereid 100 ml azido-suiker etikettering medium.
  3. Bedek de cellen met 10 ml verse azido-suiker labeling medium en incuberen bij 37 ° C voor 44 uur.

3. Zuivering van azide-gelabeld Adenovirale Particles

  1. Verwijder het medium met de geïnfecteerde cellen per kweekschaal en transfer naar conisch. Centrifugeer bij 2.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in buffer TD (met behulp van 8 ml van de TD-buffer per 10 gerechten).
  2. Lyseren de geïnfecteerde cellen door herhaalde (3 of meer) vries-ontdooi cycli met een dewarvat vloeibare stikstof en 37 ° C waterbad. Centrifugeer bij 2.000 g gedurende 10 minbij 4 ° C celresten te scheiden van de supernatant.
  3. Maak een CsCl dichtheidsgradiënt centrifugebuis door eerst pipetteren 2,5 ml van 1,25 g / ml CsCl oplossing in een Ultra Clear centrifugebuis. Vervolgens gebruikt een pipet met de punt aan de onderkant van de buis langzaam toevoegen van 2,0 ml 1,4 g / ml CsCl oplossing te vermijden dat de gradiënt-interface verstoren.
  4. Pipetteer het supernatans van stap 3.2 bovenop de CsCl dichtheidsgradient buis en eventueel toevoegen TD buffer aan de buis vullen. Centrifugeer de monsters in een zwaaiende emmer rotor op 125.000 g gedurende 1 uur bij 15 ° C in een ultracentrifuge.
  5. Na voltooiing van ultracentrifugatie moet de virusdeeltjes zichtbaar als een dikke band op het grensvlak van de twee CsCl oplossingen. Een kleine perforatie in de bodem van de buis met een steriele naald om de oplossing kan afvloeien toegedruppeld.
  6. Verzamel de dikke witte band, moet bevatten de gelabelde Ad5 deeltjes, taking zorg overmaat CsCl oplossing sluiten. Voorkom verzamelen cellulaire eiwitten die band boven het virus laag. Bovendien sluiten lege virion capsiden waarbij een lichtere laag iets boven de dikke witte virus band op te richten.
  7. Optioneel, een laatste zuivering op het label Ad5 deeltjes. Voeg de verzamelde fractie van stap 3,6 tot 4 ml ultracentrifuge buis vullen van de buis met 1,35 g / ml CsCl oplossing. Centrifugeer op 125.000 g gedurende 18 uur bij 15 ° C en het verzamelen van de dikke witte band die vormt in het midden van de buis zoals beschreven in stap 3.5 en 3.6. (Als de virale titer laag is, witte band niet zichtbaar na de tweede centrifugatie en het niet mogelijk met de gelabelde virus terug).
  8. Voor de opslag van de virusdeeltjes gedurende lange tijd moet dialyse van de verzamelde virus extract worden uitgevoerd ten opzichte virus opslagbuffer. Bewaar de gedialyseerd virus monsters bij -80 ° C.

4. Liplichting van gemodificeerde Adenovirale Deeltjes met Acetyleenalkoholen Probes Met behulp van Stam-Gepromoveerd azide-alkyn cycloadditie (SPAAC)

  1. Aan een oplossing van 50 pi van azide gemodificeerde Ad5 in opslagbuffer virus, voeg 0,25 pl SPAAC labelingoplossing. (Zie de tabel van reagentia voor een lijst van venders van commercieel beschikbare gespannen alkynen).
  2. Laat de stam-bevorderd cycloadditiereactie om 's nachts te gaan bij kamertemperatuur. Als een lichtgevoelige sensor (bijvoorbeeld TAMRA) wordt gebruikt, omvatten het reactievat met aluminiumfolie.
  3. Zuiver het gemerkte virus volgens stap 6.

5. Ligatie van gemodificeerde Adenovirale Deeltjes met Acetyleenalkoholen Probes het gebruik van koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) in zuurstofarme atmosfeer

  1. Plaats 7,2 mg koper (I) bromide (CuBr) poeder in een Eppendorf buis met aluminiumfolie.
  2. Pipet 1 ml van DMSO in een tweede eppendorfbuisje.
  3. Bereiden50 pi CuAAC labelingoplossing in een derde eppendorfbuisje. Dek af met aluminiumfolie als de alkyn sonde is licht-gevoelig zijn (bijvoorbeeld TAMRA-alkyn).
  4. Plaats de drie Eppendorf-buisjes, de afgetopte, in een zuurstofarme handschoen tas voor 6 uur. Alle monsters moeten blijven binnen de handschoen zak tot aan de voltooiing van de CuAAC reactie.
  5. Bereid een 50 x voorraadoplossing van CuBr door 1 ml DMSO 7,2 mg CuBr poeder, die beide zijn gedeoxygeneerd volgens stap 5.4.
  6. Start de CuAAC reactie van pipetteren 1 pi van dit CuBr stockoplossing 50 pi CuAAC labelingoplossing, die is gedeoxygeneerd volgens stap 5.4. Laat de reactie te laten verlopen voor 12 uur binnen in de handschoen zak.
  7. Zuiver het gemerkte virus volgens stap 6.

6. Zuivering en opslag van gelabelde virusdeeltjes

  1. Zuiver het gemerkte virus monsters met behulp van Centri-sep gelfiltratie spin-columns evenwicht gebracht met Virus opslagbuffer, volgens de richtlijnen van de fabrikant.
  2. Als alternatief kan zuivering uitgevoerd door dialyse tegen Virus opslagbuffer.
  3. De gelabelde virusdeeltjes moeten worden bewaard bij -80 ° C.

7. SDS-PAGE van gelabelde adenovirus en TL-Gel Scanning

  1. Voeg 20 pi Laemmli monsterbuffer (2x) en 20 pi van gezuiverd gelabeld virus en kook gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden aan een onoplosbare precipitaten te verwijderen. Als resterende koper aanwezig na zuivering kan koken monster resulteert in dikke stroken eiwit op de SDS-PAGE gel, waardoor moeilijkheden tijdens weergave. In dit geval, afgezien koken van het monster in deze stap.
  2. Sluit de gel cassette de elektroforesecel en voeg loopbuffer. Plaats het vereiste aantal putjes met het virale eiwit monsters. Gebruik een goed te pre-stai te ladenned molecuulgewichtmerkers. Laat de gel gedurende 1 uur bij 200 V. houden de elektroforesecel met aluminiumfolie gedurende de gehele periode te verminderen fotobleken van de fluorofoor label.
  3. Voor de beste resolutie en alle gratis fluorofoor te verwijderen, laat de tracking kleurstof te raken van de gel tijdens de elektroforese. Stop de elektroforese en snel de gel over te dragen aan een tl-gel scanner en scan de gel voor fluorescentie-emissie op de juiste golflengte (574 nm voor TAMRA).
  4. Het aantal kleurstofmoleculen geconjugeerd aan elke virusdeeltje kunnen worden gekwantificeerd door het meten van de fluorescentie van verschillende standaard TAMRA concentraties en vergelijking met het monster bij stap 7.3.

8. Representatieve resultaten

De waargenomen resultaten van SDS-PAGE en fluorescerende gel scannen TAMRA-geconjugeerde Ad5 worden getoond in Figuur 3. Hoewel deze fluorescerende gel scans werden uitgevoerd op monsters modigeschied via CuAAC, moeten de resultaten vergelijkbaar zijn als probes geligeerd via SPAAC. Deze gel scans blijkt dat Ha kenmerken leidt wijziging van de drie Ad5 capside eiwitten (Hexon, Penton en Fiber), terwijl suiker kenmerken wijzigt alleen Fiber capside-eiwit. Bovendien kan een toename in Aha concentratie (4 mM tegenover 32 mM) resulteert in een grotere mate van Aha verwerking, maar ook is aangetoond dat infectiviteit verlagen. Voorafgaande resultaten 7 blijkt dat Ad5 geproduceerd 4mM Ha, ongeveer 5% van blootgesteld methionine sites TAMRA gemodificeerde met dit aantal verhogen tot 10% bij 32 mM Aha gebruikt. Dit komt overeen met ongeveer 280 en 510 respectievelijk kleurstof-gelabelde plaatsen per Ad5 deeltje. Analyse van de suiker-etikettering 1 heeft aangegeven dat ongeveer 22 van de 36 glycosylatieplaatsen op Ad5 worden bezet door een azido suiker en vervolgens voorzien van TAMRA.

Als tien weefselkweek platen worden gebruikt voor het azide-gemodificeerde Ad5 te produceren, zoals beschreven in dit protocol 200 - moet 300 pi azide gemodificeerde virus te verkrijgen van de witte band verzameld in stap 3,6, met een titer van ongeveer 1,5 x 10 12 deeltjes / ml. Een veel voorkomend probleem van deze procedure is de afwezigheid van een virale band in deze zuiveringsstap die kan worden toegeschreven aan een lage virale titer. Dit is meestal een gevolg van het infecteren cellen die ofwel over-of onder-confluent, of door het wegwassen van cellen - die raken los van de plaat na de infectie - tijdens het spoelen tijdens stap 1.

Figuur 1
Figuur 1. Protocol overzicht. Azide-houdende Aha of GalNAz voor het eerst wordt opgenomen in adenovirus deeltjes. Ligatie met een fluorescerende alkyn probe wordt vervolgens uitgevoerd via "click" chemie. Tenslotte wordt SDS-PAGE gebruikt ligatie van de fluorescerende tonen.

IGUUR 2 "/>
Figuur 2. Ligatie van alkyn probe op azide gemodificeerde virus via (a) SPAAC, (b) CuAAC onder de-zuurstof en (c) zuurstof atmosfeer.

Figuur 3
Figuur 3. Fluorescent scans van SDS-PAGE van azide gelabelde adenovirus type 5 (Ad5) na conjugatie met CuAAC TAMRA-alkyn. (A) Aha gelabelde Ad5 met twee concentraties Aha. Labeling blijkt plaats te vinden op adenovirus Hexon, penton en Fiber capside-eiwitten, met de mate van labeling toeneemt met toenemende concentratie Aha. (B) Ac 4 GalNAz gelabelde adenovirus lijkt worden voorzien alleen de fiber capside-eiwit.

Oplossing Voorbereiding Opmerkingen
Ad5 opslagbuffer 5 mM Tris-HCl buffer (pH 8,0) die 0,5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 25% (v / v) glycerol en 0,05% (w / v) Bovine Serum Albumine (BSA) Bewaren bij -20 ° C
Ad5 infectie buffer 2% (v / v) bovine kalfserum, 1 x TC oplossing Ad5 in opslagbuffer (volume bepaald met een moi van 10 pfu / cel en een infectiviteit index van 1:20). Breng de oplossing aan het uiteindelijke volume met behulp van TD-buffer Ad5 concentratie worden bepaald door UV-absorptie.
TC-oplossing (200 ×) 136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 Bewaar bij 4 ° C
TD buffer 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na 2 HPO 4 en 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 Bewaar bij 4 ° C
HEK 293 cellen groeimedium Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v / v) bovine kalfsserum (BCS) en 1% (v / v) Pen Strep Bewaar bij 4 ° C
Cys-stamoplossing (100 ×) DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 200 mM L-Cysteine Bereid verse en filter met een 0,2-um steriele spuit filter voor gebruik.
Aha stockoplossing (25 ×) DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 100 mM L-Azidohomoalanine Bereid verse en filter met een 0,2-um steriele spuit filter voor gebruik.
Aha etikettering medium DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 10% BCS, Aha stockoplossing (1 ×), 2 mM L-cysteïne Bereid voor gebruik.
Dit komt overeen met 4 mM concentration van Aha, hoewel de verschillende concentraties kunnen worden gebruikt (zie representatieve resultaten).
Met stockoplossing (25 ×) DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 100 mM L-Methionine Bereid verse en filter met een 0,2-um steriele spuit filter voor gebruik.
Met controlemedium DMEM (-Met /-Cys) aangevuld met 10% BCS Met stock oplossing (1 x), 2 mM L-Cysteine Bereid voor gebruik.
AC 4 GalNAz stockoplossing (1.000 ×) 50 mM peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) in methanol Bewaar bij 4 ° C. AC 4 GalNAz is een metabole voorloper van GlcNAz.
Azido-suiker etikettering medium 100 pi AC 4 GalNAz stockoplossing, 100 ml HEK 293 cellen groeimedium Laat methanol vóór verdampen aan het toevoegen van HEK 293 celgroei medium.
Cesiumchloride oplossingen CsCl opgelost in TD buffer:
1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H2O)
1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H2O)
1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H2O)
Dichtheidsgradiënten voor ultracentrifugatie
Virus opslagbuffer Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,2, die 0,5 mM CaCl2, 0,9 mM MgCl2, en 10% (v / v) glycerol Bewaren bij -20 ° C
TAMRA-BCN (SPAAC) labelingoplossing TAMRA-BCN in DMSO:
  1. Gebruik UV-absorbance (OD 260 Assay) de titer van het virus oplossing bepalen stap 4.1
  2. Bepaal de totale aantal virusdeeltjes de 50 pi monster (N Ad5)
  3. De TAMRA-BCN molariteit (in M) wordt bepaald met:
    c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo)
    N Avo = 6,022 × 10 23
    (Zodat het reactiemengsel bereid in stap 4 100 alkyn probes per virion bevat)
Strain-bevorderd alkyn probe
Voor SDS-PAGE een virale titer van ongeveer 10 12 deeltjes / ml wordt voorgesteld
TAMRA-alkyn (CuAAC) labelingoplossing 50 ul van azide gemodificeerde Ad5 in opslagbuffer virus (N Ad5 bepaald zoals hierboven), 1,5 mM Batho fenantroline disulfonaat (dat wil zeggen 1,5 x uiteindelijke CuBr concentratie), TAMRA-alkyn.
TAMRA-alkyn molariteit (in M) wordt bepaald met:
c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo)
(Zodat het reactiemengsel bereid in stap 5 100 alkyn probes per virion bevat)
Tris-buffer is bekend dat het een competitieve en remmende ligand van koper zijn. 8
Laemmli monsterbuffer (2 ×) 125 mM Tris-HCl (pH 6,8) 4% (w / v) SDS 20% (v / v) glycerol, 10% (v / v) 2-mercaptoethanol, en 0,004% (w / v) broomfenolblauw
Running buffer 187 mM glycine, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS in H2O Bewaar bij 4 ° C
t "> Tabel 1. Voorbereiding van de buffers en de oplossingen die nodig zijn door dit protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De ontwikkeling van chemoselectieve en bioorthogonal klik op reacties, waaronder die van aziden, is een zich snel ontwikkelende gebied van onderzoek, en vervolgens is er een groeiend aantal van deze reacties om uit te kiezen voor bioconjugation toepassingen. We hebben de reikwijdte van dit protocol om slechts twee methoden die werden omwille van hun nut gekozen in ons eigen lab en de commerciële beschikbaarheid van alle reagentia op te nemen.

In de eerste van deze route - stam-bevorderd azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) - de alkyn is opgenomen in een cyclooctyne ring (Figuur 2a). Dit onlangs ontwikkelde methode kan worden uitgevoerd onder zuurstof atmosfeer en zonder een koperkatalysator. 9,10 tot voor kort een nadeel van deze methode is de moeizame synthese en minder commerciële beschikbaarheid van deze gespannen alkynen vergeleken met de terminal alkynen in koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC), maar een groeiende bibliotheek van deze sondes is nu commercieel beschikbaar (zie tabel van de reagentia). Om deze redenen hebben we gekozen voor SPAAC als de methode van keuze in dit protocol.

Ook beschreven in dit protocol is de ligatie van azide-gemodificeerde adenovirale deeltjes via CuAAC in zuurstofarme atmosfeer met behulp van bathophenanthroline disulfonzuur dinatriumzout (BDA) als chelaatvormer (Figuur 2b). Deze methode is geschikt dat de BDA katalysator zowel in de handel verkrijgbaar en goedkoop. Bovendien gemeld opbrengst algemeen hoogste van de beschikbare methoden en complicaties van de generatie van reactieve zuurstofspecies (zie zuurstof CuAAC hieronder) in oplossing voorkomen. 8 De koper (I) katalysator bekend is cytotoxisch, 11 en de gespecialiseerde apparatuur die nodig is om deze procedure uit te voeren kan afhouden sommige groepen kunnen gebruiken. Echter we deze methode doeltreffend en nuttigadenovirus modificatie.

Een derde bruikbare methode van CuAAC is onlangs ontwikkeld om te werken onder zuurstofrijk atmosferische omstandigheden (figuur 2c). 8 Deze methode geniet van dezelfde voordelen als de BDA-gechelateerde benadering, maar gebruikt in plaats THPTA als een chelatiemiddel naar zuurstof in de lucht te vangen zonder oxidatieve vernietiging van het substraat. Een klein nadeel van deze aanpak is het huidige gebrek aan commerciële beschikbaarheid van THPTA, hoewel eenvoudig syntheses van deze chelaatvormer zijn gemeld. 8 Hoewel we nog niet uitgevoerd deze ligatie methode op ons eigen systeem, THPTA / CuAAC zou worden verwacht te produceren die vergelijkbaar resultaten aan BDA / CuAAC, met het gemak van zuurstof atmosfeer tolerantie.

Ondanks dat doel de ontwikkeling van dit protocol rond in de handel verkrijgbare materialen, we nog steeds willen de kostenvoordelen en de toegenomen flexibiliteit van het synthetiseren van de te erkennenaziden en alkyn probes hierin gebruikt. Azidohomoalanine kunnen worden bereid in slechts drie dagen en voor aanzienlijk minder dan commerciële bronnen. 6,12 Gerapporteerde gespannen alkyn voorbereidingen zijn moeilijker 11, maar betalen een grotere vrijheid van sonde selectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

We willen de NSF voor financiering (cbet-0846259) erkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene BCBC 391
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells ATCC CRL-1573
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Invitrogen 11965-092
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose Invitrogen 21013-024
Bovine Calf Serum Invitrogen 16170-078
Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) Invitrogen 15140-122
0.5% Trypsin-EDTA (10×) Invitrogen 15400-054
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene BD Falcon 353003
Cell culture CO2 incubator
Hemocytometer
Biosafety cabinet
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) VWR 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)
Avanti J-E centrifuge Beckman Coulter 369001
Conical tubes (50 ml, sterile) BD Falcon 352098
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman 344059
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor Beckman
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf 0030 121.589
Centrifuge 5418 Eppendorf 5418
Centri-Sep gel filtration spin columns Princeton Separations CS-901
Sterile needle, 18 gauge
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed)
Dewar flask
Liquid nitrogen
Electrophoresis cell
Fluorescent gel scanner
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1105
L-Azidohomoalanine AnaSpec 63669
Jena Biosciences CLK-AA005
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) Invitrogen C33365
Thermo Scientific 88905
Sigma-Aldrich A7480
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt MP Biomedicals 0215011201
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Methanol
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Disodium Phosphate (Na2HPO4)
Phosphate buffered saline (PBS)
1M HCl
Glycerol
Bovine Serum Albumin
L-cysteine
L-methionine
SDS (sodium dodecyl sulfate)
2-mercapt–thanol
Glycine
Bromophenol blue
Cesium Chloride (CsCl)
Copper(I) Bromide (CuBr)
Calcium Chloride (CaCl2)
Potassium Chloride (KCl)
Magnesium Chloride (MgCl2)
Sodium Chloride (NaCl)
Alkyne probe for CuAAC*
TAMRA Alkyne Invitrogen T10183
Strained alkyne probe for SPAAC*
TAMRA DIBO Alkyne Invitrogen C10410

* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
  2. Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
  3. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
  4. Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
  5. Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
  6. Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
  7. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
  8. Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
  9. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  10. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
  11. Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
  12. Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).More

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter