Summary
No patch situ gravações de fixação são usados para a caracterização eletrofisiológica dos neurônios no circuito intacto. No modelo genético Drosophila patch clamping é difícil, porque o SNC é pequeno e está rodeado por uma bainha robusto. Este artigo descreve o procedimento para remover os neurônios bainha e limpa para gravações posteriores braçadeira de patches.
Abstract
Tempos de geração curtos e fáceis técnicas genéticas fazer a mosca da fruta Drosophila melanogaster um modelo excelente genética na pesquisa em neurociência fundamental. Canais iônicos são a base de todo o comportamento uma vez que medeiam a excitabilidade neuronal. O primeiro canal de iões de tensão gated clonado era a tensão Drosophila canal de potássio gated Shaker 1,2. Para a compreensão do papel dos canais iônicos e excitabilidade de membrana para a função do sistema nervoso é útil para combinar poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila em gravações com braçadeira situ patch. Durante muitos anos, tais gravações foram dificultados pelo pequeno tamanho do CNS de Drosophila. Além disso, uma bainha resistente feita de colagénio e células gliais constituído obstáculos para o acesso à @ patch pipette @ neurónios centrais. A remoção desse revestimento é uma condição necessária para gravações de patch clamp de qualquer neurônio no SNC adultos de Drosophila. Nos últimos anosos cientistas foram capazes de conduzir em gravações de fixação in situ de patch de neurônios no cérebro adulto 3,4 e cordão nervoso ventral embrionário 5,6, 7,8,9,10 larval e adulto Drosophila 11,12,13,14. Um estábulo giga-seal é a principal condição prévia para um bom patch e depende de contacto perfeito da pipeta remendo com a membrana celular a fim de evitar as correntes de fuga. Portanto, para a célula inteira em gravações de patch situ braçadeira de neurônios adultos de Drosophila deve ser bem limpo. No primeiro passo, a bainha ganglionar tem de ser tratado enzimaticamente e removido mecanicamente para tornar as células alvo acessíveis. No segundo passo, a membrana da célula tem de ser polida, de modo que nenhuma camada de material de colagénio glia, ou outro pode perturbar giga-seal formação. Este artigo descreve como preparar um neurônio central identificada no cordão nervoso ventral Drosophila, o motoneurônio vôo 5 (MN5 15), para todo c somáticaell gravações patch clamp. Identificação e visibilidade do neurónio é alcançado através da expressão da GFP específica de MN5. Nós não têm o objetivo de explicar a técnica patch clamp si.
Protocol
A descrição que se segue não é específica para um motoneurónio. Ele pode ser usado com qualquer neurónio. Neste exemplo, usamos o vôo motoneurônio 5 (MN5) que inerva as duas fibras do músculo dorsalmost ala dorsolongitudinal depressor (DLM). Para identificar e visualizar MN5 usamos o sistema UAS/GAL4 para expressar GFP nos motoneurônios voo (e alguns outros neurônios).
1. Dissecção de Adultos Drosophila para acessar a parte dorsal da medula nervosa ventral (VNC)
- Dissecar um lado Drosophila adulta dorsal para cima ao longo da sua linha média dorsal, em uma placa de Petri Sylgard revestida (35 mm de diâmetro), como descrito em Ryglewski e Duch (2009 13). Um filme deste dissecção está disponível online através de Jove (Boerner e Godenschwege 16. Abaixo está uma breve descrição da dissecção.
- Moscas adultas são anestesiados por arrefecimento em gelo durante cerca de 1 min. Isto pode ser conseguido através de pré-arrefecimento frasco mosca um vazio (sem comida)em gelo e colocando a mosca no frasco já fria. Asas e pernas são removidos com um par de tesouras.
- A mosca é então fixado lado dorsal para cima numa placa de Petri revestidas Sylgard (usamos a tampa de uma placa de Petri 35 milímetros cheia até a borda com Sylgard; Figuras 1A, B) com um anel de plástico (diâmetro interno de 9 mm, 1,3 milímetros de espessura ) colada à Sylgard com petrolato.
