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Immunology and Infection

Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

doi: 10.3791/4246 Published: August 19, 2012

Summary

Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l'innaturale azidohomoalanine analogo dell'acido amino o lo zucchero azido

Abstract

La modifica di particelle virali ha ricevuto una quantità significativa di attenzione per il suo potenziale impatto enorme per terapia genica, le applicazioni oncolitici e sviluppo di vaccini. 1,2,3 attuali approcci per modificare le superfici virali, che sono prevalentemente a base genetica, spesso soffrono di attenuazione della produzione di virus, l'infettività e cellulari di trasduzione. 4,5 utilizzando la chimica chemoselective click, abbiamo sviluppato un approccio diretto alternativo che evita questi problemi, pur rimanendo allo stesso tempo estremamente flessibile e accessibile. 1,2

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l'efficacia di utilizzare la chimica bioorthogonal click per modificare la superficie di particelle di adenovirus di tipo 5. Questo processo a due fasi può essere utilizzato sia terapeuticamente 1 o analiticamente, 2,6 quanto consente di ligazione chemoselective di molecole targeting, coloranti o altre molecole di interesse su proteinepre-etichettati con tag azide. I tre principali vantaggi di questo metodo sono che (1) etichettatura metabolica dimostra poco o nessun impatto sulla fitness virale, 1,7 (2) una vasta gamma di leganti effettrici può essere utilizzato, e (3) è notevolmente veloce, affidabile e di facile accesso. 1,2,7

Nella prima fase di questo procedimento, le particelle di adenovirus sono prodotti tenendo sia azidohomoalanine (Ah, un surrogato metionina) o zucchero innaturale O-legato N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), entrambi i quali contengono l'azide (N-3) funzionali gruppo. Dopo purificazione dei azide modificati particelle virali, una sonda alchino contenente la parte fluorescente TAMRA è ligato in modo chemoselective alle proteine ​​pre-marcate o glicoproteine. Infine, un SDS-PAGE analisi viene eseguita per dimostrare la legatura successo della sonda sulle proteine ​​del capside virale. Incorporazione Aha è mostrato per etichettare tutti i capside viraleproteine ​​(esone, Penton e fibra), mentre O-GlcNAz risultati incorporazione di etichettatura di Fiber solo.

In questo campo in continua evoluzione, diversi metodi per azide-alchino legatura sono stati sviluppati con successo, ma solo i due che abbiamo trovato per essere più conveniente sono qui dimostrato - strain-promosso azide-alchino cicloaddizione (SPAAC) e rame-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC) in atmosfera deossigenata.

Protocol

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Fare riferimento alla Tabella 1 per la preparazione di tutti i media, tamponi e soluzioni di riferimento in questo protocollo.

