Summary
Particules d'adénovirus sont conçus pour contenir soit le naturel azidohomoalanine analogue d'acide aminé ou le sucre azido
Abstract
La modification de particules virales a reçu une quantité importante de l'attention pour son énorme potentiel pour influer sur la thérapie génique, applications oncolytiques et le développement de vaccins. 1,2,3 Les approches actuelles de la modification de surfaces virales, qui sont la plupart du temps basée sur la génétique, souffrent souvent de l'atténuation transduction de la production de virus, d'infectiosité et cellulaire. 4,5 En utilisant la chimie clic chimiosélective, nous avons développé une approche alternative simple qui permet d'éviter ces problèmes tout en restant à la fois très souple et accessible. 1,2
L'objectif de ce protocole est de démontrer l'efficacité de l'aide click chemistry bioorthogonal de modifier la surface de l'adénovirus de type 5 particules. Ce processus en deux étapes peut être utilisé à la fois thérapeutique 1 ou analytiquement, 2,6, car il permet pour la ligature chimiosélective de molécules de ciblage, de colorants ou d'autres molécules d'intérêt sur des protéinespré-marquée avec balises azide. Les trois principaux avantages de cette méthode sont que (1) marquage métabolique démontre peu ou pas d'impact sur l'aptitude virale, 1,7 (2) un large éventail de ligands effecteurs peuvent être utilisés, et (3), il est remarquablement rapide, fiable et facile d'accès. 1,2,7
Dans la première étape de cette procédure, les particules d'adénovirus sont soit produite portant azidohomoalanine (Aha, un substitut méthionine) ou le sucre non naturelle O-liée N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), qui contiennent tous deux l'azoture (-N 3) fonctionnelle groupe. Après purification des particules virales azoture modifiés, une sonde alcyne contenant le fragment fluorescent TAMRA est ligaturé de manière chimiosélective aux protéines pré-étiquette ou glycoprotéines. Enfin, une analyse SDS-PAGE est effectuée pour démontrer la ligature réussi de la sonde sur les protéines de la capside virale. L'incorporation Aha est montré à étiqueter tous les capside viraleprotéines (Hexon, Penton et fibre optique), tandis que les résultats d'incorporation O-GlcNAz dans l'étiquetage des fibres seulement.
Dans ce domaine en pleine évolution, de multiples méthodes pour l'azoture de-alcyne ligature ont été développés avec succès, mais seuls les deux nous avons trouvé pour être plus pratique sont mises en évidence ci - souche promu azide-alcyne cycloaddition (SPAAC) et de cuivre-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC) sous atmosphère désoxygénée.
Protocol
Se reporter au tableau 1 pour la préparation de tous les médias, les tampons et les solutions mentionnées dans le présent protocole.
1. Production de Aha-Labeled adénovirus
- Préparer onze de 100 mm boîtes de culture tissulaire de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK 293) maintenus dans des cellules HEK 293 milieu de croissance cellulaire (voir tableau 1) à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils aient atteint 80 à 90% de confluence. (Remarque:. Cultures avec plus de 90% de confluence peut être difficile d'infecter et ne peuvent pas produire des virus comme souhaité)
- Desserrer les cellules dans l'un des plats en retirant d'abord le milieu de croissance, de rinçage fois avec 5 ml de tampon TD, puis incubation des cellules pendant une minute dans 1 ml de trypsine-EDTA (1 ×).
- Ajouter 9 ml de HEK 293 milieu de croissance cellulaire, et d'utiliser un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules HEK 293 récoltés à partir de ce plat. Utilisez ce numéro pour calculer le montant de la adénovirus de type 5 (Ad5) nécessaire à l'infection en utilisant une multiplicity d'infection (MOI) de 10 UFP / cellule. Tenir compte du fait que, pour Ad5 normale, l'indice d'infectiosité (ratio de particules infectieuses au nombre total de particules) est typiquement 1:20.
- Préparer 10 ml de tampon infection.
- Retirer lentement le HEK 293 milieu de croissance cellulaire à partir des dix boîtes de culture restants, puis laver avec 5 ml de tampon TD. Ajouter 1 ml de tampon infection à chaque plat et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Au cours de cette période d'infection, balancer doucement de chaque côté boîte de culture à l'autre à 15 min d'intervalle.
- Après l'infection, ajouter 9 ml de frais HEK 293 milieu de croissance cellulaire et incuber à 37 ° C pendant 18 heures.
- Préparer 100 ml de Aha étiquetage moyennes (ou Met moyen de contrôle pour le contrôle). Assurez-vous de filtrer les solutions mères concentrées avec un filtre de 0,2 um seringue stérile avant de préparer les médias en matière d'étiquetage.
- Soigneusement (afin de ne pas laver les cellules infectées) retirer le HEK 293 milieu de croissance cellulaire après 18 heures unee laver chaque boîte de culture avec 5 ml de tampon TD.
- Retirer la solution tampon de lavage TD et ajouter 10 ml de milieu de marquage Aha à chaque boîte de culture. Pour un contrôle, le contrôle à moyen méthionine doit être utilisé à la place du milieu étiquetage Aha à cette étape.
- Incuber les cellules infectées dans l'étiquetage moyenne à 37 ° C pendant 6 heures. L'étiquetage peut être effectuée à tout moment entre 12 à 24 h post-infection, mais ne devrait pas être de plus de 6 h dans la durée. Cet intervalle a été déterminé à maximiser le chevauchement avec la traduction des protéines structurales virales tout en veillant à l'infectiosité n'est pas significativement diminué. 7
- Retirez délicatement le milieu de marquage afin de ne pas perturber les cellules. Ajouter 10 ml de frais HEK 293 milieu de croissance cellulaire à chaque plat et laisser incuber les cellules à 37 ° C pour un autre h 18. Pour minimiser la perte de cellules infectées au cours de cette étape, il n'est pas nécessaire de retirer la solution de marquage entièrement. Le HEK 293 milieu de croissance cellulaire contient un excès de Met qui outcompete toute résiduelle Aha.
- Passez à l'étape 3 pour la purification.
2. La production de l'adénovirus azido-sucre-Labeled
- Suivez la procédure intitulée Production de l'adénovirus Aha-étiquette vers le haut et y compris l'étape 1.5.
- Préparer 100 ml de milieu de marquage azido-sucre.
- Couvrir les cellules avec 10 ml de milieu frais étiquetage azido-sucre et incuber à 37 ° C pendant 44 h.
3. Purification de l'azide marqués particules adénovirales
- Retirez les médias ainsi que les cellules infectées de chaque boîte de culture et le transfert à des tubes coniques. Centrifuger à 2000 g pendant 10 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans un tampon TD (avec 8 ml de tampon TD pour 10 plats).
- Lyse des cellules infectées par le répétées (3 ou plus) cycles gel-dégel en utilisant un vase de Dewar d'azote liquide et un bain à 37 ° C. Centrifuger à 2000 g pendant 10 minà 4 ° C pour séparer les débris cellulaires du surnageant.
- Préparer un tube de centrifugeuse gradient de densité de CsCl d'abord pipetage 2,5 ml de 1,25 g / ml de solution de CsCl dans un tube transparent centrifugeuse ultra. Ensuite, utiliser une pipette avec sa pointe positionnée au fond du tube d'ajouter lentement 2,0 ml de 1,4 g / ml solution de CsCl, en prenant soin de ne pas perturber l'interface du gradient.
- Introduire à la pipette le surnageant de l'étape 3.2 au-dessus du tube à gradient de densité de CsCl, et, si nécessaire ajouter un tampon TD pour remplir le tube. Centrifuger les échantillons dans un rotor swing-out à 125.000 g pendant 1 heure à 15 ° C dans une ultracentrifugeuse.
- Après l'achèvement de l'ultracentrifugation, les particules virales doit être visible comme un épais bandeau blanc à l'interface des deux solutions de CsCl. Faire une petite perforation au fond du tube avec une aiguille stérile pour permettre la solution de s'écouler goutte à goutte.
- Recueillir la bande blanche et épaisse, qui devrait contenir les Ad5 marqués particules, takinsoins g d'exclure l'excès de solution de CsCl. Éviter de recueillir des protéines cellulaires qui bande au-dessus de la couche virus. En outre exclure capsides vides virion qui forment un léger couche légèrement au-dessus de la bande virus blanche épaisse.