- O uso da tampa de uma placa de Petri 35 milímetros facilita o acesso ao VNC com uma pipeta de adesivo sob visualização com uma objectiva de imersão de água. Isto ajuda a introduzir a pipeta superficialmente sem tocar na parede do recipiente.
- O anel de plástico pode ser feita por perfuração de um furo para uma folha de plástico fino (utilizamos 1,3 mm de espessura). Usamos um cortador de fio para definir o perímetro externo do anel de modo que se encaixa no prato.
- Submergir a mosca em solução salina normal (Figura 1C, a composição de uma solução salina em mM: NaCl 128, KCl 2, CaCl 2 1,8, MgCl2 4, 5 HEPES, 35 sacarose ~ depending sobre a osmolalidade da solução, o pH é ajustado a 7,25 com NaOH 1 M, a osmolalidade é ajustada a 290 mOsm com a sacarose).
- O animal é dissecado ao longo da linha média dorsal, e os grandes músculos de vôo dorsais longitudinais são esticados lateralmente e preso para expor intestino, esôfago e os debaixo VNC. Após a remoção do intestino e o esófago, o VNC é exposto (Figura 1D).
- Opcionalmente, pode ser rapidamente decapitou nesta etapa (Figura 1E). Remoção da cabeça faz o acesso com a enzima e pipetas de patch mais conveniente, e MN5 dendritos não são perturbados quando limpar a soma (dendritos são posterior à soma, Figuras 2B, C). No entanto, a cabeça também pode ser deixada intacta, se exigido pelo projeto experimental (por exemplo, o estudo de descer de entrada para motoneurônios torácicas). Neste caso, a pipeta pode ser introduzido a partir de posterior ou lateral (Figura, lateral 2A).
- Para rápidatroca salina durante as experiências o volume da câmara de gravação é minimizada colocando um anel de plástico (diâmetro interno 9 mm) em torno do animal dissecado e colando-o para o recipiente com o petrolato (Figuras 1A, B, o volume da câmara de gravação é ~ pi 200) .
- A preparação é em seguida montado sobre um microscópio de fluorescência fixo fase vertical (usamos Zeiss Axioskop 2 FS plus, Zeiss, Alemanha), e visualizadas com um NA elevado (> 0,75), distância de funcionamento longa (> 2 mm), 40x objectivo água de imersão. O sistema de perfusão (solução salina em solução salina, para fora), o fio de terra e a pipeta de enzima são inseridos na câmara de gravação (Figuras 1F - J, L).
2. Visualização de MN5 (figuras 2 e 3), Head Off
- Monte a placa de Petri em um microscópio de fase vertical fixo de epifluorescência.
- Posicionar o prato com a mosca nele, de modo que a parte anterior está virado para o lado onde o suporte de eléctrodo émontado (Figura 1).
- Use uma ampliação elevada (40x ou superior), lente de água de alta NA imersão (NA 0,75 ou superior) e um filtro de GFP para iluminar o VNC. Para uma boa visualização da célula durante a limpeza usamos água 40x mergulhando as lentes com um NA de 0,8 ou (Olympus LUMPlanFl 40xW), ou um NA de 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). Para um bom acesso com a pipeta de patch a distância de trabalho deve ser de 2 mm ou maior.
- Ambos MN5 estão localizados no neuromere mesotorácicas sobre a superfície dorsal do gânglio perto da linha média entre - e, eventualmente, parcialmente coberto por - traqueia proeminentes (Figuras 2 e 3). MN5 com suas dendrites aparecer como uma área difusa verde. O tornar-se mais distinta somata após a limpeza. No entanto, as suas dendrites não aparecerão nítidas, mas permanecem desfocada devido a eles continuam a ser coberto por um tecido (Figuras 2A, B).
- Em nossa configuração, usamos um HBO 100 fonte de fluorescência de luz em que não podemos modverificam a intensidade de saída de luz. Usamos filtros de densidade neutra, para evitar a sobre-exposição do tecido a demasiada luz fluorescente, especialmente luz azul. Isto pode causar danos foto e finalmente matar as células. Usamos densidade neutral de 0,8. Não branqueamento deve ocorrer durante o decurso do processo de limpeza. Se branqueamento ocorre, muito provavelmente a produção de luz é muito forte. A célula é danificada foto.
- Se a iluminação LED é utilizado as definições de intensidade terá que ser determinada pelo experimentador. O branqueamento é um sinal de fotodano e deve ser evitada.
3. Método alternativo para a visualização de MN5
Para a nossa aplicação, é importante ter a célula marcada, por exemplo, com a expressão de GFP alvo. Alternativamente, DiI, um corante lipofílico, pode ser utilizado para rotular retrogradamente este neurónio. Neste caso, os cristais de corante são inseridos na musculatura do voo utilizando um pino minutien inseto, e a ferida é fechada com UV cola cura.
- Produzir uma solução stock DiI por dissolução de cristais DII poucos (nenhuma quantidade específica) em 100 ul de etanol a 70%. Esta solução pode ser mantida a -20 ° C até serem utilizados. Congelamento e descongelamento repetidos não é um problema.
- 5 ul da solução são então pipetada para uma lamela de cobertura não tratada. Aguarde até que o etanol tenha evaporado. Isso leva apenas alguns minutos.
- Coloque uma mosca em um frasco pré-arrefecido (colando-o em gelo) e arrefecer durante um curto período de tempo (inferior a 1 min) em gelo. Coloque a mosca frio anestesiados em uma placa de refrigeração sob estereomicroscópio dissecção.
- Centro de mosca e mantê-lo no lugar de modo que não pode ser deixado de lado facilmente ao ser picado com um alfinete minutien.
- Use duas pinças, uma para segurar o pino de minutien, a outra para segurar a mosca para baixo.
- Fórceps grosseiras para segurar um pino minutien inseto e arranhar alguns dos DiI da lamela de modo a que haja um cristal DiI na ponta do pino minutien (usando olamínula muito mesmo e mesmo lugar em que a cobertura de deslizar cada vez ajuda a obter mais corante no pino de cada vez que o procedimento é feito). O pino não deve ser demasiado aguçado, pode dobrar mais facilmente e, em seguida, é de difícil utilização.
- Em seguida, a punção de um buraco no meio do tórax dorsal da mosca com o pino minutien com DiI na ponta. As duas fibras musculares do músculo dorsalmost vôo dorsolongitudinal (DLM, as fibras musculares 5 e 6 de cada lado) são inervados por MN5. Portanto, a colocação de cristais de corante à direita no meio do tórax assegura que ambos MN5 será marcado porque ambas as fibras musculares 6 do DLM será ferido e obter algum corante.
- O corante deve ser colocada directamente por baixo da cutícula. Se o corante é inserido demasiado profundamente, a mosca pode ser esfaqueado ou outros neurónios (eg MN1-4) pode ser rotulada como bem.
- Este processo é repetido até que o suficiente de corante (isto é uma questão de experiência prática e) é inserido no tórax
- DiI não é solub águale, pelo que não se dissolverá no citosol do músculo e terá de ser "recheado" por baixo da cutícula.
- Em seguida, outro pino minutien é mergulhado em uma gota de cola de cura UV (colocamos uma gota de cola em um barco de pesagem).
- A cola que está agora na ponta do pino minutien é usada para fechar a ferida, onde os cristais de corante foram inseridos.
- Após a aplicação de uma cola (apenas um pouco para fechar a ferida, e não todo o tórax) uma pistola de UV é usada para curar a cola. Usamos dois intervalos de 10 s de exposição à luz UV.
- As moscas tratadas são colocadas em alimentos frescos em um frasco de mosca. Certifique-se de que o ponto de cola no tórax das moscas não aderir às paredes do frasco que prende a mosca.
- O corante tem algumas horas para alcançar o neurónio-alvo. Que se desloca ao longo da membrana, e não no citossol, uma vez que é solúvel em lipidos. Nós tratamos os animais no período da tarde e deixá-los durante a noite.
- Patch clamp experiências são conduzidas no dia seguinte. Os neurônios vai ser menos visível quando comparado com a utilização de GFP geneticamente expressa.