1. Produzione di Aha-etichetta Adenovirus

  1. Preparare undici da 100 mm piatti di coltura di tessuto di cellule umane embrionali di rene (HEK 293) mantenuti in HEK 293 mezzo di crescita delle cellule (vedi Tabella 1) a 37 ° C fino a quando non hanno raggiunto l'80 - 90% confluenza. (Nota:. Culture confluenza con oltre il 90% possono essere difficili da infettare e non può produrre virus come desiderato)
  2. Allentare le cellule in uno dei piatti rimuovendo prima il mezzo di crescita, risciacquo una volta con 5 ml di tampone TD, quindi incubando le cellule per un minuto in 1 ml di tripsina-EDTA (1 ×).
  3. Aggiungere 9 ml di HEK 293 mezzo di crescita cellulare, e utilizza un emocitometro per contare il numero di espianti di cellule HEK 293 da questo piatto. Utilizzare questo numero per calcolare la quantità di adenovirus di tipo 5 (Ad5) richiesto per infezione con un multiplicity di infezione (MOI) valore di 10 PFU / cell. Conto del fatto che per la normale Ad5, l'indice di infettività (rapporto di particelle infettive al numero totale di particelle) è tipicamente 1:20.
  4. Preparare 10 ml di tampone infezione.
  5. Rimuovere lentamente il HEK 293 mezzo di crescita delle cellule provenienti dai dieci capsule di Petri rimanenti, quindi lavare con 5 ml di tampone TD. Aggiungere 1 ml di tampone di infezione per ogni piatto e incubare a 37 ° C per 1 ora. Durante questo periodo di infezione, far oscillare delicatamente ogni lato piatto di coltura a lato a intervalli di 15 min.
  6. Dopo l'infezione, aggiungere 9 ml di terreno fresco HEK 293 crescita cellulare e incubare a 37 ° C per 18 ore.
  7. Preparare 100 ml di terreno Aha etichettatura (Met o mezzo di controllo per il controllo). Assicurati di filtrare le soluzioni stock concentrate con un 0,2 micron filtro per siringa sterile prima di preparare i mezzi di comunicazione di etichettatura.
  8. Cautela (per non lavare via le cellule infette) rimuovere il HEK 293 mezzo di crescita delle cellule dopo 18 ore unond lavare ogni piatto cultura con 5 ml di tampone TD.
  9. Rimuovere il TD soluzione tampone di lavaggio e aggiungere 10 ml di mezzo di etichettatura Aha ad ogni piatto cultura. Per un controllo, metionina mezzo di controllo deve essere usato al posto del mezzo di etichettatura Aha in questa fase.
  10. Incubare le cellule infettate in etichettatura mezzo a 37 ° C per 6 h. L'etichettatura possono essere effettuate in qualsiasi momento tra 12-24 ore post-infezione, ma non dovrebbe essere più lungo di 6 ore di durata. Questo intervallo è stato determinato per massimizzare la sovrapposizione con la traduzione delle proteine ​​virali strutturali, mentre l'infettività garantendo non è significativamente diminuita. 7
  11. Rimuovere con cura il mezzo di etichettatura in modo da non interferire con le cellule. Aggiungere 10 ml di terreno fresco HEK 293 crescita cellulare per ogni piatto e incubare le cellule a 37 ° C per un'altra ora 18. Per minimizzare la perdita di cellule infette durante questa fase, non è necessario rimuovere completamente la soluzione di etichettatura. Il HEK 293 mezzo di crescita cellulare contiene un eccesso di Met che competere con qualsiasi residuo di Aha.
  12. Passare al punto 3 per la purificazione.

2. Produzione di Adenovirus azido-Sugar-etichetta

  1. Seguire la procedura dal titolo Produzione di Adenovirus Aha marcato fino al punto 1.5.
  2. Preparare 100 ml di zucchero azido-media etichettatura.
  3. Coprire le cellule con 10 ml di fresco azido-zucchero mezzo etichettatura e incubare a 37 ° C per 44 h.

3. Purificazione di Azide marcati con particelle adenovirali

  1. Rimuovere i supporti con le cellule infette da ogni piatto la cultura e il trasferimento ai tubi conici. Centrifugare a 2000 g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in tampone TD (con 8 ml di tampone TD per 10 piatti).
  2. Lisare le cellule infettate dai ripetuti (3 o più) cicli gelo-disgelo con un Dewar di azoto liquido e di un bagno di acqua a 37 ° C. Centrifugare a 2000 g per 10 mina 4 ° C per separare i detriti cellulari dal supernatante.
  3. Preparare un gradiente di CsCl tubo di densità centrifuga prima pipettando 2,5 ml di 1,25 g / ml soluzione di CsCl in un tubo di centrifuga Ultra Clear. Successivamente, utilizzare una pipetta con la sua punta posizionato sul fondo del tubo di aggiungere lentamente 2,0 ml di 1,4 g / ml soluzione di CsCl, facendo attenzione a non disturbare l'interfaccia di gradiente.
  4. Pipettare il surnatante da 3,2 gradino sulla parte superiore del tubo gradiente di densità CsCl, e se necessario aggiungere tampone TD per riempire il tubo. Centrifugare i campioni in un rotore oscillante a 125.000 g per 1 ora a 15 ° C in un'ultracentrifuga.
  5. Dopo il completamento di ultracentrifugazione, le particelle del virus dovrebbe essere visibile come una banda bianca spessa in corrispondenza dell'interfaccia dei due soluzioni CsCl. Effettuare una piccola perforazione sul fondo del tubo con un ago sterile per consentire alla soluzione di scendere goccia a goccia.
  6. Raccogliere la banda bianca e spessa, che dovrebbe contenere i etichettati Ad5 particelle, taking cura di escludere eccesso di soluzione CsCl. Evitare di raccogliere le proteine ​​cellulari che banda sopra lo strato di virus. Inoltre escludere capsidi virioni vuoti che formano uno strato leggero leggermente sopra la banda di spessore virus bianco.
  7. Facoltativamente, eseguire una purificazione finale sulle particelle etichettati Ad5. Aggiungere la frazione raccolta dal passaggio a 3,6 a 4 ml tubo ultracentrifuga e riempire il tubo con 1,35 g / ml soluzione di CsCl. Centrifugare a 125.000 g per 18 ore a 15 ° C e raccogliere la banda spessa bianco che forma al centro del tubo come descritto ai punti 3.5 e 3.6. (Si noti che se il titolo virale è bassa, una banda bianca può non essere visibile dopo la seconda centrifugazione, e non sarà possibile recuperare il virus etichetta).
  8. Per la conservazione delle particelle virali per lunghi periodi di tempo, dialisi dell'estratto virus raccolto deve essere eseguita contro tampone di stoccaggio virus. Conservare i campioni di virus dializzati a -80 ° C.

