Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Summary

Las mediciones de la KV7 (KCNQ) la actividad del canal de potasio en los miocitos aislados arteriales (patch clamp utilizando técnicas electrofisiológicas) en paralelo con las medidas de respuesta constrictor / dilatador (utilizando miografía presión) puede revelar información importante acerca de las funciones de los canales KV7 en la fisiología del músculo liso vascular y farmacología.

Abstract

Contracción o la relajación de las células musculares lisas en las paredes de las arterias de resistencia determina el diámetro de la arteria y de ese modo controla el flujo de sangre a través del vaso y contribuye a la presión arterial sistémica. El proceso de contracción está regulada principalmente por la concentración de calcio citosólico ([Ca ^{2 +]} _cyt), que es a su vez controlada por una variedad de transportadores de iones y canales. Los canales iónicos son productos intermedios comunes en las vías de transducción de señales activadas por hormonas vasoactivas para efectuar la vasoconstricción o vasodilatación. Y los canales iónicos son a menudo blanco de los agentes terapéuticos de forma deliberada (por ejemplo, los bloqueadores de los canales de calcio utilizado para inducir la vasodilatación y la presión arterial) o involuntariamente (por ejemplo, para inducir efectos no deseados secundarios cardiovasculares).

KV7 (KCNQ) activados por voltaje canales de potasio han sido recientemente implicados como targ importante fisiológico y terapéuticoets para la regulación de la contracción del músculo liso. Para dilucidar el papel específico de KV7 canales tanto en la transducción de señales fisiológicas y en las acciones de los agentes terapéuticos, tenemos que estudiar cómo su actividad se modula a nivel celular, así como evaluar su contribución en el contexto de la arteria intacta.

Las arterias mesentéricas de rata proporcionan un sistema modelo útil. Las arterias pueden ser fácilmente diseccionada, limpian de tejido conectivo, y utilizarse para preparar los miocitos aislados arteriales para patch clamp electrofisiología, o una cánula y se presuriza para mediciones de las respuestas vasoconstrictoras / vasodilatador en condiciones relativamente fisiológicas. Aquí se describen los métodos utilizados para ambos tipos de mediciones y proporcionan algunos ejemplos de cómo el diseño experimental se pueden integrar para proporcionar una comprensión más clara de las funciones de estos canales de iones en la regulación del tono vascular.

Protocol

1. La escisión quirúrgica de la pequeña arcada vascular mesentérica Intestinal

1. Anestesiar a un 300-400 g rata Sprague-Dawley con isoflurano (4%) administrado por inhalación.
2. Lleve a cabo una laparotomía media para exponer el mesenterio del intestino delgado. Exteriorizar el intestino delgado y grueso a través de la incisión abdominal con gran cuidado para evitar el trauma en el intestino y el mesenterio expuesto. Suavemente avivar el mesenterio a lo largo de gasa estéril.
3. Quirúrgicamente extirpar el intestino delgado y una porción del intestino grueso, incluyendo el ciego (vasos sanguíneos cuidadosamente cortados a lo largo de los márgenes y en los orígenes de las ramas principales de la arteria mesentérica superior / vena).
4. Transferir el tejido extirpado a un vaso de precipitados que contiene hielo frío solución de disección (Tabla 1).
5. Tras la extirpación del intestino, la rata se sacrificaron humanitariamente mientras está bajo anestesia.

