Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Chemoselective Модификация поверхности с помощью вирусного Bioorthogonal химии нажмите

doi: 10.3791/4246 Published: August 19, 2012

Summary

Аденовирус частиц разработаны содержать либо неестественные аминокислоты azidohomoalanine аналог кислоты или азидо сахар

Abstract

Модификации вирусных частиц получило значительное внимание его огромный потенциал для воздействия генной терапии, онколитических приложений и разработки вакцины. 1,2,3 Современные подходы к изменению вирусной поверхности, которые в основном генетики основе, часто страдают от ослабления вируса производства, инфекционной и клеточной трансдукции. 4,5 Использование chemoselective химии клик, мы разработали простой альтернативный подход которое обходит эти вопросы, оставаясь при этом и очень гибкой и доступной. 1,2

Целью этого протокола является демонстрация эффективности использования bioorthogonal химии нажмите, чтобы изменить поверхность аденовируса типа 5 частиц. Это двухступенчатый процесс может быть использован как терапевтически 1 или аналитически, 2,6, поскольку оно позволяет chemoselective перевязки ориентации молекул, красителей или других молекул интереса на белкипредварительно помечены азид теги. Три главных преимущества этого метода в том, что (1) метаболический маркировки свидетельствует о практически не влияет на вирусную фитнес, 1,7 (2) широкий спектр эффекторных лигандами могут быть использованы, и (3), удивительно быстрый, надежный и легко получить доступ. 1,2,7

На первом этапе этой процедуры, аденовирус частицы рождаются либо несущих azidohomoalanine (Ага, метионин, суррогатная) или неестественной сахар O-связанных N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), оба из которых содержат азид (-N 3) функциональный группы. После очистки азида модифицированных вирусных частиц, алкин зонд содержащие флуоресцентные часть TAMRA лигируют в chemoselective образом, чтобы предварительно меченых белков и гликопротеинов. Наконец, SDS-PAGE анализ проводится для демонстрации успешного перевязки зонда на вирусные белки капсида. Ага включение показано на этикетке все вирусного капсидабелки (Hexon, Пентон и волокон), а О-GlcNAz включение результатов в маркировке волоконно только.

В этой развивающейся области, несколько методов для азид-алкин перевязки были успешно разработаны, однако только два мы обнаружили, что наиболее удобным демонстрируется здесь - деформации способствует азид-алкин циклоприсоединения (SPAAC) и медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) под венозная атмосферу.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

См. Таблицу 1 для приготовления всех средствах массовой информации, буферов и решения, указанные в данном протоколе.

1. Производство Aha-Маркированный аденовирус

  1. Подготовить одиннадцать 100-мм культуры тканей блюда человеческих эмбриональных клеток почки (НЕК 293) поддерживается в НЕК 293 среднего роста клеток (см. Таблицу 1) при 37 ° С, пока они не достигли 80 - 90% слияния. (Примечание:. Культуры, слияния более чем на 90% может быть трудным для заражения и не могут производить вирусы по желанию)
  2. Ослабить клеток в одном из блюд, сначала удалив ростовую среду, промывки раз в 5 мл буфера TD, то инкубации клеток в течение одной минуты в 1 мл трипсина-ЭДТА (1 х).
  3. Добавить 9 мл НЕК 293 среднего роста клеток, а также использовать гемоцитометра для подсчета количества заготовленной НЕК 293 клетках от этого блюда. Используйте этот номер для расчета количества аденовируса типа 5 (Ad5), необходимых для инфекции, используя multiplicitУ инфекций (МВД) стоимостью 10 БОЕ / клетка. Счет к тому, что для нормального Ad5, инфекционной индекс (отношение инфекционных частиц к общему числу частиц), как правило, 1:20.
  4. Подготовить 10 мл инфекции буфера.
  5. Медленно снимите НЕК 293 рост клеток среды из десяти оставшихся блюд культуры, затем промыть 5 мл буфера TD. Добавить 1 мл инфекции буфер к каждому блюду и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. В этот период инфекция, осторожно встряхнуть каждую сторону культуры блюдо в сторону на 15-минутными интервалами.
  6. После заражения, добавляют 9 мл свежего НЕК 293 ячейки среднего роста и инкубируют при 37 ° C в течение 18 часов.
  7. Подготовить 100 мл Ага маркировки среды (или встретил управление средой для контроля). Будьте уверены, чтобы фильтровать концентрированные растворы акции с 0,2-мкм стерильный шприц фильтр перед приготовлением маркировки средств массовой информации.
  8. Аккуратно (чтобы не вымывать инфицированные клетки) удалить НЕК 293 рост клеток среду после 18 часовя мыть каждую культуру блюдо с 5 мл буфера TD.
  9. Удалить TD промывочного раствора буфера и добавить 10 мл среды маркировки Ага каждой культуре блюдо. Для контроля, метионин контроля среды следует использовать вместо среды маркировки Ага на этот шаг.
  10. Инкубируйте инфицированных клеток в маркировке среде при температуре 37 ° С в течение 6 часов. Маркировка может быть осуществлена ​​в любое время между 12 - 24 часов после заражения, но не должна превышать 6 часов в срок. Этот интервал был определен максимально пересекается с вирусным белком структурных перевода при обеспечении инфекционной существенно не уменьшилось 7.
  11. Осторожно снимите маркировки средних, чтобы не нарушить клетки. Добавьте 10 мл свежего НЕК 293 среднего роста клеток в каждом блюде и инкубировать клетки при 37 ° С в течение еще 18 часов. Чтобы свести к минимуму потери инфицированных клеток на этом этапе, это не необходимо снять маркировку решение полностью. НЕК 293 клеточного роста средней содержит избыток Mи др. которые будут вытеснять любые остаточные Ага.
  12. Перейдите к шагу 3 для очистки.