4. Lipropagazione di particelle adenovirali modificati con sonde alchino Utilizzo Strain-Promosso Azide-acetilenici cicloaddizione (SPAAC)

  1. Ad una soluzione di 50 pl di azide-modified Ad5 in tampone virus stoccaggio, aggiungere 0,25 pl di soluzione di etichettatura SPAAC. (Fare riferimento alla tabella di reagenti per una lista di venditori di alchini tesi disponibili in commercio).
  2. Lasciare il ceppo-promosso reazione di cicloaddizione procedere notte a temperatura ambiente. Se un sensibile alla luce sonda (ad esempio TAMRA) viene utilizzato, coprire il recipiente di reazione con un foglio di alluminio.
  3. Purificare il virus etichettati conformemente al punto 6.

5. Legatura delle particelle adenovirali modificati con sonde alchino in rame (I)-catalizzata Azide-acetilenici cicloaddizione (CuAAC) in Atmosfera deossigenato

  1. Luogo 7,2 mg di rame (I) bromuro (CuBr) in polvere in un tubo Eppendorf, coperto da un foglio di alluminio.
  2. Pipettare 1 ml di DMSO in un secondo tubo Eppendorf.
  3. Preparare50 pl di soluzione di etichettatura CuAAC in un terzo tubo Eppendorf. Coprire con un foglio di alluminio se la sonda alchino è sensibile alla luce (ad esempio TAMRA-alchini).
  4. Mettere i tre tubi Eppendorf, senza cappuccio, in un sacchetto guanto deossigenato per 6 ore. Tutti i campioni devono rimanere all'interno della borsa guanto fino al completamento della reazione CuAAC.
  5. Preparare una soluzione stock 50 × di CuBr aggiungendo 1 ml di DMSO a 7,2 mg di polvere di CuBr, entrambi dei quali sono stati deossigenata secondo la fase 5,4.
  6. Iniziare la reazione CuAAC pipettando 1 ml di questa soluzione stock CuBr a 50 pl della soluzione di etichettatura CuAAC, che è stata deossigenata secondo la fase 5,4. Lasciare la reazione per 12 hr all'interno del sacchetto guanto.
  7. Purificare il virus etichettati conformemente al punto 6.

6. Purificazione e lo stoccaggio delle particelle virali con etichetta

  1. Purificare i campioni di virus etichettati con Centri-Sep gel filtrazione di spin columns equilibrata con tampone Virus Storage, secondo le linee guida del produttore.
  2. In alternativa, la purificazione può essere effettuata da dialisi contro tampone Virus stoccaggio.
  3. Le particelle virali etichetta deve essere conservato a -80 ° C.

7. SDS-PAGE di Adenovirus etichetta Scanning & Gel fluorescente

  1. Aggiungere 20 l tampone campione Laemmli (2 ×) a 20 microlitri di virus purificato etichettati e far bollire per 10 min. Centrifugare i campioni per 30 secondi per eliminare eventuali precipitati insolubili. Se il rame è presente residuo dopo purificazione, ebollizione il campione può risultare in strisce spessore di proteine ​​sul gel SDS-PAGE, causando difficoltà durante la visualizzazione. In questo caso, rinunciare ebollizione del campione in questa fase.
  2. Fissare la cassetta gel elettroforesi alla cella e aggiungere tampone di corsa. Caricare il numero richiesto di pozzetti con i campioni di proteine ​​virali. Utilizzare un pozzetto per caricare pre-STAImarcatori di peso molecolare niti. Eseguire il gel per 1 ora a 200 V. Mantenere la cella elettroforesi coperto con un foglio di alluminio durante l'intero periodo di ridurre fotodegradazione dell'etichetta fluoroforo.
  3. Per una migliore risoluzione e di rimuovere tutti fluoroforo libero, permettono il colorante tracking per esaurimento del gel durante l'elettroforesi. Fermare il elettroforesi e trasferire rapidamente il gel ad un gel fluorescente e scanner eseguire la scansione del gel per l'emissione di fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata (574 nm per TAMRA).
  4. Il numero di molecole di colorante coniugati a ciascuna particella virale può essere quantificato misurando la fluorescenza di diverse concentrazioni Tamra standard e confronto con il campione dal passaggio 7,3.

8. Risultati rappresentativi

I risultati osservati di SDS-PAGE e la scansione di gel fluorescente TAMRA-coniugati Ad5 sono mostrati nella Figura 3. Sebbene queste scansioni gel fluorescenti sono state eseguite su campioni modicato via CuAAC, i risultati dovrebbero essere comparabili, quando le sonde vengono legati via SPAAC. Queste scansioni gel indicano che i risultati in materia di etichettatura Aha nella modificazione dei tre Ad5 proteine ​​del capside (esone, Penton, e fibra), mentre l'etichettatura di zucchero modifica solo la proteina del capside Fiber. Inoltre, un aumento della concentrazione di Aha (4 mm vs 32 mm) si traduce in un maggior grado di incorporazione Aha, ma ha anche dimostrato di ridurre l'infettività. 7 risultati precedenti indicano che, per Ad5 prodotta in 4mM Aha, circa il 5% dei siti esposti metionina TAMRA sono modificati, con questo numero crescente al 10% quando 32 mm Aha viene utilizzato. Ciò corrisponde a circa 280 e 510, rispettivamente, coloranti marcati siti per Ad5 particelle. Analisi di zucchero-etichettatura 1 ha indicato che circa 22 dei 36 siti di glicosilazione su Ad5 sono occupati da uno zucchero azido e successivamente etichettati con TAMRA.

Se dieci piastre di coltura tissutale sono utilizzati per produrre azide-modificato come descritto Ad5 in questo protocollo, 200-300 pl di azide virus-modified dovrebbe essere ottenuta dalla banda bianca raccolto nella fase 3,6, con un titolo di circa 1,5 × 10 12 particelle / ml. Una difficoltà comune di questa procedura è l'assenza di una banda virale in questa fase di purificazione, che può essere attribuita a basso titolo virale. Questo è generalmente il risultato di infettare le cellule che sono o sovra-o sotto-confluenti, o lavando via le cellule - che diventano allentato dalla piastra dopo l'infezione - durante il risciacquo durante la fase 1.

Figura 1
Figura 1. Protocollo panoramica. Azide contenente Aha o GalNAz viene dapprima inserito in particelle di adenovirus. Legatura con una sonda fluorescente alchino viene quindi eseguita mediante chimica "click". Infine, SDS-PAGE è usato per dimostrare legatura della sonda fluorescente.

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Figura 2. Legatura di sonda alchino su azide-virus modificato tramite (a) SPAAC, (b) CuAAC sotto de-ossigenazione e (c) atmosfera ossigenata.

Figura 3
Figura 3. Scansioni fluorescenti di SDS-PAGE di azide-marcato adenovirus di tipo 5 (Ad5) dopo coniugazione con CuAAC TAMRA-acetilenici. (A) Aha-marcato Ad5, usando due concentrazioni di Aha. Etichettatura sembra verificarsi il esone adenovirus, Penton e fibra proteine ​​del capside, con l'estensione dell'etichettatura crescente con maggiore concentrazione di Aha. (B) Ac 4 adenovirus GalNAz-marcato sembra essere etichettati solo la proteina del capside fibra.