2. Disección de und Servicio de limpieza de las arterias

1. Transferir el intestino extirpado y arcada mesentérica a una cámara refrigerada de disección (4-5 ° C) que contenía solución de disección. La cámara consta de un plato de 100-mm Petri de vidrio con una base de elastómero SYLGARD 184 para dar cabida a los pins de disección; la placa de Petri se coloca en una base refrigerada que se mantiene a 4-5 ° C por un baño de agua circulante.
2. Con unas tijeras quirúrgicas cortar un segmento de aproximadamente 10-12 cm de todo el intestino. Cortar en cada extremo del segmento intestinal, manteniendo su vasculatura adjunta, y luego quitar el intestino no utilizado de la cámara dejando el segmento uno con su vasculatura adjunto (arcade mesentérica) en aislamiento.
3. Precisar el segmento de intestino delgado, la difusión del mesenterio sobre el lado cercano de la cámara de tal manera que la rama principal de la arteria mesentérica superior / vena está en el centro y las órdenes subsiguientes de irradiar ramas del centro (Figura 1). Pl as los pins solamente en los segmentos intestinales (no en los vasos sanguíneos).
4. Distinguir arterias de venas por su color rojo relativamente brillante, paredes gruesas y característicos ramas en forma de V, en lugar de las ramas en forma de U visto en las venas.
5. Visualización a través de un microscopio de disección sistema de iluminación, cuidadosamente borrar el tejido adiposo y el tejido conectivo que rodea el ^nd 2 a 4 ^º orden arterias cerca de los intestinos (círculo de trazos en la Figura 1) utilizando fórceps y tijeras micro. Sujetando las venas adyacentes facilita la limpieza del tejido adiposo y tejido conectivo. Evitar el estiramiento innecesario de las arterias.
6. Segmentos de la arteria mesentérica despejadas de tejido conectivo puede ser disecados y se utiliza para el aislamiento de células (por una sola célula de estudios patch clamp, Secciones 3-4) o canula para miografía presión (Sección 5). Cortar los segmentos entre los puntos de ramificación, por lo general de hasta 1 cm de longitud.

jove_title "> 3. celda de aislamiento de Estudios de patch clamp

1. Preparar 0,5 L de solución de aislamiento (Tabla 1) y se divide en 2 porciones antes de ajustar el pH. La primera porción (normalmente 100 ml) se calentó a 37 ° C y pH debe ser ajustado a 7,2 a 37 ° C (37 ° C Solución de aislamiento). La segunda porción de la solución de aislamiento debe ser enfriado a 4 ° C y el pH se ajustó a 7,2 a 4 º C (solución de hielo aislamiento frío). Después de ajustar el pH, la osmolaridad de ambas soluciones debe ser ajustado a 298 mOsm mediante la adición de una cantidad apropiada de D-glucosa o H ₂ O.
2. Transferir 2 ml de 37 ° C la solución de aislamiento a un vial de vidrio y se incuba a 37 ° C para su uso en el paso 3,4. Añadir 20 mg de albúmina de suero bovino (BSA) a 10 ml de 37 ° C solución de aislamiento, disolver, volver a calentar a 37 ° C y reajustar el pH a 7,2. A 2 ml de esta solución, agregar 4 mg de colagenasa de tipo VIII (Sigma, Lote 089K8612: 633 uliendres / mg de actividad de colagenasa, 285 unidades / mg de actividad Caseinase, 1,6 unidades / mg de actividad clostripaína), 0,64 mg de elastasa tipo IV (Sigma, Lote 110M7025V 5,9 unidades / mg; añadir 40 l de una 16 mg / ml de solución madre preparada en 37 ° Solución C) Aislamiento y 2 l de 1 M DL-ditiotreitol (DTT Sigma); precalentar esta solución enzimática a 37 ° C en la preparación para el paso 3,5.
3. Transferir 2-3 segmentos de la arteria mesentérica en una placa de cultivo tisular de 35-mm de cultivo que contiene 2 ml de solución de aislamiento enfriado con hielo y colocar la cápsula en hielo. Cortar los segmentos de la arteria mesentérica en 3-4 mm de largo piezas.
4. Utilizando una pipeta Pasteur con punta pulida al fuego (para evitar daños de las arterias) transferir los segmentos arteriales en un vial de vidrio (15 x 45 mm, 1 dram) que contiene 2 ml pre-calentado 37 ° C solución de aislamiento y se incuba durante 30 min a 37 ° C.
5. Después de 30 min, aspirar con cuidado la solución de aislamiento de 37 ° C utilizando una pipeta Pasteur, añadir 2 ml de solución de enzima caliente y se incuba durante 35 mina 37 ° C.
6. Inmediatamente después de la incubación de 35 min en la solución de enzima, colocar el vial en hielo, se aspira la solución de enzima y añadir 2 ml de solución de aislamiento enfriado con hielo (aspiración de la repetición y la adición de solución de aislamiento fresca fría como el hielo 4 veces). Entonces, en un volumen de 1 ml de solución de aislamiento de hielo frío, se tritura suavemente con los segmentos arteriales pipeta Pasteur pulida 10-20 veces para liberar las células individuales de la arteria mesentérica de músculo liso (MASMCs).
7. Periódicamente verifique apariencia miocitos colocando una gota de la suspensión de células en un plato de 35-mm y visualización bajo un microscopio. MASMCs sanos deben tener una apariencia alargada suave. No todas las células de la pared arterial se dará a conocer. La suspensión celular se mantuvo en hielo.
8. Otro indicador útil de la salud MASMC es su tolerancia fisiológica de las concentraciones de Ca ^{2 +.} Llene la cámara de grabación (Herramientas Bioscience, # CSC-25L) con baño slución que contiene 2 mM CaCl ₂ (pH 7,3 a temperatura ambiente (RT), para la composición véase la Tabla 1) y la posición de puente agar (vidrio doblado capilar lleno con 2% de agar en 2 M de KCl, se inserta en el electrodo de referencia (Warner Instrument, REF -3L)) dentro de la cámara. Usando el pulido pipeta Pasteur, se transfieren unos 100-200 l suspensión de células a una cámara de registro y permitir que las células se adhieran durante 15 min. Células en buen estado no debe contratar de manera significativa en el 2 mM _CaCl2 solución que contiene (células deben parecer alargado o forma de barra, no redondeado en bolas).
9. Después de la adición de la primera parte alícuota de la suspensión celular a la cámara de registro, 0,25 ml de solución de baño que contenía 2 mM CaCl _2, debe añadirse a que el volumen restante de la suspensión celular. Esta suspensión celular restante se puede mantener en esta solución en hielo y utilizarse para la grabación de patch clamp para hasta 6 hr.

4.El uso de Patch Clamp Whole Cell para medir KV7 corrientes de potasio o de membrana de tensión

1. Después de miocitos se adhieren a la base de vidrio de la cámara de grabación (25-mm No. 1 cubreobjetos redondo, Warner Instruments), iniciar la perfusión continua de la solución del baño (Tabla 1). Para la grabación de KV7 corrientes en forma aislada de las corrientes de retraso rectificador de potasio de KV1 y KV2 familias, la solución del baño debe ser complementado con 100 mM GdCl _3.
2. Fabricar un parche pipeta de vidrio de borosilicato (Kimax-51, Kimble Chase) usando un extractor de pipeta y microforge; su resistencia debe ser 4-5 mW cuando se llena con solución interna (tabla 1). El pelaje. ^_1/3 inferior de la pipeta (~ 1-2 mm por encima de la punta) con 184 SYLGARD
3. Para la grabación de KV7 corrientes en MASMCs, el parche perforada del mismo voltaje de la célula técnica de la pinza debe ser utilizado. Uso de una configuración de parche perforado ayuda a prevenir depletion de la membrana fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP ₂₎ y posterior rápido (a menos de 5 min) resumen de los KV7 corrientes, que es comúnmente observados con la configuración convencional parche roto. Suplemento de la solución interna (Tabla 1) con 120 mg / ml de anfotericina B: añadir 3 l de 2 mg / ml de anfotericina B (preparado en DMSO y se mantuvieron congelados en pequeñas partes alícuotas y protegido de la luz) a 0,5 ml de solución interna. Llenar la punta de la pipeta de parche con anfotericina B libre de solución interna por inmersión de la punta de la pipeta en la anfotericina B libre de solución interna y después de aplicar el vacío en el otro extremo utilizando una jeringa de 10 ml unido a través de un trozo de tubo (Tygon R- 3603). Añadir anfotericina B que contiene solución de la pipeta desde la parte superior utilizando una punta de pipeta Eppendorf Microloader hasta que la pipeta es de aproximadamente medio lleno con solución. Eliminar las burbujas de aire golpeando suavemente la pipeta. Use la pipeta de inmediato.
4. Inserte la pipeta enpara el soporte del electrodo y usar un micromanipulador para bajar la pipeta a la superficie de un miocito alargado (cerca de, pero no en la parte superior del núcleo, Figura 2). Cuando la resistencia de la pipeta aumenta a 6-10 mW, aplicar el vacío para lograr una giga-sello (> 10 GΩ).
5. Establecer la celebración de voltaje a 0 mV a la espera de perforación de la membrana. Aplicar etapas de voltaje de 100 ms a +10 mV y después a -10 mV, y utilizar el amplificador para compensar los transitorios rápidos de capacitancia de pipeta. Coincidió con la aparición de los transitorios de células enteras de capacitancia, pequeñas corrientes positiva sostenida (por lo general 2-10 pA) indicará la presencia de canales funcionales KV7.
6. Perforación con éxito con anfotericina B se reduce la resistencia acceso a 35 MW o menos. Grabación actual puede ser iniciado mediante un voltaje de 5 seg protocolo de paso de la tensión de -4 explotación mV. Usamos la tensión mV -4 sostiene para alcanzar cerca de inactivación máxima de otros tipos de rec retardadatifier corrientes de potasio (mediadas predominantemente por KV1 y KV2 canales) que de otro modo contaminar el registro de los relativamente pequeños no inactivante KV7 corrientes. El tiempo (5 segundos) protocolo de paso de voltaje es necesario para alcanzar el estado de equilibrio de activación KV7 canales, que exhiben lenta dependiente de la tensión de activación y desactivación. Los KV7 corrientes no inactivan durante las etapas de voltaje de sostenidos.
7. Para grabar la KV7 de corriente-tensión (IV) relación, se aplican 5 pasos de voltaje seg a voltajes que van desde -84 mV, en la que la probabilidad de apertura de canales KV7 es mínimo, a +16 mV en el que la probabilidad de apertura de canales KV7 alcanza un meseta, después de 5 segundos en cada voltaje de prueba, un paso atrás para la celebración de voltaje (mV -4) durante 10 segundos. Tomará aproximadamente 3,5 min para toda la serie de pulsos de prueba (Figura 3A). Realizar 2-3 de control de grabaciones IV para asegurar que las corrientes registradas son estables en el tiempo. Parcela promedio final pulso corrientes (promediocorrientes registradas para el último 1 seg) frente a la tensión para crear una curva IV (Figura 3D). Las curvas de control IV deben ser aproximadamente superpuesta, si las corrientes son estables.
8. Antes de aplicar cualquier agente farmacológico iniciar un protocolo de evolución en el tiempo destinado a grabar de forma continua corriente a -20 mV. Asegurar una grabación estable de la corriente durante al menos 5 min antes de la aplicación del fármaco. Aplicar los agentes farmacológicos para 5-15 min o hasta un estado de equilibrio se alcanza (Figura 3C); luego terminar el protocolo de transcurso de tiempo y registro de dos curvas IV utilizando el protocolo de voltaje a paso. Lavado con el fármaco y registrar el curso del tiempo de lavado de fármaco, seguido por la grabación de otros dos curvas IV.
9. Al final del experimento se aplican linopirdine 10 mM o 10 mM XE991, inhibidores irreversibles de KV7 canales; estos fármacos deben inhibir completamente las corrientes registradas en los voltajes negativos a -20 mV (Figura 3D).

5. El uso de segmentos de la arteria intacta para miografía presión

1. Un sistema de miografía presión adquirido de Tecnología Danés Myo (DMT A / S, Dinamarca, modelo 110P) se utilizó para el experimento miografía de presión. Montar el segmento de la arteria en la cámara de acero inoxidable mediante la inserción de la cánula fijada horizontalmente vidrio izquierda en un extremo y la cánula movible de cristal a la derecha en el otro extremo. Dos transductores de presión (P1 a la derecha y P2 en el lado izquierdo) están integradas para controlar la presión dentro del lumen de la arteria. El fluido procedente de la cánula de vidrio derecha se utiliza para ajustar la presión dentro de la arteria para su nivel fisiológico aproximada. Para empezar, antes de llenar una jeringa de 10 ml abierta (que sirve como una columna de gravedad de la presión de alimentación), con solución lumen (Tabla 1). Levante la jeringa para empujar solucionesción a través de tubo de polietileno en la cánula de vidrio derecha, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire en el tubo o cánula. La cánula izquierda debe ser llenado previamente con solución lumen a través de una jeringa de 1 ml. Llenar la cámara de presión myograph con 10 ml de la solución del baño buque (Tabla 1). Libremente suspender dos pre-hechos suturas de nylon finas en cada lado adyacente a la cánula de vidrio.
2. Transferir cuidadosamente el segmento de la arteria mesentérica disecados (por lo general un segmento ^ª 3 ^ª o 4 orden, alrededor de 200 a 350 micras de diámetro; de paso 2,6) de la cámara de disección a la cámara de presión myograph aferrándose a un extremo del segmento usando micro fórceps.
3. Visualización a través de un microscopio de disección sistema de iluminación, mantener un extremo del segmento de la arteria y que se deslice suavemente sobre la cánula de vidrio izquierda y asegurar el extremo usando las suturas de nylon. Enjuague suavemente el fluido del lumen a través del recipiente montado para eliminar la sangre y los residuos dentro de la vasija.La válvula para la jeringa izquierda entonces se debe cerrar de manera que este lado presenta una columna estática de fluido en contra de la cual se ajusta la presión desde el lado derecho.
4. Uso del micromanipulador, la posición de la cánula de vidrio movible derecha más cerca del segmento de la arteria y tire del extremo derecho del segmento sobre ella, finalmente fijándola con las suturas de nylon. Clip de los hilos de sutura en exceso.
5. Monte la unidad myograph presión en el escenario sobre el microscopio myograph presión. Coloque la tapa sobre la cámara myograph presión. La cubierta de la cámara de entrada contiene la superfusión y la tubería de aspiración unida a él. Conectar la entrada de superfusión a un colector para permitir superfusión de baño a temperatura ambiente o 60 mM KCl solución en la cámara de presión de miografía por gravedad. Las sustancias de ensayo, tales como fármacos u hormonas que se encuentran en las mediciones de patch clamp para afectar a la función del canal KV7, generalmente se aplican directamente a la solución del baño, no a través del baño de superfusion o en la solución de lumen. La superfusión de solución de baño se utiliza para lavar la solución de KCl. Acople el tubo de aspiración a un sistema de vacío para eliminar el exceso de superfusato. Insertar el sensor de temperatura en la solución del baño a través de la abertura provista en la tapa de la cámara miógrafo.
6. Conectar la unidad de miografía presión al sistema de myo-interfaz, el hardware que permite la comunicación de la unidad de miografía para el software Myoview (DMT).
7. Abra el software Myoview en el ordenador. En la ventana de parámetros, ajuste la temperatura deseada de 35 ° C, con una tolerancia de temperatura de 1 ° C, la presión de entrada como objetivo 80 mm Hg y la presión de salida del objetivo en un 80 mmHg. Cargar el archivo de calibración y calibrar el diámetro de la vasija exterior, de manera que los cambios en el diámetro de la arteria se registran con precisión en micras. Ajustar el contraste según sea necesario para permitir una buena vista del segmento montado contra el fondo. Una descripción detallada de cómo utilizar el softwarese proporciona en el manual de usuario de DMT.
8. Gradualmente aumentar la jeringa 10 ml (que sirve como una columna de gravedad de la presión de alimentación) durante un período de 15 min hasta que el transductor de presión P1 lee 80 mmHg. Mientras se eleva la columna de presión, verifique que no haya fugas en el depósito. Si hay alguna fuga, deseche el segmento y montar otro segmento de la arteria (repetir pasos de 5,2). Ajustar la distancia entre las cánulas cuando sea necesario. La distancia debe ser ajustada de tal manera que el segmento de la arteria a presión es aproximadamente recta (pero no estirado) y forma un hombro como patrón donde los lazos están hechos (Figura 4A).
9. Encender la calefacción de la cámara de myograph presión a través de los controles en el sistema de myo-interfaz. Permitir que la solución del baño para calentar gradualmente hasta que llega a 36-37 ° C.
10. Usa los ajustes XYZ del objetivo en el microscopio DMT cuando sea necesario para mantener el vaso en el enfoque y facilitar el seguimiento preciso de la changes de diámetro recipiente exterior.
11. Comprobar la viabilidad del recipiente montado por superfusión transitoria (~ 30 seg) con KCl 60 mM. Un recipiente viable contrae rápidamente con la adición de KCl y dilata inmediatamente después de lavado de la mM KCl 60 (superfuse aproximadamente 60 ml de solución de baño para lavar el KCl). Después de esta prueba, vuelva a ajustar el volumen de la solución del baño a exactamente 10 ml. La temperatura del baño se reduce durante la prueba de KCl y de lavado debido a que estas soluciones son a temperatura ambiente, pero el calentador cámara restaurará la temperatura a 36-37 ° C en unos pocos minutos.
12. Permitir la arteria que se equilibre durante al menos 30 min (el diámetro debe ser estable durante al menos los últimos 10 minutos de este período). Añadir la sustancia de ensayo concentrado a la solución del baño y pipetear directamente hacia atrás y adelante suavemente alrededor de los bordes de la cámara para mezclar la sustancia de ensayo en la solución del baño, obteniéndose la concentración final apropiada en el volumen de la cámara 10 ml. Chanbios en el recipiente de adición siguiente diámetro de sustancia de ensayo (s) se puede controlar en la imagen de vídeo en vivo y también trazado en la ventana de análisis de la imagen, mientras que el experimento está en curso.
13. Después de la terminación del experimento, los datos almacenados (*. Myo) archivo se puede abrir como un archivo de hoja de cálculo para su posterior análisis.

