Adenovirus partikler er konstruert for å inneholde enten unaturlig aminosyren analoge azidohomoalanine eller azido sukker<em> O</em>-GlcNAz. Den azide gruppe av hver er chemoselectively ligated via "klikk" kjemi reaksjoner som et middel for viral overflate modifikasjon.
Modifikasjonen av viruspartikler har mottatt en betydelig mengde oppmerksomhet for sin enorme potensialet for å påvirke genterapi, oncolytic søknader og vaksineutvikling. 1,2,3 dagens tilnærminger til å endre viral overflater, som for det meste genetikk-baserte, ofte lider av demping virus produksjon, smittsomhet og cellulær transduksjon. 4,5 Bruke chemoselective klikk kjemi, har vi utviklet en grei alternativ tilnærming som sidesteps disse spørsmålene mens resterende både svært fleksibel og tilgjengelig. 1,2
Målet med denne protokollen er å demonstrere effekten av å bruke bioorthogonal klikk kjemi for å endre overflaten av adenovirus type 5 partikler. Denne to-trinns prosess kan brukes både terapeutisk 1 eller analytisk, 2,6 som det åpner for chemoselective ligation av målretting molekyler, fargestoffer eller andre molekyler av interesse på proteinerpre-merket med Azide tags. De tre store fordeler med denne metoden er at (1) metabolsk merking demonstrerer liten eller ingen innvirkning på viral fitness, 1,7 (2) et bredt spekter av effektor ligander kan utnyttes, og (3) det er bemerkelsesverdig rask, pålitelig og lett tilgang til. 1,2,7
I det første trinnet i denne fremgangsmåten, er adenovirus partikler produsert peiling enten azidohomoalanine (Aha, en metionin surrogat) eller unaturlig sukker O-forbundet N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), som begge inneholder natriumazid (-N 3) funksjonell gruppe. Etter rensing av azide-modifiserte viruspartikler, er en alkyne sonde som inneholder fluorescerende Tamra moiety ligated på en chemoselective måte til pre-merkede proteiner eller glykoproteiner. Til slutt, en SDS-PAGE-analyse utført for å demonstrere vellykkede ligation av sonden på de virale kapsid proteiner. Aha innlemmelse er vist å merke alle viral kapsidproteiner (Hexon, Penton og fiber), mens O-GlcNAz inkorporering resulterer i merking av Fiber bare.
I dette utvikler feltet, har flere metoder for azide-alkyne ligation blitt utviklet, men bare de to vi har funnet å være mest praktisk er demonstrert her – stamme-forfremmet azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) og kobber-katalysert azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosfære.
Utviklingen av chemoselective og bioorthogonal klikk reaksjoner, inkludert de av azider, er en hurtig utviklende område av forskning, og deretter er det et økende antall av disse reaksjonene å velge fra for bioconjugation applikasjoner. Vi har begrenset omfanget av denne protokollen til å omfatte bare to metoder som ble valgt på grunn av nytten sin i vår egen lab og kommersiell tilgjengelighet av alle reagenser.
I den første slike rute – stamme-forfremmet azide-alkyne cycloaddition (S…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne NSF for finansiering (CBET-0846259).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
Cell culture CO2 incubator | ||
Hemocytometer | ||
Biosafety cabinet | ||
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
Sterile needle, 18 gauge | ||
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
Dewar flask | ||
Liquid nitrogen | ||
Electrophoresis cell | ||
Fluorescent gel scanner | ||
Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
Thermo Scientific | 88905 | |
Sigma-Aldrich | A7480 | |
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
Methanol | ||
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ||
1M HCl | ||
Glycerol | ||
Bovine Serum Albumin | ||
L-cysteine | ||
L-methionine | ||
SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
2-mercaptoethanol | ||
Glycine | ||
Bromophenol blue | ||
Cesium Chloride (CsCl) | ||
Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
Calcium Chloride (CaCl2) | ||
Potassium Chloride (KCl) | ||
Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
Sodium Chloride (NaCl) | ||
Alkyne probe for CuAAC* | ||
TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.