Summary
На месте патч зажим записи используются для электрофизиологических характеристик нейронов у интактных схемы. В Drosophila генетической модели патч зажимной трудно, потому что ЦНС является небольшой и окружен надежными оболочки. В данной статье описывается процедура удаления оболочки и чистой нейронов для последующей записи зажим патч.
Abstract
Короткие сроки производства и поверхностное методов генной сделать плодовой мушки дрозофилы отличную генетическую модель в фундаментальных исследованиях нейронауки. Ионные каналы являются основой любого поведения, так как они посредником возбудимости нейронов. Первый напряжения закрытого ионных каналов клонированных было напряжение Drosophila закрытом калиевого канала Шейкер 1,2. К пониманию роли ионных каналов мембран и возбудимости нервной системы целесообразно объединить мощные генетические инструменты, доступные в дрозофилы с записями на месте зажим патч. На протяжении многих лет такие записи были затруднены небольшой размер CNS дрозофилы. Кроме того, надежная оболочка из глии и коллаген составляет препятствия для патч пипетки доступ к центральным нейронам. Удаление этой оболочки является необходимой предпосылкой для записи патч зажим от любого нейрона в ЦНС взрослых дрозофилы. В последние годыученые смогли провести на месте записи зажим патч от нейронов в мозгу взрослого 3,4 и брюшной нервной эмбриональных 5,6, 7,8,9,10 личиночных и взрослых Drosophila 11,12,13,14. Стабильная гига-печать является основным условием для хорошего патча и зависит от чистой контакт патч пипетки с клеточной мембраной, чтобы избежать утечки тока. Поэтому для целых клеток на месте патч зажим записи от взрослых нейронов дрозофилы должны быть тщательно очищены. На первом этапе, ганглиозных оболочка должна рассматриваться ферментативно и механически удалить, чтобы сделать клетки-мишени доступны. На втором этапе, клеточная мембрана должна быть отполированы так, что ни один слой материала глии, коллагена или других может нарушить гига-уплотнение образование. В этой статье описывается, как подготовить определены центрального нейрона в Drosophila брюшной нервной, полет мотонейронов 5 (MN5 15), для соматических целом сELL записи патч зажим. Идентификация и видимость нейрона достигается за счет целевых выражения GFP в MN5. Мы не стремимся, чтобы объяснить технику патч зажим себя.
Protocol
Следующее описание не является специфичным для одного мотонейрона. Он может быть использован с любым нейроном. В этом примере мы используем полета мотонейронов 5 (MN5), который иннервирует двух dorsalmost волокна dorsolongitudinal крыло депрессор (DLM). Для выявления и визуализации MN5 мы используем UAS/GAL4 системы, чтобы выразить GFP в полете мотонейронов (и нескольких других нейронов).
1. Препарирование взрослых Drosophila получить доступ к спинной части брюшной нервной (VNC)
- Проанализируйте взрослых Drosophila спинной стороне вдоль ее дорсальной срединной линии в Sylgard покрытием чашке Петри (35 мм в диаметре), как описано в Ryglewski и Дач (2009 13). Фильм об этой рассечение доступна в режиме онлайн через Юпитер (Бернер и Godenschwege 16. Ниже приводится краткое описание рассечение.
- Взрослые мухи анестезии при охлаждении на льду в течение 1 мин. Это может быть достигнуто путем предварительного охлаждения пустой флакон лету (без питания)на льду и размещение лету в уже холодную флаконе. Крылья и ноги удалены с ножницами.
- Муха затем удержал спинной стороне в Sylgard покрытием чашке Петри (мы используем крышкой 35 мм чашки Петри заполнены до краев Sylgard; цифры 1а, б) с пластиковым кольцом (внутренний диаметр 9 мм, толщиной 1,3 мм ) приклеены к Sylgard с вазелином.
- Использование крышки на 35 мм блюдо Петри облегчает доступ к VNC с патчем пипеткой под визуализации с водой погружением линзы. Это позволяет ввести пипеткой неглубоко, не касаясь стены блюдо.
- Пластиковое кольцо может быть сделано, просверлив отверстие в тонком (мы используем 1,3 мм толщиной) пластиковый лист. Мы используем кусачки определить по внешнему периметру кольца, так что он подходит блюдо.
- Погрузитесь лету в физиологическом растворе (рис. 1С; состав раствора в мМ: NaCl 128, KCl 2, CaCl 2 1,8, MgCl 2 4, HEPES 5, сахароза ~ 35 Депенахождении на осмотическое давление раствора; рН доводят до 7,25 с 1 М NaOH, осмотическое давление доводят до 290 мОсм с сахарозой).
- Животных разрезали вдоль спинной средней линии, и большие продольные мышцы спины полета растягиваются в стороны и возлагали подвергать кишки, пищевода и VNC под ним. После удаления кишечника и пищевода, VNC подвергается (рис. 1D).
- Необязательно, муха может быть обезглавлен на этом шаге (рис. 1E). Удаление главы делает доступ с ферментом и патч пипетки удобнее, и MN5 дендриты не нарушается при чистке сома (дендриты позади сома, рис 2B, C). Однако глава также можно оставить нетронутыми, если этого требует экспериментального проектирования (например, изучение убывания вклада в грудной мотонейронов). В этом случае пипетки может быть введен с задней или боковой (латеральной, рисунок 2А).
- Для быстрогосолевой обмен в ходе экспериментов объем записи камеры сведено к минимуму путем размещения пластиковое кольцо (внутренний диаметр 9 мм) по всему расчлененных животных и склеивания его в блюдо с вазелином (рис. 1а, б; объем записи камеры ~ 200 мкл) .
- Подготовка затем смонтирован на вертикальной фиксированной микроскоп флуоресценции этапе (мы используем Zeiss Axioskop 2 FS плюс, Zeiss, Германия) и просматривать с высокой NA (> 0,75), большое рабочее расстояние (> 2 мм), 40x воды погружения цели. Перфузионной системы (физиологический раствор в, солевые-выход), провод заземления и ферментов пипетки вводят в записи камеры (рис. 1F - J, L).
2. Визуализация MN5 (см. рисунки 2 и 3), руководитель Off
- Установите чашку Петри на вертикальном фиксированном этапе epifluorescent микроскопом.
- Поместите блюдо с лету в его так, что передняя часть сталкивается с той стороны, где держатель электрода являетсямонтаж (рис. 1).
- Используйте большое увеличение (40x и выше), высокая вода НС погружения линзы (NA 0,75 или выше) и GFP фильтр для освещения VNC. Для хорошей визуализации ячейки во время уборки мы используем 40x воды погружения линзы с NA либо 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW), или НС 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). Для хорошего доступа с патчем пипеткой рабочее расстояние должно быть 2 мм или больше.
- Оба MN5 находятся в mesothoracic neuromere на спинной поверхности ганглия близко к средней линии между - и, возможно, частично покрыты - видный трахеи (рис. 2 и 3). MN5 с их дендриты появляются как диффузный зеленой зоне. Somata становятся более отчетливыми после очистки. Однако, их дендриты не появятся резкие, но остаются размытыми из-за них все еще покрыта тканью (рис. 2A, B).
- В нашей установке мы используем HBO 100 флуоресценции источник света, в котором мы не можем модазать интенсивность света выхода. Мы используем фильтры нейтральной плотности, чтобы избежать чрезмерного воздействия на ткани слишком много дневного света, особенно синего света. Это может привести к повреждению фото и в конечном итоге убивает клетки. Мы используем нейтральной плотности 0,8. Нет отбеливание должно происходить в ходе процедуры очистки. Если отбеливание происходит, скорее всего, световой поток слишком сильный. Ячейки фото повреждены.
- Если светодиодной подсветкой используется интенсивность параметры должны быть определены экспериментатором. Отбеливание является признаком фотостарения и его следует избегать.
3. Альтернативный метод визуализации MN5
Для нашего приложения важно, чтобы клетки помечены, например, целевые выражения GFP. Кроме того, DiI, липофильный краситель, может быть использован для обозначения ретроградно этого нейрона. В этом случае кристаллы красителя вводят в мышцы с использованием полета насекомых контактный minutien, и рана закрывается с помощью UВ отверждения клея.
- Сделайте раствор DiI акции, растворив несколько кристаллов DiI (без определенного количества) в 100 мкл 70% этанола. Это решение может быть сохранена при температуре от -20 ° C до израсходованы. Повторное замораживание и оттаивание не является проблемой.
- 5 мкл раствора, затем пипеткой на необработанные скольжения крышки. Подождите, пока этанол не испарится. Это занимает всего несколько минут.
- Поместите муху в предварительно охлажденный флакон (придерживаясь его в лед) и остыть в течение короткого периода времени (менее 1 мин) на льду. Положите холодную наркозом летать на охлаждение пластины под рассечение стереомикроскопа.
- Центр лету и удерживать его на месте, так что она не может быть оттеснены легко, когда их тычут контактный minutien.
- Используйте два пинцета, один для хранения контактных minutien, а другой держать лету вниз.
- Используйте пинцет грубой провести насекомых контактный minutien и поцарапать некоторые из DiI из покровного стекла, так что есть кристалл DiI на кончике стержня minutien (с помощьюСам же покровным и том же месте, что на крышке скольжение каждый раз помогает получить больше красителя на вывод каждый раз, когда процедура выполняется). Вывод не должны быть слишком острый, он может согнуть более легко и тогда трудно использовать.
- Тогда прокола отверстие в середине грудной клетки спинного мухи со штифтом minutien с DiI на конце. Два dorsalmost мышечных волокон мышцы dorsolongitudinal полета (DLM, мышечные волокна 5 и 6 с каждой стороны) иннервируются MN5. Таким образом, размещение красителя кристаллы прямо в середине грудной клетки уверяет, что оба MN5 будут помечены потому что обе мышечные волокна 6 из DLM будет больно и получить некоторые краски.
- Красителя должны быть размещены непосредственно под кутикулой. Если краситель вводится слишком глубоко, муха может быть ножом или другими нейронами (например, MN1-4), могут быть помечены как хорошо.
- Это повторяется до тех пор пока достаточно красителя (это вопрос практики и опыта) вставляется в грудной клетке
- DiI не вода solubле, поэтому он не будет растворяться в цитозоле мышечной и должно быть "фаршированные" под кутикулой.
- Тогда другой контактный minutien погружают в каплю клея УФ-отверждения (положим каплю клея в лодку весом).
- Клей, который сейчас находится на кончике контактный minutien используется для закрытия раны, где красителя кристаллы были вставлены.
- После нанесения клей (только немного, чтобы закрыть рану, а не весь грудной клетки) УФ-пушка используется для лечения клея. Мы используем два 10 с интервалом в ультрафиолетовых лучей.
- Обработанные мух ставятся на свежие продукты в лету флаконе. Убедитесь, что клей пятно на груди мух не прилипает к стенкам флакона, который задерживает лету.
- Красителя требуется несколько часов, чтобы достичь целевого нейрона. Она движется вдоль мембраны, а не в цитозоле, так как это жирорастворимый. Мы относимся к животным во второй половине дня и оставить их на ночь.
- Эксперименты патч зажим проводится на следующий день. Нейронов будут менее заметны по сравнению с использованием генетически выразил GFP.
4. Подготовка фермента пипеткой, которая используется для очистки
Важно обеспечить устойчивый поток солевого раствора путем регистрации камеры. Имея рост объема ванны и осенью следует избегать, так как вызывает вибрацию и смещение возможных изменений в процессе экспериментов. Перфузии и всасывания должны быть установлены соответствующим образом. Это делает решение обмен гораздо проще, который, в свою очередь, является важным для быстрого вымывания протеаз до начала эксперимента и быстрый обмен фармакологических препаратов во время эксперимента.
- Убедите перфузии записи камеры (расход примерно 2 мл в минуту). Скорость потока может регулироваться либо с помощью крана или с помощью специальных трубок диаметра (чем больше диаметр, тем выше скорость потока). Имеют объем камеры как можно меньше, чтобы гарантировать быстрый обмен решение в гоэлектронной камеры. Это обеспечивает быстрое удаление протеазы и блокаторы с записи камеры.
- Объем камеры зависит от того, как физиологический раствор из (рис. 1) из системы перфузии вводят в записи камеры (когда цель погружения в воду опускают в ванну).
- Убедитесь, что физиологический раствор из расположена таким образом, что титр записи камеры не поднимаются и падают постоянно (всасывание, подъем, всасывание, рост), но остается постоянной (устойчивой всасывания). Мы определять устойчивый и стабильный перфузии постоянным, никогда не прерывались булькающий звук, который производится постоянно сосать соленый из ванны.
- Как физиологический раствор в и выезда мы используем иглы для подкожных инъекций, которые согнуты и привязаны к узкой трубки и положил рядом с записью камеры с использованием пластилина (рис. 1F).
- Потяните патч пипетки и сломать кончик немного под визуальным контролем. Использование тонкой очистки щипцов. При визуализации пипетки недеформированнойR 40x объектив погружением в воду диаметра пипетки должна быть примерно между 40 и 70% сомы диаметр ячейки. Очень большие советы (примерно диаметром ячейки или больше) также может быть использован, однако, вероятность того, срывая тела клетки увеличивается за счет капиллярных сил пипетки. Является ли пипетки очень мала (менее 10% от диаметра сомы), он забивает легко, что приводит к необходимости использовать один или несколько свежих пипетки (ы) в течение процедуры очистки.
- Наполните пипетку с 2% протеазы в PBS буфере или физиологического раствора, не забивая его.
- Вставьте фермента пипетки в держатель электрода. Для обеспечения надлежащего контроля приложенного давления, держатель должна быть плотно закрыты.
- Прикрепите трубки к небольшим выходом на пипетку держатель и закрепить его таким образом, чтобы дергать на свободный конец трубки не влияет на пипетку, который был вставлен в держатель пипетки. Проверьте движение под микроскопом.
- Вставьте либо пластиковые р ipette наконечник (вид, который используется с автоматической pipetter, мы используем синюю 1000 мкл них, но это вопрос предпочтений. Другие размеры могут быть использованы как хорошо) или шприц с петухом в свободный конец трубки чтобы иметь возможность применять положительные и отрицательные давления на фермент / патч пипетки. Положительное давление применяется либо дует в кончике пипетки (используя его как часть рта) или, нажав на шприц вниз. Отрицательное давление применяется всасывания (с использованием рот капу) или, потянув за шприц.
- Цель положительных и отрицательных давлений, чтобы ослабить и удалить клеток и мусора окружающие клетки под следствием. Положительное давление будет извлечен фермента из пипетки очистки и взорвать мусора с поверхности ЦНС. Отрицательное давление используется для сосать мусора с VNC (как пылесос).
5. Очистка GFP с метками MN5 (рис. 3 и видео)
Содержание "> Примечание для читателя: Изображения MN5 до и после очистки трудно отличить на рисунке 3 Это то, что вы получаете в реальной жизни займет некоторое обучение, чтобы научиться различать тонкие различия между очищены и не очищены.. нейронов. Пожалуйста, обратите внимание, что эти тонкие различия можно увидеть лучшее в движущихся изображений. Таким образом, фильм обеспечивает лучшее впечатление, чем статические изображения (рис. 3).- Визуализируйте фермента заполнить пипетку под водой 40x объектив с погружением яркого света (рис. 3В, белая стрелка).
- Сфокусируйтесь на кончике пипетки. Если он засорен, попытаться получить грязь, применяя положительное или отрицательное давление. Если грязь не выходит, подготовить новый фермент заполнить пипетку.
- Переключить на флуоресцентный свет (рис. 3А).
- Опустите фермента пипеткой тщательно и переориентировать до тела клетки могут быть видны.
- Когда фермент пипетки близко ктело клетки, переключиться перфузии прочь.
- Применение положительного давления в коротких очередей к телу клетки, так что все, что мешает доступ к ячейке будет ослаблен. Это должно быть сделано до тканей, окружающих клетки тела высвободился.
- Также перемещения фермента пипетки сверху ловить мусор, который может быть левым в течение от ганглиозных оболочку, которая окружает VNC. Возможно, он был удален уже на вскрытии до установки подготовки к микроскопу (это не всегда так).
- С переменным применение положительного и отрицательного давления, использовать фермент пипетки, как пылесос и вакуум вокруг тела клетки. Это не обязательно, чтобы ослабить тело клетки полностью. Очистка передней части сомы будет делать (или задней или боковой части в зависимости от с какой стороны пипетки приближается к сому).
- Эта процедура чистки будет сделано, пока мембрана выглядит мусора.
- Membraпе чистая, когда не существует "теневой" или диффузный контраст между клеткой и окружающей тканью, если смотреть с флуоресцентный свет только. Это видно лучше всего с высоким голубым интенсивности. Таким образом, увеличение интенсивности света на мгновение (мы удалим фильтры нейтральной плотности для достижения этой цели). Обратите внимание, что обширные сине освещенности, как это предусмотрено регулярное HBO 100 ламп ртути может вызвать повреждение фотографию в течение примерно одной минуты. Это приведет к сигналу GFP, чтобы исчезнуть, как клетки погибают.
- Переключить на яркий свет и удаления клеток и мусора, который не может рассматриваться с люминесцентным светом. Следует отметить, что визуализация трахеи и очистки статуса могут воспользоваться переключением между яркий свет и лампы дневного света.
- Когда процедура чистки закончена и тела клетки появляется чистая, переключение системы перфузии снова (это тоже возможно, если процедура чистки занимает больше времени, чем от 3 до 5 минут и продолжить очистку с постоянной перфузии) и свет.
- Промойте ячейку лR ~ от 15 до 20 мин с физиологическим раствором или решение, которое будет использоваться для следующих приложений. Не менее 40 мл должны пройти записи камеры, чтобы убедиться, что протеазы блеклым. Протеаза остатки на поверхности клеток вызовет внезапную смерть клеток во время противном случае стабильной записи патч зажим.
6. Электрофизиология
- Обычные на месте весь зажим патч ячейки в напряжении зажим и текущем режиме зажим проводится с использованием усилителя Axopatch 200B (Molecular Devices, USA); сигналы преобразуются в цифровую форму использования Digidata 1320 (Molecular Devices, USA) и анализировали с pClamp 10,2 программного обеспечения.
- Патч пипетки вытащил из боросиликатного стеклянные капилляры с вертикальной пипетки съемника (Narishige, ПК-10).
- Наконечник сопротивлений между 5,8 и 6,2 Мом (токовые клещи и калия текущей записи) и от 2,8 до 3,5 Мом (для кальция текущей записи) соответственно. Совет сопротивление зависит отвнутри-и внеклеточных растворов, используемых (подробнее см. 13, 14).
7. Представитель Результаты
После процедуры очистки и MN5 готовы на месте весь зажим патч ячейки (рис. 3). В следующем разделе показано, представитель зажим напряжения и тока следы зажим, как записано в MN5 сомы после применения описанной процедуры очистки. MN5 выражает различные напряжения ионных каналов (см. также 13,14). Мы покажем пример напряжения закрытого кальциевых токов (рис. 4), напряжение закрытых калиевых токов (рис. 5) и потенциал действия следов (рис. 6). Напряжение закрытого кальция и калия токи были вызваны аналогичными протоколами напряжения, но те решения, которые были использованы отличаться для того, чтобы позволить только ионных каналов под следствием проходить ток (подробнее см. 13,14). Все остальные основные напряжения закрытого ионных каналовAnnels были заблокированы (напряжения натриевых каналов с 100 нМ tetrototoxin - пипеткой непосредственно в ванне; перфузии была приостановлена в течение двух минут - кальциевых каналов с 500 cadmiumchloride мкМ, калиевых каналов с 2 мм 4-aminopyridin (4-AP) и 30 мМ tetraethylammoniumchloride внеклеточно и 0,5 мм 4-AP, 20 мМ tetraethylammoniumbromide и 144 мм cesiumchloride внутриклеточно с помощью внутриклеточных решение патча в патч пипетки (подробнее см. 13,14). следы потенциал действия были вызваны инжекции тока в MN5 сомы (рис. 6) без использования любого иона блокаторы канала 12.
Рисунок 1. Очистка установки. Муха скованы в Sylgard покрытием крышки 35 мм чашку Петри, в которой мы клееного пластмассовое кольцо (внутренний диаметр 9 мм, толщиной 1,3 мм) Wго вазелин (A, B). После погружения лету в солевом растворе (C) она будет открыта вдоль спинной средней линии. Gut и пищевод удаляют, чтобы разоблачить брюшной нервной (D). Для повышения доступности грудной neuromere глава удаляется (E). После установки подготовки на вертикальном эпифлуоресцентной микроскоп, перфузии система (F, G, физиологический раствор в, солевые-выход, белые стрелки слева), а также провод заземления вводятся в позицию (F, G, белая стрелка на справа). Фермент заполнены очистки пипетки вводят в позицию после того, как цель погружения в воду (40x, NA 0,8) была снижена в ванну (H). Для наглядности мы покажем это уже до цели была снижена (F, G, белая стрелка справа). Угол, под которым фермент пипеткой, которая хранится в 1-HL-U держатель электрода (J) входит в запись камеры важно, так как пипетки не должен касаться как объективный и пластикового кольца. Этот угол изменяется от установки к установке. Вот это примерно 30 ° (см. рисунок в J, K стрелка). Расположение пипетки в держателе, который прикреплен к headstage показано на (L). Headstage прикреплен к моторизованным микроманипулятора. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. MN5 в брюшной нервной. MN5 можно легко определить по его расположение в Drosophila брюшной нервной (VNC), когда GFP генетически выражается с помощью мотонейронов конкретных GAL4 драйверов (A). Пунктиром показана грудной neuromere. Чтобы получить представление о том, как размеры соотносятся друг с другом, мы показываем пипетки очистки патч приближается к левой MN5 с левой стороны dorsolongitudinal мышцы полета. Для лучшей визуализации, патч пипетки была наполнена красным красителем (декстран-тетраметилродамин, А). Contralaterally проектирование MN5 расположены на спинной поверхности mesothoracic neuromere из VNC по обе стороны от средней линии (проекция зрения конфокальной стека изображений в B). Ипсилатерально проектирование MN1-4 расположены более латерально и кпереди, связанные с MN5 (стрелки B). Пунктирной окружности между двумя MN5 изображает дендритов полета мотонейронов в нейропиля в том числе MN5 (B). GFP метки в (B) была усилена иммуногистохимического окрашивания с антителами к GFP. Подробная информация о MN5 морфологии становятся видимыми, заполнив нейрона внутриклеточно (iontophoretically) с невидимой трассирующими neurobiotin и последующие конфокальной получения изображения (C). Окрашивание сделаны видимыми со стрептавидином связаны с флуорофором. Шкала бар 30 мкм.
Рисунок 3. MN5 до и после очистки. Визуализация MN5 достигается за счет экспрессии GFP помощью UAS/GAL4система (A, C, см. этикетку). MN5 до (A, B) и после (C, D) процедуры очистки. Левая часть каждого картина представляет передних, с правой стороны представляет задней. Нейроны для записи с моют протеазы заполнены патч пипетки со сломанной чаевых. Фермент пипетки только слабо видимых (A, B, см. этикетку). Врезка в показаны расширения нижней MN5 с ферментом пипетки приближается к клетке. MN5 не видно в ярком свете перед процедурой очистки (B). Трахеи должны быть удалены, если они покрывают клетки под следствием. После процедуры очистки, контраст между клеткой и окружающей ткани более четкими (C, нижняя MN5), и клетка теперь можно увидеть в ярком свете (D). Кончика пипетки можно увидеть более ясно, когда яркий свет используется. Расширение изображает область в пунктирный квадрат с MN5 границ тела клетки окруженная пунктирной линии для лучшей идентификации. Визуализация в ярком свете часто помогает решению чистоты.
Рисунок 4. Кальций тока в MN5. Пример записи целого токи кальция клетка, как записано в MN5. По крайней мере два различных течений кальция показало, низкого напряжения активирована переходных кальция и устойчивое высокое содержание кальция напряжения тока. Токи вызвали из холдинга потенциал -90 мВ. Напряжение шагах от -90 мВ до +20 мВ были применены. Блокаторы были использованы, чтобы блокировать большинство других ионных каналов. Артефакты были опущены для ясности (для характеристики MN5 токи кальция см. Ryglewski и соавт., 2012).
Рисунок 5. Калий токов в MN5. Пример записи из всей клетки калием токи, как записано в MN5. Токи показали включают кальций активировать калиевые токи, как не антагонисты кальция были применены. Токи вызвали из хозяйствапотенциал -90 мВ для общего калия ток (A) или проведение потенциал -20 мВ для инактивации калиевых токов переходных и показывать только устойчивые калия тока (B). Напряжение шагах от -90 мВ до +20 мВ были применены в 10 мВ шагами. Offline вычитание калиевые токи, как вызвали из холдинга потенциал -90 мВ (А) и -20 мВ (B) показывают, чистой переходных токов калия (C). Напряжение натриевых каналов были заблокированы. Артефакты были опущены для ясности (для характеристики MN5 напряжений и токов кальция, калия, см. Ryglewski и Дач, 2009).
Рисунок 6. Стрельба картина выставлена на MN5. Пример записи стрельбы моделей, как вызвали в MN5 от соматических текущего инъекций (0,4 нА, черный, 0,5 нА, серый) до 200 мс. Мембранный потенциал покоя был -59 мВ. Нет блокаторы ионных каналов были использованы. (Для текущего анализа зажим MN5 стрельбышаблонов см. Дач и соавт., 2008).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При визуализации клеток с флуоресцентными белками, как GFP, важно не переэкспонировать подготовки к слишком много света. Это может привести к повреждению фото. Мы используем 100W HBO коротких дуговых ртутных ламп для освещения, и мы также используем нейтральной плотности (ND) от 0,8 (Chroma фильтры ND 0,3 и 0,5). Для того, чтобы судить о качестве очистки хорошую видимость имеет решающее значение. Таким образом, ND фильтр может быть удален в течение короткого периода примерно 20 сек несколько раз.
При применении некоторых положительных давление, тело клетки "закрылки" немного. Это позволяет судить о качестве чистоты. В отличие брюшной нервной цепочки является очень низким, и движение может быть чрезвычайно полезным для визуализации клеток. Держатель электрода, который используется для очистки процедуры (а также для патч зажим) должна быть плотно закрытой, в противном случае контролируется давление приложение не удастся. Потеря давления будет мешать успешному удалению тканей и ДебРИС и будет препятствовать гига-уплотнение образование
В случае, если на месте записи зажим патч должен быть выполнен после чистки клетки, знайте, что есть не только оболочки, окружающей брюшной нервной в целом (которая должна быть удалена для любой записи патч зажим любого центрального нейрона взрослых мух ), но сами клетки могут быть окружены оболочкой, а также. MN5, например, окружена непористые оболочки, которые можно увидеть только с кратким высокой интенсивности освещения. Кроме того, клетки могут быть расположены под трахеи. В случае, если клетка не может получить доступ, трахеи должны быть отодвинул если не сорвал с пипеткой во время чистки процедура (после того, как потянул в сторону). Вся процедура очистки должно быть сделано без натяжения тканей слишком много. Эта процедура требует подготовки. Чем лучше очистка, тем выше будет частота непосредственных гига-уплотнения (в течение 1 сек после касания клетки и относлабление положительного давления).
В зависимости от очистки протокола и распада в следующих случаях возможны: Во-первых, если клетки не были убраны достаточно хорошо, гига-печать невозможна, и эксперимент должны быть прекращены. Во-вторых, в некоторых случаях очистка является достаточно хорошим для гига-уплотнение образование, но тонкие, едва заметные остатки оболочки остается вокруг сома. Это приведет к разрыву мембраны и вызывать утечку тока различной амплитуды. Менее тяжелые последствия недостаточной очистки клетки, что некоторые остатки оболочки приводят к увеличению доступа сопротивление. В зависимости от экспериментального проектирования различных критериев качества для патча может применяться. Для контроля потенциал действия закономерностей в токовых клещей мембранный потенциал клетки должны быть здоровыми (-55 мВ или более гиперполяризованного в случае MN5), но доступ сопротивление не такой важный вопрос. Однако, когда вызывать потенциалы действия от текущих повторного доступа к инъекциясопротивление становится проблемой. Для вызывающие большой амплитудой калиевые токи, которые возникают близкие к записи сайте утечки должно быть небольшим (в случае MN5 входное сопротивление должно по более 80 МОм) и доступ сопротивление не должно быть более 15 МОм. Для пространства зажим, который необходим в напряжении записи зажим малых токов дендритных амплитуды кальция, которые происходят на некоторое расстояние от сомы никакой утечки может быть введено (для MN5 входное сопротивление должно быть выше 120 Мом) и доступ сопротивление не может быть выше, чем 12 МОм. В большинстве записей мы измеряем ток кальция с доступом сопротивлений между 8 и 10 Мом (как читать из набора на Axopatch 200B Усилитель после того, как сопротивление и целый компенсации емкости ячейки). Для каждого типа клеток должны быть записаны такие критерии качества должны быть определены индивидуально.
Использование очистки процедуру, описанную здесь, мы можем удерживать стабильные записи для приближенияtely 90 минут. Мы не наблюдаем значительный захудалый (в частности, проверяется на Cav2 и Cav3 токи кальция и Shaker, Шал, и задержка тока калия выпрямитель). Тем не менее, мы не пытались провести патч дольше и поэтому не может утверждать ли больше записей было бы невозможно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