2. Производство сахара-азидо-Маркированный аденовирус

  1. Следуйте процедуре под названием Производство Aha-Маркированный аденовирус, вплоть до шага 1.5.
  2. Подготовить 100 мл азидо сахара маркировки среды.
  3. Крышка ячейки с 10 мл свежего азидо-сахар среднего маркировки и инкубируют при 37 ° C в течение 44 часов.

3. Очистка Азид-Маркированный Аденовирусные частицы

  1. Извлеките носитель вместе с зараженной клетки от каждого блюда культуры и передачи конические трубки. Центрифуга в 2000 г в течение 10 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и осадок ресуспендируют в буфере TD (используя 8 мл TD буфер на 10 блюд).
  2. Лизиса инфицированных клеток повторные (3 и более) циклов замораживания-оттаивания использовании сосуд Дьюара с жидким азотом и 37 ° С водяной бане. Центрифуга в 2000 г за 10 минпри 4 ° С в отдельной камере мусор из супернатанта.
  3. Подготовка градиента плотности CsCl центрифуги трубы сначала пипетки 2,5 мл 1,25 г / мл раствора в CsCl Ultra Clear трубы центрифуги. Затем с помощью пипетки с наконечником расположены в нижней части трубки постепенно добавить 2,0 мл 1,4 г / мл CsCl решения, стараясь не нарушать градиент интерфейс.
  4. Пипетировать супернатант из п. 3.2 в верхней части трубки CsCl градиента плотности, и при необходимости добавьте TD буфер для заполнения трубы. Центрифуга образцов в бакет ротора на 125 000 г в течение 1 часа при 15 ° С в ультрацентрифуге.
  5. После завершения центрифугирования, вирусные частицы должны быть видны в густой белой полосы на стыке двух CsCl решений. Сделайте небольшой перфорацией в нижней части трубки стерильной иглой, чтобы решение слить по каплям.
  6. Соберите толстой белой полосы, которая должна содержать меченые Ad5 частиц, возьмуг ухода, чтобы исключить превышение CsCl решение. Избегайте сбора клеточных белков, которые будут объединяться над вирусом слоя. Кроме того исключает пустой капсид вириона, которые образуют легкий слой чуть выше толстой белой полосы вируса.
  7. При желании, выполнять окончательную очистку на меченые Ad5 частиц. Добавить собранные фракции шагом от 3,6 до 4 мл ультрацентрифуге трубы и заполнить трубу с 1,35 г / мл CsCl решение. Центрифуга на 125 000 г в течение 18 часов при 15 ° C и собрать толстую белую полосу, которая образует в середине трубки, как описано в пунктах 3.5 и 3.6. (Заметим, что если вирусный титр низкий, белая полоса не может быть видна после второго центрифугирования, и это не будет возможно восстановить меченого вируса).
  8. Для хранения вирусных частиц в течение длительного периода времени, диализ собранных вирусов выписка должна быть выполнена против вируса буфер хранения. Хранить диализованной образцов вирусов при температуре -80 ° C.