Soluzione Preparazione Note
Ad5 di accumulo 5 mM Tris-HCl (pH 8,0) contenente 0,5 mM MgCl 2, 50 mM NaCl, 25% (v / v) glicerolo, e 0,05% (w / v) albumina di siero bovino (BSA) Conservare a -20 ° C
Ad5 infezione tampone 2% (v / v) di siero di vitello bovino, 1 × soluzione TC, Ad5 in tampone di conservazione (volume determinato utilizzando un MOI di 10 PFU / cella e un indice di infettività 1:20). Portare la soluzione al volume finale utilizzando TD tampone Ad5 concentrazione può essere determinata attraverso l'assorbimento UV.
TC soluzione (200 ×) 136 mM CaCl 2, 100 mM MgCl 2 Conservare a 4 ° C
TD tampone 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na 2 HPO 4, e 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 Conservare a 4 ° C
HEK 293 cellule mezzo di crescita Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplementato con 10% (v / v) siero di vitello bovino (BCS) e 1% (v / v) Pen Strep Conservare a 4 ° C
Soluzione madre di Cys (100 ×) DMEM (Met-/-Cys) supplementato con 200 mM L-cisteina Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell'uso.
Aha soluzione stock (25 ×) DMEM (-Met /-Cys) integrato con 100 mM L-Azidohomoalanine Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell'uso.
Aha etichettatura media DMEM (Met-/-Cys) supplementato con il 10% BCS, Aha soluzione madre (1 ×), 2 mM L-cisteina Preparare fresco prima dell'uso.
Ciò corrisponde a un mM 4 concentration di Aha, ma le concentrazioni possono essere utilizzati diversi (vedi risultati rappresentativi).
Met soluzione stock (25 ×) DMEM (Met-/-Cys) supplementato con 100 mM L-metionina Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell'uso.
Met controllo del mezzo DMEM (Met-/-Cys) supplementato con il 10% BCS, Met soluzione madre (1 ×), 2 mM L-cisteina Preparare fresco prima dell'uso.
Ac 4 GalNAz soluzione stock (1.000 ×) 50 mM peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) in metanolo Conservare a 4 ° C. Ac 4 GalNAz è un precursore metabolico GlcNAz.
Azido di zucchero etichettatura media 100 pl Ac 4 GalNAz soluzione madre, 100 ml HEK 293 la crescita delle cellule medie Lasciare metanolo evaporare prima di aggiungere HEK 293 mezzo di crescita cellulare.
Soluzioni di cloruro di cesio CsCl sciolto in tampone TD:
1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H 2 O)
1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H 2 O)
1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H 2 O)
Gradienti di densità per ultracentrifugazione
Virus di accumulo Soluzione salina tamponata (PBS), pH 7,2, contenente 0,5 mM CaCl 2, 0,9 mM MgCl 2, e 10% (v / v) glicerolo Conservare a -20 ° C
TAMRA-BCN (SPAAC) soluzione di etichettatura TAMRA-BCN in DMSO:
  1. Utilizzare UV absorbance (OD 260 Assay) per determinare il titolo della soluzione di virus nella fase 4,1
  2. Determinare il numero totale di particelle virali in aliquota 50 microlitri (N Ad5)
  3. Il TAMRA-BCN molarità (in M) è determinato utilizzando:
    c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo)
    Avo N = 6,022 × 10 23
    (In modo che la miscela di reazione preparata al punto 4 contiene 100 sonde alchino per virione)
Strain-promosso sonda alkyne
Per SDS-PAGE, un titolo virale di circa 10 12 particelle / ml viene suggerito
TAMRA-alchini (CuAAC) soluzione di etichettatura 50 pl di azide-modified Ad5 in tampone di virus di memorizzazione (N Ad5 determinato come sopra), 1,5 mM Batho fenantrolina disolfonato (cioè 1,5 × concentrazione CuBr finale), TAMRA-acetilenici.
TAMRA-alchini molarità (in M) è determinato utilizzando:
c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo)
(In modo che la miscela di reazione preparata al punto 5 contiene 100 sonde alchino per virione)
Tampone Tris è noto per essere un ligando competitiva e inibitoria di rame. 8
Laemmli tampone campione (2 ×) 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) glicerolo, 10% (v / v) 2-mercaptoetanolo, e 0,004% (w / v) blu di bromofenolo
Il tampone di corsa 187 mM glicina, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS in H 2 O Conservare a 4 ° C
t "> Tabella 1. Preparazione dei tamponi e le soluzioni richieste dal presente protocollo.

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Discussion

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Lo sviluppo di reazioni click chemoselective e bioorthogonal, compresi quelli di azidi, è un settore in rapida evoluzione della ricerca, e successivamente vi è un numero crescente di queste reazioni da scegliere per le applicazioni bioconiugazione. Abbiamo ristretto il campo di applicazione di questo protocollo per includere solo due metodi che sono stati scelti per la loro utilità nel nostro laboratorio proprio e la disponibilità commerciale di tutti i reagenti.

