Аденовирус частиц разработаны содержать либо неестественные аминокислоты azidohomoalanine аналог кислоты или азидо сахар<em> O</em>-GlcNAz. Азид группе каждый chemoselectively лигировали с помощью "мыши" химии реакции как средство вирусного модификации поверхности.
Модификации вирусных частиц получило значительное внимание его огромный потенциал для воздействия генной терапии, онколитических приложений и разработки вакцины. 1,2,3 Современные подходы к изменению вирусной поверхности, которые в основном генетики основе, часто страдают от ослабления вируса производства, инфекционной и клеточной трансдукции. 4,5 Использование chemoselective химии клик, мы разработали простой альтернативный подход которое обходит эти вопросы, оставаясь при этом и очень гибкой и доступной. 1,2
Целью этого протокола является демонстрация эффективности использования bioorthogonal химии нажмите, чтобы изменить поверхность аденовируса типа 5 частиц. Это двухступенчатый процесс может быть использован как терапевтически 1 или аналитически, 2,6, поскольку оно позволяет chemoselective перевязки ориентации молекул, красителей или других молекул интереса на белкипредварительно помечены азид теги. Три главных преимущества этого метода в том, что (1) метаболический маркировки свидетельствует о практически не влияет на вирусную фитнес, 1,7 (2) широкий спектр эффекторных лигандами могут быть использованы, и (3), удивительно быстрый, надежный и легко получить доступ. 1,2,7
На первом этапе этой процедуры, аденовирус частицы рождаются либо несущих azidohomoalanine (Ага, метионин, суррогатная) или неестественной сахар O-связанных N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), оба из которых содержат азид (-N 3) функциональный группы. После очистки азида модифицированных вирусных частиц, алкин зонд содержащие флуоресцентные часть TAMRA лигируют в chemoselective образом, чтобы предварительно меченых белков и гликопротеинов. Наконец, SDS-PAGE анализ проводится для демонстрации успешного перевязки зонда на вирусные белки капсида. Ага включение показано на этикетке все вирусного капсидабелки (Hexon, Пентон и волокон), а О-GlcNAz включение результатов в маркировке волоконно только.
В этой развивающейся области, несколько методов для азид-алкин перевязки были успешно разработаны, однако только два мы обнаружили, что наиболее удобным демонстрируется здесь – деформации способствует азид-алкин циклоприсоединения (SPAAC) и медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) под венозная атмосферу.
Развитие chemoselective и нажмите bioorthogonal реакций, в том числе азиды, является быстро развивающейся областью исследований, а затем растет число этих реакций на выбор для bioconjugation приложений. Мы ограничили рамки этого протокола, чтобы включать только два метода, которые были выбраны из-за их пол…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы выразить благодарность NSF для финансирования (CBET-0846259).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
Cell culture CO2 incubator | ||
Hemocytometer | ||
Biosafety cabinet | ||
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
Sterile needle, 18 gauge | ||
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
Dewar flask | ||
Liquid nitrogen | ||
Electrophoresis cell | ||
Fluorescent gel scanner | ||
Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
Thermo Scientific | 88905 | |
Sigma-Aldrich | A7480 | |
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
Methanol | ||
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ||
1M HCl | ||
Glycerol | ||
Bovine Serum Albumin | ||
L-cysteine | ||
L-methionine | ||
SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
2-mercaptoethanol | ||
Glycine | ||
Bromophenol blue | ||
Cesium Chloride (CsCl) | ||
Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
Calcium Chloride (CaCl2) | ||
Potassium Chloride (KCl) | ||
Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
Sodium Chloride (NaCl) | ||
Alkyne probe for CuAAC* | ||
TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.