4. Liдование изменения Аденовирусные частиц с помощью зондов алкин Штамм-Повышен Азид-алкин циклоприсоединения (SPAAC)

  1. К раствору 50 мл азида модифицированный вирус Ad5 в буферной памяти, добавить 0,25 мкл маркировки SPAAC. (См. таблицу реагентов для списка продавцы коммерчески доступных напряженных алкинов).
  2. Позвольте деформации способствует циклоприсоединения протекания реакции в течение ночи при комнатной температуре. Если светочувствительный датчик (например, TAMRA) используется, закройте реактор с алюминиевой фольгой.
  3. Очисти меченого вируса в соответствии с п. 6.

5. Лигирование изменения Аденовирусные частиц с помощью зондов алкин меди (I)-Катализированный Азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) в атмосфере венозная

  1. Место 7,2 мг меди (I) бромид (CuBr) порошка в трубку Eppendorf, покрытые алюминиевой фольгой.
  2. Внесите 1 мл ДМСО во вторую пробирку Эппендорфа.
  3. Готовить50 мкл раствора маркировки CuAAC в третью пробирку Эппендорфа. Накрыть алюминиевой фольгой, если зонд алкин является светочувствительный (например, TAMRA-алкин).
  4. Поместите три Эппендорф трубы, раскрытый в венозная сумку перчатки в течение 6 часов. Все образцы должны оставаться внутри перчатки мешок до завершения CuAAC реакции.
  5. Подготовьте 50 × фондовый решение CuBr добавлением 1 мл ДМСО до 7,2 мг CuBr порошок, оба из которых были венозная согласно п. 5.4.
  6. Начать CuAAC реакции с помощью пипетки 1 мкл этого решения акции CuBr до 50 мкл CuAAC решение маркировки, которая была венозная согласно п. 5.4. Позвольте протекания реакции в течение 12 часов внутри перчатки сумки.
  7. Очисти меченого вируса в соответствии с п. 6.

6. Очистка и хранение Маркированный вирусных частиц

  1. Очисти меченого вируса образцов с использованием Centri-Сен гель-фильтрации в спинуolumns уравновешенной вирусов буфера хранения, следующие рекомендации производителя.
  2. Кроме того, очистка может осуществляться путем диализа против вируса буфера хранения.
  3. Помечены вирусные частицы должны храниться при температуре -80 ° C.

7. SDS-PAGE с метками аденовирус и флуоресцентные сканирования геля

  1. Добавить 20 мкл образца Laemmli буфера (2 ×) в 20 мкл очищенной помечены вируса и кипятить 10 мин. Центрифуга образцов в течение 30 секунд, чтобы удалить нерастворимые осадки. Если остаточная медь присутствует после очищения, кипячения образца может привести к толстые прожилки белка на SDS-геле, в результате чего трудности при визуализации. В этом случае отказаться от кипячения образцов на этом этапе.
  2. Прикрепите гель кассеты электрофореза клеток и добавить работы буфера. Загрузите необходимое количество скважин образцы вирусов белки. Используйте один и загрузить предварительно СТАИопределена маркеры молекулярного веса. Запустите геля в течение 1 часа при 200 В. Имейте электрофорез клетка покрыта алюминиевой фольгой в течение всего периода уменьшить фотообесцвечивания флуорофора этикетке.
  3. Для достижения наилучшего разрешения и удалить все свободные флуорофора, позволяют отслеживать краситель бежать из геля при электрофорезе. Остановить электрофореза и быстро перенести гель на люминесцентные сканер и сканировать гель гель для флуоресцентного излучения на соответствующей длине волны (574 нм для TAMRA).
  4. Число молекул красителя сопряженных с каждым вирусных частиц может быть определена количественно путем измерения флуоресценции несколько стандартных концентрациях TAMRA и сопоставления с образцом, с шагом 7.3.