6. Los resultados representativos

Los resultados mostrados en la Figura 3 ilustran grabaciones típicas de KV7 corrientes de miocitos arteria mesentérica utilizando un protocolo de paso de tensión antes (Figura 3A, B trazos negros) y durante el tratamiento con un activador del canal de Zn KV7 piritiona (ZnPyr, 100 nM; Figura 3A, B huellas rojas). Similares datos de paso de voltaje de 3 células fueron promediados para preparar las corriente-voltaje (IV) parcelas se muestra en la figura 3D. Un curso de tiempo representativo de la mejora de la amplitud de corriente (medido por abrazadera continua de voltaje a -20 mV) during tratamiento con 100 nM Zn piritiona se muestra en la Figura 3C Figura 4B ilustra el curso de tiempo del efecto de ZnPyr en diámetro arteria mesentérica exterior medido utilizando miografía de presión;. el recipiente estaba pre-constreñida con 100 pM arginina vasopresina (AVP) antes Además de ZnPyr 100 nM. Promediados datos dosis-respuesta para ZnPyr inducida por dilatación de la arteria mesentérica se muestran en la Figura 4C.

Figura 1. Fotografía de una arcada mesentérica en la cámara de disección.

Figura 2. Fotografía de un miocito con una pipeta de parche en su superficie.

Figura 3. Originales rastros de KV7 corrientes, campo de tiempo de los medicamentos de aplicación, IV curvas. A. Familia de secuenciales trazas de corriente (panel inferior) registradas en respuesta a pasos de voltaje (panel superior) antes del tratamiento (control, negro) y la estabilización siguiente en presencia de 100 nM ZnPyr (rojo) en una sola MASMC. B. representativa de la corriente de trazas A (como se indica por puntas de flecha) para el control (negro) y 100 nM para ZnPyr (rojo). Las barras grises indican intervalo de tiempo en el promedio de amplitudes de corriente se realizaron mediciones de corriente-voltaje (IV) parcelas. Tensiones de paso se indica a la derecha por puntas de flecha. Por supuesto C. Tiempo de KV7 mejora actual por ZnPyr 100 nm medido con pinza de tensión continua a -20 mV (bar). D. medio curvas IV (n = 3) derivada de KV7 densidades de corriente registrada antes (control, círculos llenos), durante el tratamiento con nM ZnPyr 100 (círculos abiertos), y durante el tratamiento con 10 mM XE991 (triángulos rellenos). No específicos corrientes de fuga se restaron como se describe por Passmore et al. ^1.

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Figura 4. ZnPyr relajación inducida de una arteria mesentérica pre-constreñida con AVP 100 pM. Fotografía de A. de la arteria mesentérica montado en el myograph presión puesta a punto. B. Transcurso de tiempo de cambios en el diámetro exterior del recipiente en respuesta a la aplicación de 100 pM AVP (barra abierta) seguido de la aplicación de la ZnPyr 100 nM (barra rellena). C. El gráfico de barras que resume los resultados de 100 Nm ZnPyr inducida vasodilaion.

Discussion

Los métodos y enfoques experimentales descritas aquí son muy resistentes y pueden producir resultados claros y reproducible cuando se aplica con una atención meticulosa a los detalles. Buenos registros electrofisiológicos y de la constricción / dilatación de los segmentos arteriales dependen de la salud de las células y los segmentos de la arteria, respectivamente. Preparaciones de células puede variar de día a día, incluso usando el mismo protocolo. Soluciones de aislamiento se puede utilizar para un máximo de 2 semanas, pero si la calidad de la preparación celular es baja en dos días consiguientes nuevas Soluciones de aislamiento debe estar preparado. Hemos encontrado que la actividad de las enzimas variar de lote a lote condiciones de aislamiento y por lo tanto (los tiempos de incubación y las concentraciones de enzimas) requieren optimización con cada nuevo lote de enzimas. Se ha encontrado también que el protocolo de aislamiento de células descrito aquí para la arteria mesentérica de rata no es óptimo para otros lechos vasculares u otras especies, que pueden tener una combinación diferente o densdad de componentes de matriz extracelular. Cada preparación vascular requiere su propia optimización para identificar las condiciones que producen las células sanas. Los criterios que nos parecen más útiles en la identificación de las células sanas son: 1) la morfología celular: aspecto liso y alargado, estrecho pero un poco después de triturar los segmentos de MA en la solución de aislamiento que contiene 50 mM Ca ^{2 +,} y conservando la misma apariencia que cuando se transfiere a 2 mM Ca ^{2 +-que} contiene la solución externa. No todas las células mantengan su forma casi completamente relajada alargado, pero sólo los miocitos casi completamente relajado se debe utilizar para el registro electrofisiológico; 2) Las células deben ser ópticamente denso, lo que indica una membrana intacto no lesionado; 3) tensiones de la membrana en reposo de los miocitos sanos utiliza para corrientes de registro de potasio o para grabaciones de corriente-clamp de voltaje de la membrana debe ser más negativo que mV -40 (normalmente en el intervalo de -45 mV a -56 mV en las condiciones iónicas described en el protocolo aquí).

Para asegurar el éxito registros electrofisiológicos, la solución del baño y la solución de la pipeta (para la composición véase la Tabla 1) se preparó en el día del experimento. Es crucial para ajustar la osmolalidad de las soluciones internas y baño para ser idéntico (298 a 299 mOsm).

Isobáricas mediciones de la función arterial realizadas en arterias pequeñas (<500 micras) utilizando miografía presión se aproximan más a las condiciones fisiológicas de hacer mediciones de fuerza isométrica realiza mediante un cable myograph. Los vasos en un miógrafo de presión son típicamente más sensibles a los agonistas vasoconstrictores ^2-4, más estrechamente de aproximación de las sensibilidades medidos in vivo ^{5, 6.} El aumento de la sensibilidad a concentraciones bajas de agonistas ha permitido la identificación de los mecanismos de transducción de señales inducida por concentraciones picomolares fisiológicamente relevantes de la AVP^{7, 8.}

Miografía de presión mantiene la geometría del recipiente y mantiene la integridad del endotelio. Endotelio mediadas por efectos de los fármacos se pueden distinguir de músculo liso mediada por efectos mediante la realización de mediciones paralelas en los vasos intactos y endotelio ^denudado-9. La alteración intencional del endotelio se puede lograr físicamente dañar el endotelio (por ejemplo, pasando un cabello humano atrás y hacia adelante a través del lumen) o por perfusión de aire a través del lumen de la arteria. La pérdida de la función endotelial (pero la función del músculo liso no vascular) debe ser confirmado mediante la medición de una reducida endotelio mediada por la respuesta vasodilatadora a la acetilcolina en los vasos pre-constricción con un agonista ^9.

Mediciones paralelas de corrientes iónicas / voltaje de la membrana de los miocitos arteria mesentérica mediante técnicas de patch clamp y constricción arterial / dilatación de arteri mesentéricaES utilizando miografía de presión puede permitir elucidación de los papeles de los canales iónicos específicos en ambas cascadas de transducción de señales fisiológicas y en las acciones de los agentes terapéuticos. Los tratamientos dirigidos a clases específicas de canales de iones específicos o productos intermedios de transducción de señales se puede aplicar de forma aditiva o en secuencia para proporcionar información mecanicista sobre las funciones de estos canales en la regulación de la función de miocitos en el nivel celular y en la constricción / dilatación de las arterias intactas. Resultados convergentes de tratamientos que aumentan o inhiben ciertos tipos de corrientes iónicas con los efectos correspondientes sobre el diámetro de la arteria proporcionar interpretaciones más fiables que se pueden obtener utilizando cualquiera de los métodos de por sí. Idealmente, la concentración de la dependencia de los agentes bajo estudio debe ser determinado en ambos sistemas. Para evaluar la relevancia fisiológica o terapéutica, las concentraciones ensayadas debe estar relacionado con las concentraciones medidas en el entorno fisiológico or consigue con terapias clínicas. Ejemplos de estos tipos de enfoques experimentales se pueden encontrar en nuestras publicaciones anteriores ^8-10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
*11
Table 1. Components of solutions used in the experiment.