אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדמיין אזורים של מות תאים מתוכן (PCD) בעוברי עכברים ומבדילים (ES) תרבויות תאי גזע עובריות באמצעות צבע מסיס מאוד בשם LysoTracker.
מות תאים מתוכן (PCD) מתרחש אצל מבוגרים כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמה נורמלית ובמהלך ההתפתחות עוברית לעצב רקמות ואיברים 1,2,6,7. במהלך פיתוח, כימיקלים רעילים או שינויים גנטיים יכולים לגרום לעלייה בPCD או לשנות דפוסי PCD כתוצאה מפרעות התפתחותיות ומומים מולדים 3-5. כדי להבין את האטיולוגיה של ליקויים אלה, המחקר של עוברים ניתן כהשלמה עם במבחני חוץ גופייה המשתמשים במיון תאי גזע עובריים (ES).
אפופטוזיס הוא צורה נחקרה היטב של PCD שכרוך הוא פנימי וחיצוני כדי להפעיל איתות מפל האנזים caspase. שינויים בתא אופייני כוללים blebbing קרום, התכווצות גרעינית, ופיצול ה-DNA. צורות אחרות של PCD אינן כרוכות בהפעלת caspase ועלולה להיות סוף התוצאה של autophagy הממושך. ללא קשר למסלול PCD, תאים מתים שיהיה צורך להסירו. אצל מבוגרים, התאים החיסוניים ביצועיםORM פונקציה זו, ואילו בעוברים, שבו המערכת החיסונית אינה מפותחת עדיין, ההסרה מתרחשת על ידי מנגנון חלופי. מנגנון זה כרוך תאים שכנים (נקרא "phagocytes לא מקצועי") לוקחים על phagocytic תפקידים שהם מכירים "לאכול אותי" אות על פני השטח של התא ולבלוע אותו 8-10 הגוססים. לאחר בליעה, הפסולת מובאת לlysosome לשפלה. לכן, ללא קשר למנגנון PCD, גידול בפעילות lysosomal יכול להיות מתואם עם מות תא מוגבר.
ללמוד PCD, assay פשוט לדמיין lysosomes ברקמות עבות ותרבויות מבדילות multilayer יכול להיות שימושי. צבע LysoTracker הוא מולקולה קטנה מסיסה מאוד שנשמרה בתאי subcellular חומציים כגון 11-13 lysosome. הצבע הוא נלקח על ידי דיפוזיה ודרך מחזור הדם. מאז חדירה היא לא מכשול, ויזואליזציה של ללמוד במכללת פרינסטון ברקמות עבות ותרבויות רבות שכבתיות הוא אפשרי 12,13 </sup>. לעומת זאת, ניתוח 14 Tunel (תיוג סוף transferase dUTP כינוי המסוף deoxynucleotidyl), מוגבל לדגימות קטנות, חתכים ההיסטולוגיים ותרבויות monolayer כי ההליך דורש כניסה / החדירות של מסוף transferase.
בניגוד לאנילין כחול, שמפזר ונמס בממסים, LysoTracker האדום DND-99 ניתן לתקן, בהיר ויציב. כתמים יכולים להיות דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal הסטנדרטי בכל הר-או סעיף באמצעות תקשורת מימית או ממס המבוסס על הרכבת 12,13. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות צבע זה להסתכל על ללמוד במכללת פרינסטון בעוברי עכברי null קיפוד קולי הרגיל ו. בנוסף, אנו מדגימים ניתוח של PCD במבדל תרבויות תאי גזע עוברי, ולהציג שיטת כימות פשוט. לסיכום, כתמי LysoTracker יכולים להיות רב כדי להשלים שיטות אחרות לאיתור PCD.
סימני היכר חשובים של אפופטוזיס כוללים זיהוי של ניזק לדנ"א עם assay Tunel, יחד עם זיהוי של פעילות caspase (מזוהה עם בז או מולקולה מחייבת כגון ZVAD-fmk), תצפית של שינויים תאיים, ומצגת של phosphatidylserine (PS ) על פני הקרום (זוהה על ידי Annexin V מחייב). יש כמה חסרונות בכל אחד מהמבחנים האלה. לדוגמה,…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי מריאני המעבדה לעזרת עריכת הפרוטוקול. עבודה זו מומנה על ידי מענק הדרכה CIRM דוקטורים (JLF), התמחות גשרי CIRM (TZTT), רוברט ומאי ר רייט קרן (FVM), ובאוניברסיטת הדרום קליפורניה (FVM).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |||||||||||||||
Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |||||||||||||||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |||||||||||||||
Vectashield | VECTOR | H-1200 | |||||||||||||||
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |||||||||||||||
Non-essential amino acids | Cellgro | 25-025-CI | |||||||||||||||
Sodium pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |||||||||||||||
FBS | Hyclone | SH30071.02 | |||||||||||||||
Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | |||||||||||||||
b-Mercaptoethanol, 50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |||||||||||||||
LabTek-II Chamber slides (8-well) |
Nalge Nunc International | 154534 | |||||||||||||||
0.1% Gelatin | Millipore | ES-006-B | |||||||||||||||
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |||||||||||||||
Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml:
WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media:
|