Nel primo percorso tale - strain-promosso azide-alchino cicloaddizione (SPAAC) - il alchino è contenuta all'interno di un anello cyclooctyne (Figura 2a). Questo metodo di recente sviluppo può essere condotta in atmosfera ossigenata e senza la necessità di un catalizzatore di rame. 9,10 Fino a poco tempo, uno svantaggio di questo metodo è la sintesi laboriosa e ridotta disponibilità commerciale di queste alchini tese rispetto al terminale utilizzato in alchini rame (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC), tuttavia, una biblioteca crescente di queste sonde è ora disponibile in commercio (vedi tabella dei reagenti). Per queste ragioni, abbiamo scelto SPAAC come metodo di scelta in questo protocollo.

Anche descritto in questo protocollo è la legatura di azide particelle adenovirali modificati tramite CuAAC in atmosfera deossigenato utilizzando bathophenanthroline disolfonico sale disodico (BDA) come agente chelante (Figura 2b). Questo metodo è conveniente che il catalizzatore sia BDA è commercialmente disponibile e poco costoso. Inoltre, riportate le rese sono in generale più dei metodi disponibili, e complicazioni derivanti dalla generazione di specie reattive dell'ossigeno (cf. ossigenato CuAAC, di seguito) in soluzione sono evitati. 8 Tuttavia, il rame (I) catalizzatore è noto per essere citotossico, 11 e le attrezzature specializzate necessarie per attuare questa procedura può dissuadere alcuni gruppi di utilizzarlo. Tuttavia, questo metodo si trova utile ed efficiente peradenovirus modifica.

Un terzo metodo utile CuAAC è stato recentemente sviluppato per lavorare in condizioni atmosferiche ossigenati (Figura 2c). 8 Questo metodo gode degli stessi vantaggi della BDA-chelato approccio, ma usa invece THPTA come agente chelante per ospitare l'ossigeno atmosferico senza distruzione ossidativa il substrato. Un piccolo inconveniente di questo approccio è l'attuale mancanza di disponibilità commerciale di THPTA, anche se semplici sintesi di questo chelante sono stati segnalati. 8 Anche se non abbiamo eseguito questo metodo di legatura sul nostro sistema, THPTA / CuAAC ci si aspetta di produrre comparabili risultati a BDA / CuAAC, con la comodità di tolleranza atmosfera ossigenata.

Nonostante intenzionalmente lo sviluppo di questo protocollo intorno ai materiali disponibili in commercio, si vuole ancora riconoscere i vantaggi di costo e maggiore flessibilità di sintetizzare ilazidi e sonde alchino utilizzati nel presente documento. Azidohomoalanine può essere preparata in soli tre giorni, per molto meno fonti commerciali. 6,12 Segnalato preparazioni alchino tese sono più difficili 11, ma permettersi una maggiore libertà di scelta della sonda.

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Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere la NSF per il finanziamento (cbet-0846259).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene BCBC 391
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells ATCC CRL-1573
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Invitrogen 11965-092
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose Invitrogen 21013-024
Bovine Calf Serum Invitrogen 16170-078
Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) Invitrogen 15140-122
0.5% Trypsin-EDTA (10×) Invitrogen 15400-054
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene BD Falcon 353003
Cell culture CO2 incubator
Hemocytometer
Biosafety cabinet
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) VWR 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)
Avanti J-E centrifuge Beckman Coulter 369001
Conical tubes (50 ml, sterile) BD Falcon 352098
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman 344059
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor Beckman
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf 0030 121.589
Centrifuge 5418 Eppendorf 5418
Centri-Sep gel filtration spin columns Princeton Separations CS-901
Sterile needle, 18 gauge
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed)
Dewar flask
Liquid nitrogen
Electrophoresis cell
Fluorescent gel scanner
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1105
L-Azidohomoalanine AnaSpec 63669
Jena Biosciences CLK-AA005
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) Invitrogen C33365
Thermo Scientific 88905
Sigma-Aldrich A7480
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt MP Biomedicals 0215011201
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Methanol
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Disodium Phosphate (Na2HPO4)
Phosphate buffered saline (PBS)
1M HCl
Glycerol
Bovine Serum Albumin
L-cysteine
L-methionine
SDS (sodium dodecyl sulfate)
2-mercapt–thanol
Glycine
Bromophenol blue
Cesium Chloride (CsCl)
Copper(I) Bromide (CuBr)
Calcium Chloride (CaCl2)
Potassium Chloride (KCl)
Magnesium Chloride (MgCl2)
Sodium Chloride (NaCl)
Alkyne probe for CuAAC*
TAMRA Alkyne Invitrogen T10183
Strained alkyne probe for SPAAC*
TAMRA DIBO Alkyne Invitrogen C10410

* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs.

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References

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Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal
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Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).More

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).

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