8. Представитель Результаты

Наблюдаемые результаты SDS-PAGE и люминесцентные сканирования геля TAMRA-сопряженных Ad5 показано на рисунке 3. Хотя эти флуоресцентные сканирования геля проводились на образцах модифицированнойFied через CuAAC, результаты должны быть сопоставимы, когда зонды лигируют через SPAAC. Эти гель сканирования показывают, что Ага маркировки приводит к модификации трех Ad5 капсид белков (Hexon, Пентон, и волокна), в то время как сахар маркировки изменяет только белки капсида волокон. Кроме того, увеличение концентрации Ага (4 мм против 32 мм) приводит к более высокой степени включения Ага, но это также было показано, что снижение инфекционной. До результатов 7 показывает, что для Ad5 производится в 4 мм Ага, примерно 5% подвергается метионин сайтов TAMRA модифицированные, с этим число увеличилось до 10% при 32 мм Ага используется. Это соответствует примерно 280 и 510, соответственно, краситель-меченных сайтов в Ad5 частиц. Анализ сахара маркировки 1 показали, что примерно 22 из 36 сайтов гликозилирования на Ad5 заняты азидо сахар, а затем помечены TAMRA.

Если десять пластин культуре ткани используются для производства азида модифицированных Ad5, как описано В этом протоколе, 200 - 300 мл азида модифицированный вирус должен быть получен из белой полосы собраны в пункте 3.6, с титром 1,5 × 10 12 частиц / мл. Общей сложности эта процедура является отсутствие вирусной группы в этой стадии очистки, которая может быть связано с низкой вирусной титр. Это, как правило, в результате заражения клеток, которые являются либо более или недостаточно сливной или вымывания клеток - которые становятся ослабил от пластины после заражения - в то время как полоскание при шаге 1.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обзор протокола. Азид содержащих Ага или GalNAz впервые включены в аденовирус частиц. Лигирование с флуоресцентный зонд алкин затем выполняется с помощью "мыши" химии. Наконец, SDS-PAGE используется для демонстрации перевязки флуоресцентный зонд.

Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. Лигирование зонд алкин на азид модифицированный вирус через (а) SPAAC, (б) CuAAC под де-кислородом и (с) кислородом атмосферы.

Рисунок 3
Рисунок 3. Флуоресцентные сканирование SDS-PAGE азида-меченных аденовируса типа 5 (Ad5) после CuAAC сопряжения с TAMRA-алкин. (А) Ага-меченных Ad5, с использованием двух концентраций Ага. Маркировка видимому, происходят на аденовирус Hexon, Пентон и волоконно капсид белков, со степенью маркировки увеличивается с повышением концентрации Ага. (Б) AC 4 GalNAz-меченных аденовирус, как представляется, помечены только на белок капсида волокон.

Решение Подготовка Примечания
Ad5 хранения буфера 5 мМ Трис-HCl буфером (рН 8,0), содержащего 0,5 мМ MgCl 2, 50 мМ NaCl, 25% (объем / объем), глицерин, и 0,05% (вес / объем), бычий сывороточный альбумин (BSA) Хранить при температуре от -20 ° C
Ad5 инфекции буфер 2% (объем / объем) бычий телячьей сыворотки, 1 × TC решение, Ad5 в буфер хранения (объем определяется по МВД от 10 БОЕ / клетка и инфекционной индекс 1:20). Доведите раствор до конечного объема использования TD буфер Ad5 концентрация может быть определена с помощью УФ-поглощения.
TC решения (200 ×) 136 мм CaCl 2, 100 мМ MgCl 2 Хранить при температуре 4 ° C
TD буфер 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,07 мМ Na 2 HPO 4 и 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5 Хранить при температуре 4 ° C
НЕК 293 клеточного роста средней Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% (объем / объем) бычий телячьей сыворотки (BCS) и 1% (объем / объем) Pen Strep Хранить при температуре 4 ° C
Cys маточного раствора (100 ×) DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 200 мМ L-цистеин Подготовить свежие и фильтра с 0,2-мкм стерильный шприц фильтр перед использованием.
Ага маточного раствора (25 ×) DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 100 мМ L-Azidohomoalanine Подготовить свежие и фильтра с 0,2-мкм стерильный шприц фильтр перед использованием.
Ага маркировки среднего DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 10% БКС, Ага маточного раствора (1 ×), 2 мМ L-цистеин Подготовить свежие перед использованием.
Это соответствует 4 мм сoncentration из Ага, хотя различные концентрации могут быть использованы (см. представитель результаты).
Met маточного раствора (25 ×) DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 100 мМ L-метионин Подготовить свежие и фильтра с 0,2-мкм стерильный шприц фильтр перед использованием.
Метеорологическое управление средой DMEM (-Met /-Cys) с добавлением 10% БКС, встретил маточного раствора (1 ×), 2 мМ L-цистеин Подготовить свежие перед использованием.
AC 4 GalNAz маточного раствора (1000 ×) 50 мМ peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) в метаноле Хранить при температуре 4 ° C. AC 4 GalNAz является метаболическим предшественником GlcNAz.
Азидо сахара маркировки среднего 100 мкл AC 4 GalNAz маточный раствор, 100 мл НЕК 293 клеточного роста средней Позвольте метанол испаряется до добавления НЕК 293 рост клеток среды.
Цезий растворов хлорида CsCl растворяется в буфер TD:
1,25 г / мл (18,08 г / 50 мл H 2 O)
1,35 г / мл (25,60 г / 50 мл H 2 O)
1,40 г / мл (31,00 г / 50 мл H 2 O)
Плотность градиентов для ультрацентрифугирования
Буфер хранения вирусов Фосфатного буфера (PBS), рН 7,2, содержащем 0,5 мМ CaCl 2, 0,9 мМ MgCl 2, и 10% (объем / объем) глицерин Хранить при температуре от -20 ° C
TAMRA-BCN (SPAAC) маркировка решение TAMRA-BCN в ДМСО:
  1. Использование УФ-поглощенияsorbance (OD 260 тест), чтобы определить титр вируса решение в шаге 4,1
  2. Определите общее количество вирусных частиц в 50 мкл (N Ad5)
  3. TAMRA-BCN молярность (в М) определяется с помощью:
    С BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Аво)
    N = 6,022 Аво × 10 23
    (Так что реакция смеси, приготовленной на шаге 4 содержит 100 алкин зондов в вириона)
Штамм раскрученной алкин зонд
Для SDS-PAGE, вирусный титр примерно 10 12 частиц / мл рекомендуется
TAMRA-алкин (CuAAC) маркировка решение 50 мкл азид модифицированный вирус Ad5 в буфер хранения (N Ad5 определяется как выше), 1,5 мМ Бато фенантролин дисульфонат (т.е. 1,5 × конечной концентрации CuBr), TAMRA-алкин.
TAMRA-алкин молярность (в М) определяется с помощью:
с Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Аво)
(Так что реакция смеси, приготовленной в шаге 5 содержит 100 алкин зондов в вириона)
Трис-буфера, как известно, быть конкурентоспособным и тормозных лиганд меди 8.
Laemmli буфера образца (2 ×) 125 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 4% (вес / объем) SDS, 20% (объем / объем), глицерин, 10% (объем / объем) 2-меркаптоэтанол, и 0,004% (вес / объем) бромфенола синий
Запуск буфер 187 мм глицин, 19 мМ Трис-HCl, 3,5 мм SDS в H 2 O Хранить при температуре 4 ° C
т "> Таблица 1. Подготовка буферов и решений, необходимых этим протоколом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Развитие chemoselective и нажмите bioorthogonal реакций, в том числе азиды, является быстро развивающейся областью исследований, а затем растет число этих реакций на выбор для bioconjugation приложений. Мы ограничили рамки этого протокола, чтобы включать только два метода, которые были выбраны из-за их полезности в нашей лаборатории и коммерческой доступности всех реагентов.

В первый такой маршрут - деформации способствует азид-алкин циклоприсоединения (SPAAC) - алкин содержится в кольце cyclooctyne (рис. 2а). Этот недавно разработанный метод может быть проведена под кислородом атмосферы и без медного катализатора. 9,10 До недавнего времени одним недостатком этого метода является трудоемким синтеза и снижение коммерческой доступности этих напряженных алкинов по сравнению с терминалом алкинов, используемых в меди (I), катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC), однако, растущую библиотеку этих зондов в настоящее время коммерчески доступны (см. таблицу реагентов). По этой причине мы выбрали SPAAC как метод выбора в этом протоколе.