4. Preparação da pipeta enzima que é usado para limpeza
É importante para assegurar um fluxo constante de solução salina através da câmara de gravação. Tendo o aumento de volume de banho e quebra deve ser evitado, uma vez que faz com que a vibração e compensar possíveis alterações durante as experiências. Perfusão e sucção devem ser definidos de acordo. Isto faz com que troca solução muito mais fácil, o qual por sua vez é importante para uma rápida lavagem de protease antes da experiência e troca rápida de agentes farmacológicos durante a experiência.
- Assegurar a perfusão da câmara de gravação (taxa de fluxo de cerca de 2 ml por minuto). Taxa de fluxo pode ser regulado pelo uso de um pau ou utilizando tubos de diâmetro específicos (quanto maior o diâmetro, maior a taxa de fluxo). Têm o volume da câmara tão pequena quanto possível para garantir troca rápida da solução no the de câmara. Isto assegura a remoção rápida de protease e bloqueadores da câmara de gravação.
- O volume da câmara depende de como a solução salina para fora (figura 1) do sistema de perfusão é inserido na câmara de gravação (quando a objectiva de imersão em água é reduzido para o banho).
- Certifique-se de que a saída de solução salina é posicionado de maneira a que o título da câmara de gravação não sobem e descem constantemente (sucção, aumento, aumento de sucção), mas mantém-se constante (constante de aspiração). Nós determinamos perfusão constante e estável pela constante, som borbulhante nunca interrompido que é produzido por constantemente chupar salina fora do banho.
- Como solução salina em e-out usamos agulhas hipodérmicas que são dobrados e ligado a tubos estreitos e colocada perto da câmara de gravação utilizando plasticina (Figura 1F).
- Puxe uma pipeta de patch e quebrar a ponta um pouco sob controle visual. Use uma pinça fina limpas. Ao visualizar o unde pipetar a lente de imersão em água a 40 vezes o diâmetro da ponta da pipeta deve ser de aproximadamente entre 40 e 70% do diâmetro da célula do soma. Dicas muito grandes (cerca de célula diâmetro ou mais) pode também ser utilizado, no entanto, o risco de rasgar-se do corpo da célula aumenta, devido às forças de capilaridade da pipeta. A pipeta é muito pequena (menos do que 10% do diâmetro da soma), que entope facilmente o que resulta em ter de usar um ou mais de pipeta nova (s) durante o procedimento de limpeza.
- Encher a pipeta com a protease de 2% em tampão PBS ou solução salina sem entupir-lo.
- Insira a pipeta enzima no suporte do eletrodo. Para assegurar o controlo apropriado da pressão aplicada, o detentor deve ser hermeticamente fechado.
- Anexar um tubo à saída pequeno no suporte da pipeta e fixá-lo de um modo que puxando a extremidade livre do tubo não tem impacto sobre a pipeta, que foi inserido no suporte da pipeta. Verificar se há movimento sob o microscópio.
- Inserir ou p um plástico ipette ponta (do tipo que é usado com uma pipeta automática, usamos os azuis 1000 uL entes, mas isto é uma questão de preferência. Outros tamanhos podem ser usados, bem) ou uma seringa com uma torneira para a extremidade livre do tubo para ser capaz de aplicar uma pressão positiva e negativa para a pipeta de enzima / patch. A pressão positiva é aplicado por qualquer uma das soprando para dentro da ponta da pipeta (utilizando-o como uma peça para a boca) ou empurrando a seringa para baixo. A pressão negativa é aplicada por meio de sucção (com a boca através do bocal) ou puxando-se para fora da seringa.
- O propósito das aplicações de pressão positiva e negativa é para soltar e remover as células e os restos que rodeia as células sob investigação. Pressão positiva irá ejectar enzima da pipeta de limpeza e detritos soprar para fora da superfície do SNC. A pressão negativa é utilizada para aspirar detritos da VNC (como um aspirador de pó).
5. Limpeza de GFP-tagged MN5 (Figura 3 e Vídeo)
conteúdo "> Nota ao leitor: Imagens de MN5 antes e depois da limpeza são difíceis de distinguir na Figura 3 Isto é o que você tem na vida real Vai levar algum treinamento para aprender a distinguir as sutis diferenças entre limpos e não limpos.. neurónios. Note que estas diferenças subtis pode ser visto melhor nas imagens em movimento. Portanto, o filme proporciona uma melhor impressão do que as imagens estáticas (Figura 3).- Visualize a enzima cheio pipeta sob a lente de água mergulhando 40x com luz brilhante (Figura 3B, seta branca).
- Concentre-se na ponta da pipeta. Se estiver entupido, tente retirar a sujeira pela aplicação de pressão positiva ou negativa. Se a sujeira não sair, prepare uma nova enzima cheio pipeta.
- Mudar para a luz fluorescente (Figura 3A).
- Diminuir a pipeta enzima cuidadosamente e re-foco até que o corpo da célula pode ser visto.
- Quando a enzima é pipeta perto docorpo celular, mude a perfusão fora.
- Aplicar uma pressão positiva em rajadas curtas para o corpo celular para que tudo o que está dificultando o acesso para a célula vai ser solto. Isto tem que ser feito até que o tecido que envolve o corpo da célula se soltar.
- Também mover a pipeta enzima dorsalmente pegar detritos soltos que podem ser restos de ganglionar a partir da bainha que rodeia o VNC. Ela pode ter sido removido por dissecção já antes da montagem da preparação para o microscópio (isto não é sempre o caso).
- Com a alternância da aplicação de pressão positiva e negativa, utilize a pipeta enzima como um aspirador de vácuo e em torno do corpo da célula. Não é necessário para soltar o corpo de célula inteira completamente. Limpeza da parte anterior da soma vai fazer (ou a parte posterior ou lateral, dependendo de que lado da pipeta se aproxima da soma).
- Este procedimento de limpeza é feito até que a membrana fica livre de detritos.
- A membrane é limpa quando não há "sombra" ou difuso contraste entre célula e tecido circundante quando vista com luz fluorescente apenas. Isto pode ser visto melhor com luz azul de alta intensidade. Portanto, aumentar a intensidade de luz por um momento (que remover os filtros de densidade neutra para conseguir isso). Note-se que a exposição à luz azul como extensiva fornecida por um regular HBO lâmpada de mercúrio 100 pode causar danos foto dentro de cerca de um minuto. Isto irá resultar no sinal de GFP a desvanecer-se que as células morrem.
- Mudar para a luz brilhante e remover as células e detritos que não podiam ser vistos com luz fluorescente. Note-se que a visualização da traquéia e estado de limpeza podem se beneficiar de comutação entre a luz brilhante e luz fluorescente.
- Quando o processo terminar a limpeza eo corpo celular parece limpa, mudar o sistema de perfusão de volta (isso também se o procedimento de limpeza demora mais do que 3 a 5 minutos e continuar a limpeza com perfusão contínua) e da luz.
- Lave o fo celularr ~ 15 a 20 min com soro fisiológico ou a solução que irá ser utilizado para o pedido seguinte. Não menos do que 40 ml devem passar pela câmara de gravação para ter certeza de que a protease é lavado. Restos de protease sobre a superfície da célula irá causar a morte da célula durante a súbita gravações braçadeira de outro modo estáveis patch.
6. Eletrofisiologia
- Convencional em patch clamp de células inteiras situ em fixador de tensão e de corrente de modo de fixação é realizada através de um amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, EUA); sinais são digitalizados utilizando um Digidata 1320 (Molecular Devices, EUA) e analisadas com o software pClamp 10.2.
- Pipetas de patch são puxados a partir de capilares de vidro de borossilicato com um plano vertical da pipeta puxador (Narishige, PC-10).
- Resistências pipeta ponta estão entre 5,8 e 6,2 MQ (grampo atual e potássio gravações atuais) e entre 2,8 e 3,5 MQ (para gravações de cálcio atuais), respectivamente. Resistência de ponta dependesoluções intra e extracelular usado (para detalhes ver 13, 14).
7. Resultados representativos
Após o procedimento de limpeza, tanto MN5 estão prontos para a fixação de membranas de células inteiras situ (Figura 3). A seção seguinte mostra braçadeira de tensão representante e vestígios de fixação atuais como gravadas de MN5 soma depois de usar o procedimento de limpeza descrito. MN5 expressa uma variedade de canais iônicos voltagem fechadas (ver também 13,14). Mostramos um exemplo de tensão correntes de cálcio gated (Figura 4), a tensão de gate correntes de potássio (Figura 5) e vestígios de potencial de acção (Figura 6). Cálcio gated tensão e as correntes de potássio foram evocados por protocolos de tensão semelhantes, mas as soluções que têm sido utilizados são diferentes, a fim de permitir que apenas os canais de iões sob investigação para passar corrente (para mais detalhes veja 13,14). Todos outro grande tensão ch íon fechadoannels foram bloqueados (tensão canais de sódio fechados com 100 tetrototoxin nM - pipetados diretamente para o banho, a perfusão foi interrompida por dois minutos - canais de cálcio com 500 cadmiumchloride mM, canais de potássio com 2 mM de 4 aminopiridin (4-AP) e 30 mM mM tetraethylammoniumchloride extracelularmente e 0,5 4-AP, 20 tetraethylammoniumbromide mM e 144 mM cesiumchloride intracelularmente através da solução de remendo intracelular no pipeta patch (para mais detalhes veja 13,14). traços potencial de ação foram evocados por injeção de corrente para a soma MN5 (Figura 6) sem a utilização de qualquer bloqueador do canal de iões 12.
Figura 1. A instalação de limpeza. A mosca está preso em uma tampa Sylgard revestido de uma placa de Petri de 35 mm em que se colado um anel de plástico (diâmetro interno de 9 mm, 1,3 milímetros de espessura), with petrolatum (A, B). Depois de submergir a mosca em solução salina (C), é aberto ao longo da linha média dorsal. Gut e do esófago são removidos para expor o cordão nervoso ventral (D). Para uma melhor acessibilidade do neuromere torácica da cabeça é removida (E). Após a montagem da preparação para um microscópio vertical epifluorescente, o sistema de perfusão (F, G, solução salina, solução salina de fora, as setas brancas sobre a esquerda), assim como o fio de terra está colocado em posição (F, G, seta branca direita). A enzima de limpeza pipeta cheia é colocada em posição, após o objectiva de imersão em água (40X, NA 0.8) foi reduzido para o banho de (H). Para maior clareza, mostramos que já antes o objetivo foi reduzido (F, G, seta branca à direita). O ângulo em que a pipeta enzima que é mantido por um suporte 1-HL-U eléctrodo (J) que entra na câmara de gravação é importante como a pipeta não deve tocar tanto o objectivo e o anel de plástico. Este ângulo varia de configuração para configuração. Aqui é de aproximadamente 30 ° (ver desenho em J, K seta). O arranjo da pipeta no seu suporte, que está ligado a um andar de entrada é mostrado em (L). O andar de entrada é acoplado a um micromanipulador motorizado. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. MN5 no cordão nervoso ventral. MN5 podem ser prontamente identificados pela sua localização no cordão nervoso ventral Drosophila (VNC), quando é geneticamente GFP expressa pela utilização de neurónios motores específicos GAL4 condutores (A). O retângulo pontilhado mostra o neuromere torácica. Para se ter uma ideia de como os tamanhos relacionam umas com as outras, que apresentam uma pipeta patch de limpeza aproximando do MN5 esquerda a partir do lado esquerdo do músculo do vôo dorsolongitudinal. Para melhor visualização, a pipeta de adesivo foi cheia com um corante vermelho (dextrano-tetrametilrodamina, A). O contralateralralmente projectando MN5 estão localizados sobre a superfície dorsal da neuromere mesotorácicas do VNC em cada lado da linha média (vista de projecção de uma pilha de imagem confocal em B). A projecção ipsilateral MN1-4 estão localizados mais lateralmente e anteriormente relacionado com MN5 (setas B). O círculo a tracejado entre ambos MN5 mostra os dendritos dos neurónios motores de voo, na neuropil incluindo MN5 (B). Etiqueta GFP em (B) foi realçado por coloração imuno-histoquímica com um anticorpo contra GFP. Detalhes da MN5 morfologia são tornados visíveis através do enchimento do neurónio intracelularmente (iontoforese), com o traçador neurobiotin invisível e de aquisição de imagem confocal posterior (C). A coloração foi tornada visível com estreptavidina acoplada a um fluoróforo. Barra de escala é de 30 um.
Figura 3. MN5 limpeza antes e depois. Visualization de MN5 é conseguido através da expressão de GFP utilizando o UAS/GAL4sistema (A, C, ver rótulo). MN5 antes (A, B) e depois (C, D), o procedimento de limpeza. Lado esquerdo de cada imagem representa anterior, lado direito representa posterior. Neurônios para gravar a partir de são limpos com uma pipeta de patch protease preenchido com uma ponta quebrada. A pipeta enzima é apenas fracamente visíveis (A, B, ver rótulo). A gravura na mostra uma ampliação do MN5 inferior com a pipeta enzima aproximando da célula. MN5 não pode ser visto em luz brilhante antes de o procedimento de limpeza (B). Traqueia precisam de ser removidos se cobrir as células sob investigação. Após o processo de limpeza, o contraste entre célula e tecido circundante é mais nítido (C, inferior MN5), e a célula pode então ser vista à luz brilhante (D). A ponta de pipeta pode ser visto mais claramente quando a luz brilhante é usado. O alargamento descreve a área da praça pontilhada com MN5 fronteiras do corpo celular rodeado por uma linha pontilhada para melhor identificação. Visualização em luz brilhante, muitas vezes ajuda julgamento de limpeza.
Figura 4. Corrente de cálcio em MN5. Gravação Exemplo de correntes de cálcio de células inteiras como gravado de MN5. Pelo menos, duas correntes de cálcio diferentes são mostrados, uma baixa tensão de cálcio activada transitória e uma tensão contínua de cálcio de alta corrente. Correntes foram evocados a partir de um potencial de exploração de -90 mV. Passos de voltagem de -90 mV a +20 mV foram aplicadas. Bloqueadores foram utilizados para bloquear canais iónicos maioria dos outros. Os artefatos foram omitidos para maior clareza (para caracterização de MN5 correntes de cálcio ver Ryglewski et al., 2012).
Figura 5. Correntes de potássio em MN5. Exemplo gravação de correntes de células inteiras de potássio, como registado a partir de MN5. Correntes de cálcio activadas mostradas incluem correntes de potássio como bloqueadores dos canais de cálcio não foram aplicados. Correntes foram evocados de uma exploraçãopotencial de -90 mV para a corrente total de potássio (A) ou a partir de um potencial de manutenção de -20 mV para inactivar transientes correntes de potássio e mostram apenas o potássio sustentada corrente (B). Passos de voltagem de -90 mV a +20 mV foram aplicadas em incrementos de 10 mV. Subtração desligada da corrente de potássio como evocado a partir de um potencial de manutenção de -90 mV (A) e -20 mV (B) mostram as correntes de potássio puros transientes (C). Tensão canais de sódio fechados foram bloqueadas. Os artefatos foram omitidos para maior clareza (para caracterização de MN5 tensão e correntes de potássio, cálcio e ver Ryglewski Duch, 2009).
Figura 6. Firing padrão praticado por MN5. Gravação Exemplo de disparar padrões como atingida em MN5 por injeções somáticas atuais (0,4 nA, preto, 0,5 nA, cinza) de 200 ms de duração. Potencial de repouso da membrana foi de -59 mV. Bloqueadores do canal de iões não foram utilizados. (Para análise de pinça de corrente de disparo MN5padrões ver Duch et al., 2008).
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Discussion
Quando a visualização das células com proteínas fluorescentes como GFP, é importante não sobre-exposição da preparação a muita luz. Isto pode resultar em dano da foto. Usamos 100W HBO lâmpadas de mercúrio de arco curto para iluminação, e também usamos de densidade neutra (ND) de 0,8 (filtros ND Chroma 0,3 e 0,5). Para ser capaz de avaliar a qualidade da limpeza boa visibilidade é crucial. Por conseguinte, os filtros podem ser removidos ND por curtos períodos de cerca de 20 s para múltiplas vezes.
Ao aplicar um pouco de pressão positiva, o corpo de células "flaps" um pouco. Isto ajuda a avaliar a qualidade de limpeza. No contraste ventral do nervo cabo é muito baixo, e o movimento pode ser extremamente útil para visualizar as células. O suporte de eléctrodo que está a ser utilizada para o procedimento de limpeza (e também para patch clamping) deve ser hermeticamente fechado, a aplicação da pressão de outra forma controlada não será possível. Perdendo a pressão vai perturbar a remoção bem sucedida de tecido e debris e evitar giga-selo formação
No caso em gravações de fixação in situ de patch deve ser realizada após a limpeza da célula, estar cientes de que há não só uma bainha que envolve o cordão nervoso ventral como um todo (o qual tem de ser removido por qualquer gravação patch clamp de qualquer neurónio central de moscas adultas ), mas as próprias células podem ser rodeado por uma bainha também. MN5, por exemplo, está rodeado por uma bainha não celular que pode ser visto somente com a iluminação de intensidade elevada breve. Além disso, as células podem ser localizados por baixo da traqueia. No caso da célula não pode ser acedido, a traqueia tem que ser puxado à parte, se não rasgado com a pipeta, durante o procedimento de limpeza (depois de ter sido puxado de lado). O procedimento de limpeza do conjunto tem de ser feito, sem puxar o tecido em excesso. Este procedimento irá exigir treinamento. O melhor limpeza, maior será a frequência de ocorrência imediata de giga-vedantes (dentro de 1 s depois de tocar a célula e relaliviando a pressão positiva).
Dependendo do protocolo de limpeza e do break-nos seguintes cenários são possíveis: Primeiro, se as células não foram limpos bem o suficiente, uma giga-selo não é possível e que o experimento deve ser encerrado. Em segundo lugar, em alguns casos, a limpeza é bom o suficiente para giga-selo formação, mas o restante, fina dificilmente visível da bainha permanece em torno da soma. Isto fará com que a membrana de ruptura e causar correntes de fuga de amplitudes diferentes. Uma consequência menos grave de limpeza insuficiente de células é que alguns resíduos de revestimento aumenta a causa da resistência de acesso. Dependendo dos critérios de qualidade de design experimentais diferentes para a correção poderia aplicar. Para monitorar padrões de ação potenciais na braçadeira atual do potencial de membrana da célula deve ser saudável (-55 mV ou mais hiperpolarizada no caso de MN5), mas a resistência de acesso não é uma questão tão importante. No entanto, quando evocando potenciais de ação por re injecção de corrente de acessotência se torna um problema. Para evocar as correntes de potássio de grande amplitude que se originam perto do local de gravação o vazamento deve ser pequeno (no caso de resistência MN5 de entrada deve, por maior que 80 MQ) e resistência de acesso não deve ser maior do que 15 MQ. Para o grampo de espaço que é necessário em gravações de fixação de tensão de pequenas amplitudes correntes de cálcio dendríticas que têm origem em uma grande distância a partir da soma não vazamento pode ser introduzido (por MN5 resistência de entrada deve ser acima de 120 MQ) e resistência de acesso não pode ser maior do que 12 MQ. Na maioria das gravações que medir correntes de cálcio com resistências de acesso entre 8 e 10 M (como ler a marcação sobre o amplificador axopatch 200B após resistência série e compensação de capacitância toda célula). Para cada tipo de célula a ser gravado, os critérios de qualidade devem ser determinadas individualmente.
Usando o procedimento de limpeza descrito aqui, podemos realizar as gravações estáveis para a aproximaçãomadamente 90 minutos. Não observamos considerável run-down (testados especificamente para CAV2 e Cav3 correntes de cálcio e para Shaker, Shal, e correntes de potássio atrasados retificador). No entanto, não temos tentado manter o patch mais tempo e, portanto, não se pode afirmar se as gravações mais seria possível.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
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