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Immunology and Infection

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

doi: 10.3791/4246 Published: August 19, 2012

Summary

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록 설계되었습니다

Abstract

바이러스 입자의 수정은 유전자 치료, oncolytic 응용 프로그램 및 백신 개발에 영향을 미치는위한 엄청난 잠재력에 대한 관심의 상당 금액을 받았습니다. 대부분은 유전학 기반입니다 바이러스 표면, 수정에 1,2,3 전류 접근법은 종종 감쇠에 걸리다 바이러스 생산, 감염 및 세포 형질 도입. 4,5 chemoselective 클릭 화학을 사용하여, 우리는 매우 유연하고 접근을 모두 유지하면서 이러한 문제를 sidesteps 간단한 대안적인 접근 방식을 개발했습니다. 1,2

이 프로토콜의 목표는 아데노 바이러스 타입 5 입자의 표면을 수정 bioorthogonal 클릭 화학을 이용의 효율성을 입증하는 것입니다. 그것이 단백질에 타겟팅 분자, 염료 또는 관심있는 다른 분자의 chemoselective 결합을 허용으로이 두 단계 프로세스는 모두 therapeutically 1 또는 analytically, 2,6 사용할 수 있습니다azide 태그로 미리 분류. 이 방법의 세 가지 주요 장점은 (1) 신진 대사 라벨링은 바이러스성 적합성에 영향, 1,7에 약간을 보여주는 것이있다 (2) 효과기 리간드의 다양한 배열이 활용될 수 있으며, (3) 그것은 매우 빠르고, 신뢰할 수있다 액세스가 용이합니다. 1,2,7

이 절차의 첫 단계에서 아데노 바이러스 입자는 기능 azide (-N 3)를 포함 둘 다 azidohomoalanine (아하, 메티오닌 대리) 또는 부자연스러운 설탕 O-연결된 N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz) 중 하나를 베어링 생산됩니다 그룹. azide으로 수정한 바이러스 입자의 정화 후, 형광 TAMRA 잔기를 포함하는 alkyne 프로브 미리 표시된 단백질이나 glycoproteins에 chemoselective 방식으로 출혈도 잡았있다. 마지막으로, SDS-PAGE 분석은 바이러스 capsid 단백질에 프로브의 성공적인 결합을 설명하기 위해 수행됩니다. 아하의 설립은 모든 바이러스 capsid를 붙여 표시됩니다단백질 (Hexon, Penton 및 섬유), 전용 섬유의 라벨에있는 O-GlcNAz의 설립 결과 동안.

이런 진화 필드에 azide - alkyne 내고 여러 가지 방법이 성공적으로 개발되었습니다 있지만 우리가 가장 편리한 것으로 나타났습니다만이 두 사람은 본 시연 - 스트레인 추진 azide - alkyne의 cycloaddition (SPAAC)과 구리 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (CuAAC) deoxygenated 분위기 하에서.

Protocol

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이 프로토콜에서 참조하는 모든 미디어, 버퍼 및 솔루션의 준비를 위해 표 1을 참조하십시오.

1. AHA-라벨 아데노 바이러스의 제작

  1. 그들이 80에 도달하기 전까지 37 ° C에서 HEK 293 세포 성장 매체에 유지 인간의 배아 신장 세포 때문이죠 100-mm 조직 배양 접시 (HEK 293)를 (표 1 참조) 준비 - 90 % confluency. (참고 :. 90% 이상 confluency와 문화가 감염하고 원하는대로 바이러스를 생산하지 않을 수 어려울 수 있습니다)
  2. 첫째 후 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1 ×) 1 ML에서 한 분 동안 세포를 잠복기, TD 버퍼의 5 ML과 함께 한 rinsing, 성장 매체를 제거하여 요리 중 하나에서 셀을 풀어.
  3. HEK 293 세포 성장 매체 9 ML을 추가하고이 요리에서 수확 HEK 293 세포의 수를 세어 hemocytometer를 사용합니다. multiplicit를 사용하여 감염에 필요한 아데노 바이러스 타입 5 (Ad5)의 양을 계산하기 위해이 번호를 사용하여10 PFU / 세포의 감염의 Y (방어) 값. 정상 Ad5 들어, 감염 지수 (입자의 총수에 대한 전염성 입자의 비율) 일반적으로 1시 20분는 사실을위한 계정.
  4. 감염 버퍼의 10 ML을 준비합니다.
  5. 천천히 TD 버퍼의 5 ML로 씻어 다음 10 남은 문화와 요리에서 HEK 293 세포 성장 매체를 제거합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 각각의 접시와 부화 감염 버퍼 1 ML을 추가합니다. 이 감염 기간 동안 부드럽게 15 분 간격으로 측면으로 각 문화 요리 측을 신난다.
  6. 감염 후 18 시간 동안 37 ° C에서 신선한 HEK 293 세포 성장 매체와 부화 9 ML에 추가합니다.
  7. 아하 라벨 매체 (또는 컨트롤에 대한 컨트롤 매체들을 만났고) 100 ML을 준비합니다. 레이블링 미디어를 준비하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 집중 재고 솔루션을 필터링해야합니다.
  8. 신중하게 (그래서 같은 감염된 세포를 멀리 씻어 없습니다) 18 시간 후 HEK 293 세포 성장 매체를 제거ND는 TD 버퍼의 5 ML 각 문화 접시를 씻는다.
  9. TD 버퍼 세척 용액을 제거하고 각 문화 접시에 아하 라벨 매체의 10 ML에 추가합니다. 컨트롤의 경우 메티오닌 제어 매체는이 단계에서 대신 아하 라벨 매체를 사용해야합니다.
  10. 6 시간 동안 37 ° C에서 매체를 레이블링에 감염된 세포를 품어. 레이블은 12 사이에 언제든지 실시 가능 - 24 시간 이후 감염되지만이 기간이 6 시간 이하 여야한다. 보장 감염이 크게 줄어들되지 않는 동안이 간격은 바이러스 구조 단백질 번역과 중복을 최대화하기 위해 결정되었다 7.
  11. 신중하게 라벨 매체를 제거하면 이렇게 같은 세포를 중단하는 수 없습니다. 각 요리에 신선한 HEK 293 세포 성장 매체의 10 ML을 추가하고 또 다른 18 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 이 단계 동안에 감염된 세포의 손실을 최소화하기 위해서는 전적으로 라벨 솔루션을 제거할 필요는 없습니다. HEK 293 세포 성장 매체는 M의 초과를 포함동부 표준시 이는 잔여 아하을 outcompete 것입니다.
  12. 정화를 위해 3 단계로 진행합니다.

2. Azido - 설탕 - 라벨 아데노 바이러스의 제작

  1. 최대 및 단계 1.5를 포함한 AHA-라벨 아데노 바이러스 생산이라는 절차를 따르십시오.
  2. Azido - 설탕 라벨 매체의 100 ML을 준비합니다.
  3. 44 시간 동안 37 ° C에서 신선한 Azido - 설탕 라벨링 매체와 부화 10 ML과 세포를 커버.

3. Azide 라벨이 표시된 Adenoviral 입자의 정제

  1. 각 문화 요리와 원뿔 튜브로 전송에서 감염된 세포와 함께 미디어를 제거합니다. 4에서 10 분 동안 2천g에서 원심 ° C. 표면에 뜨는를 제거하고 TD 버퍼의 펠렛을 (10 요리 당 TD 버퍼 8 ML 사용) resuspend.
  2. 액체 질소와 37 ° C의 물을 욕조의 Dewar 플라스크를 사용하여 반복 (3 이상) 냉동 해동 사이클에 의해 감염된 세포를 Lyse. 10 분 동안 2천g에서 원심 분리기4에 ° C 뜨는에서 세포 파편을 분리합니다.
  3. 첫번째 울트라 클리어 원심 튜브에 1.25 G / ML CsCl 용액 2.5 ML을 pipetting하여 CsCl 밀도 기울기 원심 튜브를 준비합니다. 그런 다음 천천히 그라디언트 인터페이스를 방해하지 않도록 돌보는 1.4 G / ML CsCl 솔루션의 2.0 ML을 추가하는 튜브 하단에 위치의 팁과 피펫을 사용합니다.
  4. CsCl 밀도 구배 관의 꼭대기에서 단계 3.2에서 뜨는을 피펫 및 튜브를 채우기 위해 필요한 추가 TD 버퍼 경우. 15에서 1 시간을위한 125,000그램에서 스윙 버킷 로터 ° C ultracentrifuge에서에서 샘플을 원심 분리기.
  5. ultracentrifugation 완료 후, 바이러스 입자는 두 CsCl 솔루션의 인터페이스에서 두꺼운 흰색 밴드로서 표시한다. 솔루션 dropwise 드레인 수 있도록 무균 바늘과 튜브의 하단에 작은 천공을 만듭니다.
  6. 두꺼운 흰색 밴드를 모아서 어느 끝, 라벨 Ad5 입자를 포함한다g 보험 초과 CsCl 솔루션을 제외할 수 있습니다. 바이러스 레이어 위에 밴드 것입 세포 단백질 수집을 피하십시오. 또한 약간 두꺼운 흰색 바이러스 밴드 위에 라이터 레이어를 형성 빈 virion의 capsids을 제외할 수 있습니다.
  7. 선택적으로 레이블 Ad5 입자의 최종 정화를 수행합니다. 3.6 단계에서 4-ML ultracentrifuge 튜브에 수집한 분수를 추가하고 1.35 G / ML CsCl 용액으로 튜브를 입력하십시오. 15 ° C에서 18 시간 동안 12만5천그램에서 원심과 같이 3.5 및 3.6에 설명된대로 튜브의 중간에 형성 두꺼운 흰색 밴드를 수집합니다. (바이러스 titer가 낮은 경우, 흰색 밴드는 두 번째 원심 분리 후 보이지 않을 수도 있고, 그것이 표시된 바이러스를 복구할 수 없습니다됩니다.)
  8. 오랜 기간 동안 바이러스 입자의 저장 용량은 수집된 바이러스 추출물의 투석은 바이러스 저장소 버퍼에 대해 수행해야합니다. -80 ° C.에 dialyzed 바이러스 샘플을 저장

4. 리스트레인 프로모션 Azide-Alkyne Cycloaddition를 사용 Alkyne 프로브와 수정된 Adenoviral 입자의 gation (SPAAC)

  1. 바이러스 스토리지 버퍼에 azide으로 수정한 Ad5 50 μl의 솔루션으로, SPAAC의 라벨링 솔루션의 0.25 μl를 추가합니다. (상용 무한 alkynes의 venders 목록은 시약의 테이블 참조).
  2. 실온에서 하룻밤을 수행하기 위해 스트레인 추진의 cycloaddition 반응을 허용합니다. 불빛에 민감한 프로브 (예 TAMRA)를 사용하는 경우, 알루미늄 호일과 반응 용기를 포괄합니다.
  3. 6 단계에 따라 레이블이 바이러스를 정화.

5. Deoxygenated 분위기에서 구리 (I) 촉매 Azide-Alkyne의 Cycloaddition (CuAAC)를 사용 Alkyne 프로브와 수정된 Adenoviral 입자의 결합

  1. 구리의 장소 7.2 밀리그램 (I) Eppendorf 튜브에 브로마이드 (CuBr) 분말은 알루미늄 박으로 덮여.
  2. 두 번째 Eppendorf 튜브에 DMSO의 피펫 1 ML.
  3. 준비삼분의 일 Eppendorf 튜브에 CuAAC의 라벨링 솔루션의 50 μl. alkyne 프로브는 불빛에 민감한 경우 알루미늄 박으로 표지 (예 : TAMRA-Alkyne).
  4. 6 시간 동안 deoxygenated 장갑 가방 속에 세 개의 Eppendorf 튜브, uncapped를 놓습니다. 모든 샘플 CuAAC 반응의 완료까지 장갑 가방 내부에 유지됩니다.
  5. 5.4 단계에 따라 deoxygenated되었습니다 둘 다, CuBr 분말 7.2 MG로 DMSO의 1 ML을 추가하여 CuBr 50 × 주식 솔루션을 준비합니다.
  6. 5.4 단계에 따라 deoxygenated되었습니다 CuAAC 라벨 솔루션, 50 μl에이 CuBr 주식 솔루션 1 μl를 pipetting하여 CuAAC 반응을 시작하라. 장갑 가방 안에서 12 시간 동안 진행하는 반응을 허용합니다.
  7. 6 단계에 따라 레이블이 바이러스를 정화.

6. 라벨 바이러스 입자의 정제 및 저장

  1. Centri-9월 겔 여과 스핀 C를 사용하여 레이블이 붙은 바이러스 샘플을 정화제조 업체의 지침에 따라 바이러스 저장소 버퍼와 equilibrated olumns.
  2. 양자 택일로, 정화는 바이러스 저장소 버퍼에 대한 투석에 의해 수행 할 수 있습니다.
  3. 레이블이 붙은 바이러스 입자는 -80 ° C.에 저장해야합니다

7. 라벨 아데노 바이러스 및 형광등 젤 스캔 SDS-PAGE

  1. 10 분 대한 분류 바이러스와 종기 투석을 20 μl 20 μl Laemmli 샘플 버퍼 (2 ×)를 추가합니다. precipitates 어떤 불용성을 제거하는 30 초 동안 샘플을 원심 분리기. 잔여 구리는 정화 후 있으면 샘플을 끓고 것은 시각화하는 동안 어려움을 초래, SDS-PAGE 젤의 단백질 굵은 줄무늬가 발생할 수 있습니다. 이 경우이 단계에서 샘플의 끓는를 ...없이 지내다.
  2. 전기 영동 세포로 겔 카세트를 첨부하고 실행 버퍼를 추가합니다. 바이러스성 단백질 샘플 우물의 필요한 숫자를로드합니다. 물론 사전에 왠 일이야를로드하는 하나를 사용하여네드 분자량 마커. 200으로 1 시간을위한 젤을 실행 V. 전체 기간 동안에 알루미늄 박으로 덮여 전기 영동 세포가 형광단 라벨의 photobleaching 줄이기 위해 유지.
  3. 최고 해상도와 모든 자유 형광단를 제거하는 경우, 추적 염료는 전기 영동 중에 젤 부족 수 있습니다. 전기 영동을 중지하고 신속하게 형광등 겔 스캐너로 젤을 전송하고 적절한 파장 (TAMRA에 대한 574 nm의)에서 형광 방출을위한 젤을 검사합니다.
  4. 각 바이러스성 입자의 복합 염료 분자의 갯수는 몇 가지 표준 TAMRA의 농도의 형광을 측정하고 단계 7.3에서 샘플을 가지고 비교하여 계량하실 수 있습니다.

8. 대표 결과

SDS-PAGE & TAMRA - 복합 Ad5의 형광 겔 검사의 관찰된 결과는 그림 3에 표시됩니다. 이러한 형광 겔 스캔 샘플 modi에서 수행 되었으나프로브가 SPAAC 통해 출혈도 잡았 때 CuAAC 통해 얘기 들이었다, 결과는 비교할 수 있어야합니다. 이러한 겔 스캔에 따르면 세 Ad5 capsid 단백질 (Hexon, Penton 및 섬유)의 수정에 아하 라벨 결과, 설탕 라벨링에만 섬유 capsid 단백질을 수정하면서. 또한, 아하 농도의 증가 (4 MM 대 32 MM)가 아하의 정관의 큰 정도의 결과지만, 또한 감염을 줄일 보여왔다. 이전 결과 7 4mm짜리에서 생산 Ad5위한 아하, 노출 메티오닌 사이트의 대략 5 % 32 밀리미터 아하가 사용될 때이 숫자는 10 %로 증가와 함께 TAMRA - 수정된 것을 나타냅니다. 이것은 각각 약 280 및 510, Ad5 입자 당 염료 라벨이 사이트에 해당합니다. 설탕 - 라벨 1의 분석은 대략 22 Ad5에서 36 글리코 실화 사이트가 azido 설탕에 의해 점령과 이후 TAMRA으로 표시되는 지적했다.

설명된대로 열 조직 배양 플레이트는 azide으로 수정한 Ad5를 생산하기 위해 사용하는 경우 이 프로토콜에서, 200 - azide으로 수정한 바이러스 300 μl는 약 1.5의 titer × 10 12 입자 / ML로 단계 3.6에서 수집한 흰색 밴드에서 얻을 수 있습니다. 이 절차의 일반적인 난이도는 낮은 바이러스 titer에 의한 것이이 정화 단계에서 바이러스 밴드의 부재이다. 감염 후 접시에서 느슨하게지게하는 - - 1 단계 기간 동안 rinsing 동안 이것은 일반적으로 하나 이상 또는 이하 - 지류, 또는 세포를 떠내려가는하여있는 세포를 감염의 결과입니다.

그림 1
그림 1. 프로토콜 개요. Azide 함유 아하 또는 GalNAz 처음 아데노 바이러스 입자에 통합됩니다. 형광 alkyne 프로브로 내고 그 다음 "클릭"화학을 통해 수행됩니다. 마지막으로, SDS-PAGE는 형광 프로브의 결합을 설명하는 데 사용됩니다.

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그림 2. 진입 alkyne 프로브의 결합 azide-수정된 드 산소 이하 () SPAAC, (B) CuAAC 그리고 (c) 산소 분위기를 통해 바이러스를.

그림 3
그림 3. TAMRA - Alkyne와 CuAAC 활용 후 azide-라벨이 아데노 바이러스 타입 5 (Ad5)의 SDS-PAGE의 형광 스캔. () 아하의 두 농도를 이용하여 Ad5 AHA-라벨. 레이블이 증가 아하 농도와 함께 증가 라벨의 범위로, 아데노 바이러스 Hexon, Penton 및 섬유 capsid 단백질에서 발생하는 것으로 나타납니다. (B) AC 4 GalNAz-라벨 아데노 바이러스는 섬유 capsid 단백질을 분류하는 것 같아요.

용액 준비 노트
Ad5 저장 버퍼 5 MM 트리스-HCL 버퍼 (산도 8.0)가 0.5 밀리미터를 포함 MgCl 2, 50 MM NaCl, 25 % (V / V) 글리세롤 및 0.05 % (W / V) 소 혈청 알부민 (BSA) -20 ° C에서 저장
Ad5 감염 버퍼 2퍼센트 (V / V) 소 송아지 혈청, 1 × TC 솔루션 Ad5 저장 버퍼 (방어 10 PFU / 전지 및 1시 20분의 감염 지수를 사용하여 결정 볼륨). TD 버퍼를 사용하여 최종 볼륨에 대한 해결책을 지참 Ad5 농도는 자외선을 흡수를 통해 확인할 수 있습니다.
TC 솔루션 (200 ×) 136 MM CaCl 2, 100 밀리미터 MgCl 2 4에서 저장 ° C
TD 버퍼 137 MM NaCl, 5 KCl 밀리미터, 밀리미터에게 나 2 HPO 4, 25 MM 트리스-HCL, 산도 7.5를 0.07 4에서 저장 ° C
HEK 293 세포 성장 매체 Dulbecco의 수정일 이글 배지 (DMEM)는 10 % (V / V) 소 송아지 혈청 (BCS)와 1 % (V / V) 펜 Strep과 보충 4에서 저장 ° C
Cys 증권 솔루션 (100 ×) DMEM는 (-메트로 /-Cys) 200 MM L-시스테인과 보충 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다.
아하 스톡 용액 (25 ×) DMEM는 (-메트로 /-Cys) 100 MM L-Azidohomoalanine로 보충 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다.
아하 라벨 매체 DMEM는 (-메트로 /-Cys) 2 MM L-시스테인 10% BCS, 아하 주식 용액 (1 ×)로 보충 사용하기 전에 신선한 준비합니다.
이건 4 MM C에 해당아하의 oncentration 다른 농도는 (대표 결과 참조) 사용될 수 있지만.
메트로 주식 용액 (25 ×) DMEM는 (-메트로 /-Cys) L-메티오닌 100 MM로 보충 사용하기 전에 0.2-μm의 멸균 주사기 필터로 신선하고 필터를 준비합니다.
메트로 제어 매체 DMEM는 (-메트로 /-Cys) 주식 용액 (1 ×)를 만나 10 % BCS와 보완이 MM L-시스테인 사용하기 전에 신선한 준비합니다.
AC 4 GalNAz 주식 솔루션 (1,000 ×) 메탄올에서 50 밀리미터 peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) 4 ° C.에 저장 AC 4 GalNAz은 GlcNAz으로 신진 대사 전구체이다.
Azido - 설탕 라벨 매체 100 μl AC 4 GalNAz 주식 솔루션, 100 ML HEK 293 세포 성장 매체 메탄올은 HEK 293 세포 성장 매체를 추가하기 전에 증발하도록 허용합니다.
세슘 염화물 솔루션 CsCl은 TD 버퍼에 녹아 :
1.25 G / ML (18.08 g / 50 ML H 2 O)
1.35 G / ML (25.60 g / 50 ML H 2 O)
1.40 G ​​/ ML (31.00 g / 50 ML H 2 O)
ultracentrifugation에 대한 밀도 기울기
바이러스 스토리지 버퍼 인산염은 CaCl 2, 0.9 밀리미터 MgCl 2, 10 % (V / V) 글리세롤 0.5 밀리미터를 포함, 식염수 (PBS), pH를 7.2 버퍼 -20 ° C에서 저장
TAMRA-BCN (SPAAC) 라벨링 솔루션 DMSO의 TAMRA-BCN :
  1. 자외선 AB를 사용단계 4.1 바이러스 솔루션의 titer를 결정하는 sorbance (OD 260 검정)
  2. 50 μl 나누어지는의 바이러스 입자의 총 개수 (N Ad5)를 결정
  3. TAMRA-BCN의 molarity는 (M)을 사용하여 결정됩니다 :
    C BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo)
    N Avo = 6.022 × 10 23
    (단계 중 4 단계에서 준비 반응 혼합물은 virion 당 100 alkyne 프로브를 포함하고 있으므로)
스트레인 추진 alkyne 프로브
SDS-PAGE, 대략 10 12 입자 / ML의 바이러스 titer가 제안되어 들어
TAMRA-Alkyne (CuAAC) 라벨링 솔루션 바이러스 스토리지 버퍼에 azide으로 수정한 Ad5 (N Ad5 위의 같이 결정) 50 μl, 1.5 밀리미터 batho phenanthroline disulfonate (예 : 1.5 × 최종 CuBr 농도), TAMRA-Alkyne.
TAMRA-Alkyne의 molarity는 (M)을 사용하여 결정됩니다 :
C 하시죠 = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo)
(5 단계에서 준비 반응 혼합물은 virion 당 100 alkyne 프로브를 포함하고 있으므로)
트리스 버퍼는 구리의 경쟁력과 억제 리간드로 알려져있다 8.
Laemmli 샘플 버퍼 (2 ×) 125 MM 트리스-HCL (산도 6.8), 4 % (W / V)은 SDS, 20 % (V / V) 글리세롤 10 % (V / V) 2 - 메르 캅 토 에탄올, 그리고 0.004 % (W / V) bromophenol 블루
버퍼를 실행 187 MM 글리신, 19 MM 트리스-HCL, H 2 O 3.5 MM SDS 4에서 저장 ° C
T "> 표 1.이 프로토콜에 필요한 버퍼 및 솔루션의 작성.

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Discussion

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azides의 포함 chemoselective 및 bioorthogonal 클릭 반응,의 개발 연구가 빠르게 진화 영역이며, 이후 bioconjugation 어플 리케이션에 선택할 수있는 이러한 반응의 증가가있다. 우리는 우리 자신의 실험실 및 모든 시약의 상업적인 가용성으로 인해 그들의 유용성 때문에 선택받은 단 두 가지 방법을 포함하도록이 프로토콜의 범위를 제한했습니다.

최초의 루트에서는 - 스트레인 추진 azide - alkyne의 cycloaddition (SPAAC) - alkyne은 cyclooctyne 링 (그림 2A) 내에 포함되어 있습니다. 이것은 최근에 개발된 방법은 산소 분위기 아래와 구리 촉매에 대한 필요성없이 진행하실 수 있습니다. 9,10는 최근까지이 방법 중 하나 단점은 터미널에 사용 alkynes에 비해 이러한 무한 alkynes의 힘드는 합성과 감소 상업적 가용성이었다 구리 (I) 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (잘라내기AAC는)하지만, 이러한 프로브의 증가 도서관 (시약의 테이블 참조) 현재 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는이 프로토콜의 선택의 방법으로 SPAAC을 선택하셨습니다.

또한 chelating 에이전트 (그림 2B)로 bathophenanthroline disulfonic 산 나트륨 염 (BDA)를 사용 deoxygenated 분위기 CuAAC 통해 azide-수정된 adenoviral 입자의 결합은이 프로토콜에 설명되어. 이 방법은 BDA 촉매는 상업적으로 사용 가능하고 저렴한 모두 있는지에 편리합니다. 또한, 수확량은 일반적으로 사용 가능한 방법 중 최고이며, 용액의 반응성 산소 종의 생성 (참조하라 아래, CuAAC를 산소)로 인해 발생하는 합병증을 피할 수있다보고 8.는 그러나, 구리 (I) 촉매는 세포 독성 것으로 알려져있다, 11이 절차를 구현하는 데 필요한 전문 장비를 사용하는 일부 집단을 억제 수도 있습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는이 방법이 효율적이고 유용아데노 바이러스 수정.

CuAAC의 3 분의 유용한 방법은 최근에 산소를 대기 상태 (그림 2C)에서 작동하도록 개발되었습니다. 8이 방법은 BDA-chelated 접근 방식과 동일한 혜택을 누리고 있지만의 산화 파괴하지 않고 대기 산소를 수용하기 위해 chelating업자로 대신 THPTA 사용 기판. 이 chelating 에이전트의 직접적인 syntheses가보고되어 있지만,이 접근법의 하나 작은 단점은, THPTA의 상업적인 가용성의 현재 없다는 것입니다. 8 우리가 우리 자신의 시스템이 결합 방법을 수행하지 않지만 THPTA / CuAAC가 비교 생산할 것으로 예상됩니다 산소 분위기 허용의 추가 편의와 BDA / CuAAC에 대한 결과입니다.

의도적으로 상용 자료 중심이 프로토콜의 개발에도 불구하고, 우리는 여전히 비용 장점과를 합성의 증가 유연성을 인식하고자하는azides과 본 이용 alkyne 프로브. Azidohomoalanine는 짧은 셋처럼 일 및 상업 소스보다 훨씬 적은 비용으로 준비하실 수 있습니다. 6,12가 긴장 alkyne을 준비보다 11 어렵지만 프로브 선택의 큰 자유를 살 수 있습니다했다.

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Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리 기금 (CBET-0846259)에 대한 NSF 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene BCBC 391
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells ATCC CRL-1573
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Invitrogen 11965-092
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose Invitrogen 21013-024
Bovine Calf Serum Invitrogen 16170-078
Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) Invitrogen 15140-122
0.5% Trypsin-EDTA (10×) Invitrogen 15400-054
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene BD Falcon 353003
Cell culture CO2 incubator
Hemocytometer
Biosafety cabinet
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) VWR 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)
Avanti J-E centrifuge Beckman Coulter 369001
Conical tubes (50 ml, sterile) BD Falcon 352098
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman 344059
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor Beckman
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf 0030 121.589
Centrifuge 5418 Eppendorf 5418
Centri-Sep gel filtration spin columns Princeton Separations CS-901
Sterile needle, 18 gauge
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed)
Dewar flask
Liquid nitrogen
Electrophoresis cell
Fluorescent gel scanner
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1105
L-Azidohomoalanine AnaSpec 63669
Jena Biosciences CLK-AA005
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) Invitrogen C33365
Thermo Scientific 88905
Sigma-Aldrich A7480
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt MP Biomedicals 0215011201
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Methanol
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Disodium Phosphate (Na2HPO4)
Phosphate buffered saline (PBS)
1M HCl
Glycerol
Bovine Serum Albumin
L-cysteine
L-methionine
SDS (sodium dodecyl sulfate)
2-mercapt–thanol
Glycine
Bromophenol blue
Cesium Chloride (CsCl)
Copper(I) Bromide (CuBr)
Calcium Chloride (CaCl2)
Potassium Chloride (KCl)
Magnesium Chloride (MgCl2)
Sodium Chloride (NaCl)
Alkyne probe for CuAAC*
TAMRA Alkyne Invitrogen T10183
Strained alkyne probe for SPAAC*
TAMRA DIBO Alkyne Invitrogen C10410

* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs.

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References

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Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경
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Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).More

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).

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