Кроме того, описанные в этом протокол перевязки азида модифицированных аденовирусных частиц через CuAAC в атмосфере с использованием венозная bathophenanthroline дисульфокислоты динатриевая соль (BDA) в качестве хелатирующего агента (рис. 2б). Этот метод удобен тем, что BDA катализатора и коммерчески доступны и недороги. Кроме того, сообщается, как правило, дает высокий из доступных методов и осложнений, связанных с генерацией активных форм кислорода (см. кислородом CuAAC ниже) в растворе избежать 8. Тем не менее, меди (I), катализатор, как известно, цитотоксический, 11 и специализированного оборудования, необходимых для осуществления этой процедуры может отпугнуть некоторых групп от его использования. Тем не менее, мы находим этот метод эффективным и полезным дляаденовирус модификации.

Третий полезный метод CuAAC недавно была разработана для работы под кислородом атмосферных условиях (рис. 2). 8 Этот метод имеет те же преимущества, что BDA-хелатных подход, но использует вместо THPTA как хелатообразователя для размещения атмосферного кислорода без окислительной деструкции подложки. Один маленький недостаток этого подхода является отсутствие в настоящее время коммерческая доступность THPTA, хотя прямой синтез этого хелатообразователя не поступало. 8 Хотя мы не проводили этот метод перевязки на нашей собственной системы, THPTA / CuAAC можно было бы ожидать для получения сопоставимых результаты BDA / CuAAC, с дополнительным удобством кислородом атмосферы терпимости.

Несмотря на умышленное развития этого протокола по продаже материалов, мы по-прежнему хотят признать преимущества в стоимости и повышение гибкости синтезаазидов и алкин зондов использовали здесь. Azidohomoalanine можно приготовить всего за три дня и значительно меньше, чем коммерческие источники. 6,12 сообщалось напряженной подготовки алкин труднее 11, но позволить себе большую свободу выбора датчика.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы хотели бы выразить благодарность NSF для финансирования (CBET-0846259).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene BCBC 391
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells ATCC CRL-1573
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Invitrogen 11965-092
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose Invitrogen 21013-024
Bovine Calf Serum Invitrogen 16170-078
Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) Invitrogen 15140-122
0.5% Trypsin-EDTA (10×) Invitrogen 15400-054
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene BD Falcon 353003
Cell culture CO2 incubator
Hemocytometer
Biosafety cabinet
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) VWR 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)
Avanti J-E centrifuge Beckman Coulter 369001
Conical tubes (50 ml, sterile) BD Falcon 352098
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman 344059
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor Beckman
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf 0030 121.589
Centrifuge 5418 Eppendorf 5418
Centri-Sep gel filtration spin columns Princeton Separations CS-901
Sterile needle, 18 gauge
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed)
Dewar flask
Liquid nitrogen
Electrophoresis cell
Fluorescent gel scanner
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1105
L-Azidohomoalanine AnaSpec 63669
Jena Biosciences CLK-AA005
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) Invitrogen C33365
Thermo Scientific 88905
Sigma-Aldrich A7480
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt MP Biomedicals 0215011201
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Methanol
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Disodium Phosphate (Na2HPO4)
Phosphate buffered saline (PBS)
1M HCl
Glycerol
Bovine Serum Albumin
L-cysteine
L-methionine
SDS (sodium dodecyl sulfate)
2-mercapt–thanol
Glycine
Bromophenol blue
Cesium Chloride (CsCl)
Copper(I) Bromide (CuBr)
Calcium Chloride (CaCl2)
Potassium Chloride (KCl)
Magnesium Chloride (MgCl2)
Sodium Chloride (NaCl)
Alkyne probe for CuAAC*
TAMRA Alkyne Invitrogen T10183
Strained alkyne probe for SPAAC*
TAMRA DIBO Alkyne Invitrogen C10410

* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
  2. Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
  3. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
  4. Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
  5. Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
  6. Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
  7. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
  8. Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
  9. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  10. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
  11. Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
  12. Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
Chemoselective Модификация поверхности с помощью вирусного Bioorthogonal химии нажмите
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).More

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter