In situ patch clamp-optagelser anvendes til elektrofysiologisk karakterisering af neuroner i intakt kredsløb. I Drosophila genetisk model patch fastspænding er vanskelig, fordi de CNS er lille og omgivet af en robust kappe. Denne artikel beskriver procedure for at fjerne hylsteret og rene neuroner for efterfølgende patch clamp optagelser.
Korte generation tider og letkøbte genetiske teknikker gør bananfluen Drosophila melanogaster en fremragende genetisk model i fundamental neurovidenskab forskning. Ionkanaler er grundlaget for al adfærd, da de medierer neuronal excitabilitet. Den første spænding gated ion klonet kanal var Drosophila spænding gated kaliumkanal Shaker 1,2. Til forståelse rolle for ionkanaler og membran excitabilitet for nervesystemet funktion er det nyttigt at kombinere stærke genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila med in situ patch clamp optagelser. I mange år har sådanne optagelser er blevet vanskeliggjort af den lille størrelse af Drosophila CNS. Desuden en robust kappe fremstillet af glia og kollagen udgjorde hindringer for patch pipette adgang til centrale neuroner. Fjernelse af denne kappe er en nødvendig forudsætning for patch clamp optagelser fra enhver neuron i den voksne Drosophila CNS. I de senere årforskerne har været i stand til at udføre in situ patch clamp optagelser fra neuroner i den voksne hjerne 3,4 og ventrale nerve ledning af embryonale 5,6, larve 7,8,9,10 og voksne Drosophila 11,12,13,14. En stabil giga-forsegling er den vigtigste forudsætning for et godt plaster og afhænger af ren kontakt af patch-pipetten med cellemembranen for at undgå lækage strømme. Derfor skal for hel-celle in situ patch clamp optagelser fra voksne Drosophila neuroner renses grundigt. I det første trin, har ganglioniske kappe, der skal behandles enzymatisk og mekanisk fjernet for at gøre målcellerne tilgængelige. I det andet trin, har cellemembranen, der skal poleres, således at ingen lag af glia, collagen eller andet materiale kan forstyrre giga-forsegling formation. Denne artikel beskriver, hvordan man forbereder en identificeret central neuron i Drosophila ventrale nerve ledning, flyvningen motoneuron 5 (MN5 15), for somatiske hel cEll patch clamp optagelser. Identifikation og synligheden af neuron opnås ved målrettet ekspression af GFP i MN5. Vi har ikke til formål at forklare patch clamp-teknikken selv.
Når visualisere celler med fluorescerende proteiner såsom GFP, er det vigtigt at ikke overeksponere præparatet for for meget lys. Dette kan resultere i foto skader. Vi bruger 100W HBO kortbue kviksølv pærer til belysning, og vi bruger også neutral tæthed (ND) på 0,8 (Chroma ND-filtre 0,3 og 0,5). For at kunne bedømme kvaliteten af rengøringsprocessen godt udsyn er afgørende. Derfor kan ND-filtre fjernes i korte perioder på omkring 20 s til flere gange.
Når de anvender nogl…
The authors have nothing to disclose.
Agent/item | Company | Catalog number |
Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
DiI | Invitrogen USA | D3899 |
Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |