我々は、マウス胚とLysoTrackerと呼ばれる非常に水溶性染料を使用して差別化胚性幹(ES)細胞培養でプログラムされた細胞死(PCD)の領域を可視化するための単純なプロトコルを提示。
プログラム細胞死(PCD)は、通常の組織の恒常性を維持し、胎生発育中の組織や臓器1,2,6,7を形作るために成人に発生します。開発時には、有毒化学物質や遺伝子の変化は、PCDの増加の原因になったり、発育異常、先天性異常、結果3-5で、PCDのパターンを変更することができます。これらの欠陥の原因を理解するために、胚の研究は、胚性幹(ES)細胞を分化使用in vitroアッセイで補完することができます。
アポトーシスは、カスパーゼ酵素カスケードを活性化するシグナル伝達内因性及び外因性の両方が関与し、PCDのよく研究形態である。特徴的な細胞の変化は、膜ブレブ形成、核の縮小、およびDNA断片化が含まれています。 PCDの他の形態は、カスパーゼの活性化を伴わないと長引くオートファジーの最終結果かもしれません。かかわらず、PCD経路の、死細胞を除去することが必要。成人では、免疫細胞PERF胚では、免疫系がまだ発達していない場合には、除去、代替メカニズムによって発生している間は、この機能をORM。このメカニズムは、貪食役割彼らは瀕死細胞と巻き込むこと8月10日の表面に"私を食べて"信号を認識する上で取る隣接するセル(以下、 "非専門食細胞"と呼ばれる)が含まれます。貪食した後、破片が分解のためのリソソームに運ばれます。したがってかかわらずPCD機構は、リソソーム活性の上昇は、細胞死の増加と相関させることができる。
PCDは、厚い組織と多層差別の文化ではリソソームを可視化するための単純な検定を勉強しておくと便利です。 LysoTracker染料は、リソソーム11月13日のような酸性の細胞内区画内に保持される溶解性の高い小分子である。色素が拡散によって、循環を通じて取り上げられています。浸透は支障はないので、厚い組織と多層培養におけるPCDの可視化が可能である12,13 </>(商標)。手順は、端末のエントリ/透トランスフェラーゼを必要とするので、これとは対照的に、TUNEL(ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識)解析14は 、小さなサンプル、組織切片、及び単層培養に制限されています。
拡散し、溶剤によって溶解されるアニリンブルー、とは対照的に、LysoTrackerレッドDND-99は、修正可能な明るく、かつ安定しています。染色はホールマウントまたは水性または溶剤ベースマウントメディア12,13を使用して、セクション内の標準的な蛍光または共焦点顕微鏡を用いて可視化することができます。ここではノーマルとソニックヘッジホッグヌルのマウス胚でPCDを見て、この染料を使用してプロトコルを記述。加えて、我々はES細胞培養物の区別にPCDの分析を示し、単純な定量化法を提案する。要約すると、LysoTracker染色は、PCDを検出する他の方法に大きな補完することができます。
アポトーシスの重要な特徴は、カスパーゼ活性の検出と共にTUNELアッセイによるDNA損傷、(例えばZVAD-FMKとしてmAbまたは結合分子で検出)の検出、細胞の変化を観察し、ホスファチジルセリン(PSのプレゼンテーションを含める膜表面上)(アネキシンV結合によって検出された)。これらのアッセイのそれぞれのいくつかの欠点があります。例えば、TUNELアッセイで使用されるターミナルトラ?…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、プロトコルを編集助けマリアーニ研究室のメンバーに感謝。この作品はCIRMポスドクトレーニンググラント(JLF)、CIRM BRIDGESのインターンシップ(TZTT)、ロバート·Eと5月R.ライト財団(FVM)と、南カリフォルニア大学(FVM)によって賄われていた。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |||||||||||||||
Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |||||||||||||||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |||||||||||||||
Vectashield | VECTOR | H-1200 | |||||||||||||||
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |||||||||||||||
Non-essential amino acids | Cellgro | 25-025-CI | |||||||||||||||
Sodium pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |||||||||||||||
FBS | Hyclone | SH30071.02 | |||||||||||||||
Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | |||||||||||||||
b-Mercaptoethanol, 50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |||||||||||||||
LabTek-II Chamber slides (8-well) |
Nalge Nunc International | 154534 | |||||||||||||||
0.1% Gelatin | Millipore | ES-006-B | |||||||||||||||
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |||||||||||||||
Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml:
WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media:
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