- En option, effectuer une purification finale sur les Ad5 marqués particules. Ajouter la fraction recueillie à l'étape de 3,6 à un tube d'ultracentrifugation de 4 ml et remplir le tube avec 1,35 g / ml de CsCl solution. Centrifuger à 125 000 g pendant 18 heures à 15 ° C et de recueillir l'épaisse bande blanche qui se forme au milieu du tube, comme décrit dans les étapes 3.5 et 3.6. (Notez que si le titre viral est faible, une bande blanche ne peut être visible après la deuxième centrifugation, et il ne sera pas possible de récupérer le virus étiquetés).
- Pour le stockage des particules virales sur de longues périodes de temps, la dialyse de l'extrait du virus recueilli doit être effectuée contre un tampon de stockage du virus. Conserver les échantillons de virus dialysés à -80 ° C.
4. Lition de la modification des particules adénovirales avec des sondes alcynes en utilisant la souche-Promu azide-alcyne Cycloaddition (SPAAC)
- Pour une solution de 50 ul de l'azoture de modifié Ad5 dans un tampon de stockage du virus, ajoutez 0,25 ul d'une solution d'étiquetage SPAAC. (Reportez-vous à la table des réactifs pour une liste des vendeurs de disponibles dans le commerce alcynes tendues).
- Laisser la réaction de cycloaddition souche promu de procéder nuit à température ambiante. Si une sonde sensible à la lumière (par exemple TAMRA) est utilisé, couvrir le récipient de réaction avec une feuille d'aluminium.
- Purifier le virus étiquetés conformément à l'étape 6.
5. La ligature de modification particules adénovirales avec des sondes à l'aide alcynes de cuivre (I)-catalysée azide-alcyne Cycloaddition (CuAAC) dans l'atmosphère désoxygénée
- Lieu 7,2 mg de cuivre (I) du bromure de (CuBr) de poudre dans un tube Eppendorf, recouverts d'une feuille d'aluminium.
- Introduire à la pipette 1 ml de DMSO dans un second tube Eppendorf.
- Préparer50 ul de solution d'étiquetage CuAAC dans un troisième tube Eppendorf. Couvrir de papier d'aluminium si la sonde est alcyne sensible à la lumière (par exemple TAMRA-acétyléniques).
- Placez les trois tubes Eppendorf, non plafonnés, dans un sac à gants désoxygénée pendant 6 heures. Tous les échantillons devraient rester à l'intérieur du sac à gants jusqu'à la fin de la réaction CuAAC.
- Préparer une solution de stock 50 × de CuBr par addition de 1 ml de DMSO à 7,2 mg de poudre de CuBr, qui ont tous deux été désoxygénée selon l'étape 5.4.
- Initier la réaction CuAAC par pipetage 1 pl de cette solution mère CuBr à 50 pl de la solution d'étiquetage CuAAC, qui a été désoxygéné conformément à l'étape 5.4. Laisser la réaction se poursuivre pendant 12 heures à l'intérieur du sac à gants.
- Purifier le virus étiquetés conformément à l'étape 6.
6. Purification et le stockage de particules virales marquées
- Purifier les échantillons de virus marqués en utilisant Centri-Sep filtration sur gel de spin columns équilibrée avec un tampon de stockage Virus, à la suite des directives du fabricant.
- En variante, la purification peut être effectuée par dialyse contre un tampon de stockage virus.
- Les particules virales marquées doivent être conservés à -80 ° C.
7. SDS-PAGE de l'Adenovirus Étiqueté & numérisation Gel Fluorescent
- Ajouter 20 ul de tampon échantillon de Laemmli (2 ×) à 20 pi de virus purifié étiquetés et porter à ébullition pendant 10 min. Centrifuger les échantillons pendant 30 secondes pour éliminer toute précipités insolubles. Si le cuivre résiduel est présent après purification, ébullition de l'échantillon peut entraîner des traînées épaisses de protéines sur le gel SDS-PAGE, entraînant des difficultés lors de la visualisation. Dans ce cas, renoncer à ébullition de l'échantillon dans cette étape.
- Fixez la cassette de gel à la cellule d'électrophorèse et d'ajouter un tampon en cours d'exécution. Chargez le nombre requis de puits avec les échantillons de protéines virales. On utiliser pour charger ainsi pré-staimarqueurs de poids moléculaire ned. Exécutez le gel pendant 1 heure à 200 V. S'assurer que la cellule d'électrophorèse recouverts d'une feuille d'aluminium pendant toute la période pour réduire photoblanchiment de l'étiquette fluorophore.
- Pour une meilleure résolution et d'enlever tout fluorophore libre, permettre au colorant de suivi afin de fonctionner hors du gel pendant l'électrophorèse. Arrêter l'électrophorèse et transférer rapidement le gel à un scanner fluorescent et gel de numériser le gel pour l'émission de fluorescence à la longueur d'onde appropriée (574 nm pour TAMRA).
- Le nombre de molécules de colorant conjugués à chaque particule virale peut être quantifiée en mesurant la fluorescence de plusieurs concentrations Tamra standard et sont comparés avec l'échantillon de l'étape 7.3.
8. Les résultats représentatifs
Les résultats observés de SDS-PAGE et de balayage de gel fluorescent de TAMRA-conjugués Ad5 sont présentés dans la figure 3. Bien que ces analyses gel fluorescents ont été effectuées sur des échantillons modiFied par CuAAC, les résultats devraient être comparables lorsque les sondes sont ligaturés par SPAAC. Ces analyses indiquent que les résultats de gel d'étiquetage Aha dans la modification des trois protéines de capside (Ad5 Hexon, Penton, et fibre optique), tandis que l'étiquetage du sucre ne modifie que la protéine de capside fibre. En outre, une augmentation de la concentration Aha (4 mM contre 32 mM) entraîne un plus grand degré d'incorporation Aha, mais il a également été montrée pour diminuer l'infectiosité. 7 résultats antérieurs indiquent que, pour Ad5 produite en 4mm Aha, environ 5% des sites de la méthionine sont exposés TAMRA modifié, avec ce nombre croissant de 10% lorsque 32 mM Aha est utilisé. Cela correspond à environ 280 et 510, respectivement, de teinture, marqués par des sites Ad5 particules. Analyse de sucre-étiquetage 1 a indiqué que près de 22 des 36 sites de glycosylation sur Ad5 sont occupés par un sucre azido et par la suite marqué avec TAMRA.
Si dix plaques de culture tissulaire sont utilisés pour produire l'azoture modifié Ad5 telle que décrite dans ce protocole, de 200 à 300 pi de l'azoture de modifié le virus devrait être obtenu à partir de la bande blanche recueillie à l'étape 3.6, avec un titre d'environ 1,5 × 10 12 particules par ml. Une difficulté commune de cette procédure est l'absence d'une bande virale à cette étape de purification, qui peut être attribuée à titre viral faible. C'est généralement le résultat d'infecter des cellules qui sont soit sur-ou sous-confluentes, ou en lavant les cellules - qui se détachent de la plaque après l'infection - pendant le rinçage lors de l'étape 1.
Figure 1. Aperçu Protocole. Azoture de Aha-contenant ou GalNAz est d'abord incorporé dans des particules d'adénovirus. La ligature avec une sonde fluorescente alcyne est effectuée via "clic" chimie. Enfin, SDS-PAGE est utilisé pour démontrer la ligature de la sonde fluorescente.
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Figure 2. La ligature de la sonde alcyne sur azide modifiée virus par le biais (a) SPAAC, (b) en vertu de CuAAC de-oxygéné et (c) atmosphère oxygénée.
Figure 3. Scans fluorescentes de SDS-PAGE de l'azoture de marqué l'adénovirus de type 5 (Ad5) après conjugaison CuAAC avec TAMRA-acétyléniques. (A) Aha-étiquetés Ad5, en utilisant deux concentrations de Aha. Étiquetage semble se produire sur Hexon adénovirus, Penton et fibre protéines de la capside, à l'étendue de l'étiquetage augmente avec la concentration accrue Aha. (B) Ac 4 adénovirus GalNAz marqué semble être étiquetés uniquement sur la protéine de capside fibre.
| Solution | Préparation | Remarques |
| Ad5 tampon de stockage | 5 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contenant 0,5 mM MgCl 2, 50 mM de NaCl, 25% (v / v) de glycérol, et de 0,05% (p / v) de sérum albumine bovine (BSA) | Conserver à -20 ° C |
| Ad5 tampon infection | 2% (v / v) de sérum de veau bovin, une solution de × CT, Ad5 dans un tampon de stockage (volume déterminé en utilisant une MOI de 10 PFU / cellule et un indice infectivité de 01:20). Porter la solution à un volume final à l'aide du tampon TD | Ad5 concentration peut être déterminée par absorption UV. |
| TC solution (200 ×) | 136 mM CaCl 2, 100 mM de MgCl 2 | Conserver à 4 ° C |
| TD tampon | 137 mM NaCl, 5 mM de KCl, 0,07 mM de Na 2 HPO 4, et 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5 | Conserver à 4 ° C |
| HEK 293 milieu de croissance cellulaire | Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau bovin (BCS) et 1% (v / v) Pen Strep | Conserver à 4 ° C |
| Solution stock Cys (100 ×) | DMEM (-Met / Cys-) supplémenté avec 200 mM de L-cystéine | Préparer une solution fraîche et le filtre avec un filtre de 0,2 um seringue stérile avant utilisation. |
| Aha solution mère (25 ×) | DMEM (-Met / Cys-), supplémenté avec 100 mM de L-Azidohomoalanine | Préparer une solution fraîche et le filtre avec un filtre de 0,2 um seringue stérile avant utilisation. |
| Aha étiquetage moyennes | DMEM (-Met / Cys-) supplémenté avec 10% BCS, Aha solution mère (1 ×), 2 mM de L-cystéine | Préparer une solution fraîche avant de l'utiliser. Cela correspond à un c 4 mMoncentration de Aha, bien que les concentrations différentes peuvent être utilisées (voir les résultats représentatifs). |
| Met la solution mère (25 ×) | DMEM (-Met / Cys-), supplémenté avec 100 mM de L-méthionine | Préparer une solution fraîche et le filtre avec un filtre de 0,2 um seringue stérile avant utilisation. |
| Milieu de contrôle Met | DMEM (-Met / Cys-) supplémenté avec 10% BCS, Met solution stock (1 ×), 2 mM de L-cystéine | Préparer une solution fraîche avant de l'utiliser. |
| Ac solution mère 4 GalNAz (1.000 ×) | 50 mM peracétylé N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) dans le méthanol | Conserver à 4 ° C. Ac 4 GalNAz est un précurseur métabolique à GlcNAz. |
| Milieu de marquage azido-sucre | 100 pi Ac solution mère 4 GalNAz, 100 ml HEK 293 milieu de croissance cellulaire | Laisser le méthanol s'évaporer avant d'ajouter HEK 293 milieu de croissance cellulaire. |
| Des solutions de chlorure de césium | CsCl dissous dans un tampon TD: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml de H 2 O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml de H 2 O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml de H 2 O) | Gradients de densité pour ultracentrifugation |
| Un tampon de stockage virus | Saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2, contenant 0,5 mM de CaCl 2, 0,9 mM MgCl 2, et 10% (v / v) de glycérol | Conserver à -20 ° C |
| TAMRA-BCN solution d'étiquetage (SPAAC) | TAMRA-BCN dans le DMSO:
| Strain-promu sonde alcyne Pour SDS-PAGE, un titre viral d'environ 10 12 particules / ml est suggéré |
| TAMRA-acétyléniques solution d'étiquetage (CuAAC) | 50 ul d'azoture de modifié Ad5 dans un tampon de stockage du virus (N Ad5 déterminée comme ci-dessus), 1,5 mM Batho phénanthroline disulfonate (soit 1,5 × concentration CuBr final), TAMRA-acétyléniques. TAMRA-acétyléniques molarité (en M) est déterminée à l'aide: c = Alk 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (De telle sorte que le mélange réactionnel préparé dans l'étape 5 contenant 100 sondes alcyne par virion) | Tampon Tris est connu pour être un ligand compétitif et inhibitrices de cuivre. 8 |
| Tampon d'échantillon Laemmli (2 ×) | 125 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 4% (p / v) de SDS, 20% (v / v) de glycérol, 10% (v / v) de 2-mercaptoéthanol, et 0,004% (p / v) de bleu de bromophénol | |
| Exécution de tampon | 187 mM de glycine, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS dans H 2 O | Conserver à 4 ° C |
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Discussion
Le développement de la réactions cliquez sur chimiosélectives et de bioorthogonal, y compris ceux de la des azides, des est un zone de rapidement-en évolution de la recherche, et par la suite il n'y a un certain nombre croissante de ces réactions de choisir à partir pour les applications bioconjugaison. Nous avons limité la portée de ce protocole d'inclure seulement deux méthodes qui ont été choisis en raison de leur utilité dans notre propre laboratoire et de la disponibilité commerciale de tous les réactifs.
Dans le premier itinéraire tels - souche-promu 'azide de-alcyne cycloaddition (SPAAC) - l'alcyne est contenue à l'intérieur un anneau cyclooctyne (Figure 2a). Cette méthode a récemment-mis au point peut être menée en vertu atmosphère oxygénée et sans la nécessité pour les un catalyseur au cuivre. 9,10 Jusqu'à ce que récemment, l'un inconvénient de cette méthode était la synthèse laborieuse et réduite disponibilité commerciale de ces alcynes tendues par rapport avec le terminal alcynes utilisé dans de cuivre (I), catalysée azoture-alcyne cycloaddition (CuAAC), mais, une bibliothèque de plus en plus de ces sondes est maintenant disponible dans le commerce (voir le tableau des réactifs). Pour ces raisons, nous avons choisi SPAAC que la méthode de choix dans ce protocole.
Sont aussi décrits dans ce protocole est la ligature de l'azide modifiés particules adénovirales via CuAAC dans l'atmosphère à l'aide désoxygénée bathophénanthroline disulfonique sel disodique (BDA) comme un agent chélateur (Figure 2b). Cette méthode est pratique en ce que le catalyseur BDA est à la fois disponibles dans le commerce et peu coûteux. En outre, fait état de rendements sont généralement plus élevés des méthodes disponibles, et les complications découlant de la génération d'espèces réactives de l'oxygène (cf. oxygénée CuAAC, ci-dessous) en solution sont évités. 8 Toutefois, le cuivre (I) catalyseur est connu pour être cytotoxique, 11 et l'équipement spécialisé nécessaire pour mettre en œuvre cette procédure peut dissuader certains groupes de l'utiliser. Néanmoins, nous trouvons cette méthode efficace et utile pourla modification adénovirus.
Une troisième méthode utile de CuAAC a été récemment développé pour fonctionner sous des conditions atmosphériques oxygénés (figure 2c). 8 Cette méthode bénéficie des mêmes avantages que l'approche BDA-chélaté, mais utilise à la place THPTA comme un agent de chélation pour accueillir l'oxygène atmosphérique sans destruction oxydative des le substrat. Un petit inconvénient de cette approche est le manque actuel de la disponibilité commerciale de THPTA, bien que des synthèses simples de cet agent chélateur ont été signalés. 8 Bien que nous n'avons pas effectué cette méthode de ligature sur notre propre système, THPTA / CuAAC on peut s'attendre à produire des comparables résultats à BDA / CuAAC, avec la commodité de la tolérance atmosphère oxygénée.
Malgré intentionnellement élaboration de ce protocole autour des matériaux disponibles dans le commerce, nous souhaitons encore de reconnaître les avantages de coûts et une flexibilité accrue de la synthèse de laazotures et des sondes alcyne utilisé ici. Azidohomoalanine peuvent être préparés en aussi peu que trois jours et pour beaucoup moins que de sources commerciales. 6,12 Rapporté préparations alcynes tendues sont plus difficiles 11, mais permettre une plus grande liberté de sélection des sondes.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier la NSF pour le financement (CBET-0846259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
|||
References
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
