Summary
マウスの肝門脈や肝内胆管の3次元構造を可視化し、定量化する方法が記載されている。このレジンキャスト技術は、他の管または血管系に適用し、可能にすることができます
Abstract
臓器、血管および腺管構造の正しいアーキテクチャーは、適切な生理的機能のために不可欠であり、これらの構造体の形成と維持には、高度に制御されたプロセスである。これらの複雑な3次元構造の解析が大幅にセクションまたは染料注入試験のいずれかで2次元検査に依存してきた。これらの技術は、しかし、彼らは明らかにすることを意図している乳管や血管構造の完全かつ定量的な表現を提供することができません。あるいは、3次元プラスチック樹脂キャストの性質は、システムの永続的なスナップショットを作成し、3次元構造とネットワークを可視化し、定量化するための新規かつ広く有用な技術である。
樹脂鋳造システムの重要な利点は、血管やダクトの無傷と接続、または通信し、構造を決定する機能です。血管とDUCの構造TALネットワークは臓器の機能に不可欠であり、この手法にはいくつかの方法で、血管や管網の研究を支援する可能性を秘めています。レジンキャストは、管腔構造の正常な形態と機能アーキテクチャを分析発達形態形成の変化を識別し、正常と病気の状態間の組織構造の形態学的差異を明らかにするために使用することができる。前の仕事は、たとえば、勉強する注型用樹脂を利用している、構造1,2の2次元解析に反映されませんでしたマウスの肝内胆管系内のアーキテクチャと機能の欠陥、アルツハイマー病マウスモデル3の脳血管系の変化、門脈圧亢進性と肝硬変マウス4、未熟と大人の肺の間のラットのリンパ成熟の発達のステップ5、薬害への応答におけるラット肝臓、膵臓、腎臓の即時微小変化で門脈の異常6。
ここでは、門脈と肝内胆管に特に焦点を当て、マウスの血管や管網の3次元レジンキャストを生成する方法を提示します。これらのキャストは、組織をクリアしたり、マセレーションにより可視化することができますし、分析することができます。この手法は、実質的に任意の血管や管システムに適用することができ、3次元の乳管や血管構造の開発、機能、保守、または傷害に問い合わせるどんな研究に直接適用できるであろう。
Protocol
1。カニューレを準備
- 指先でPE10チューブの1インチの長いセクションを温めるとチューブが薄くなるように、それを伸ばす。
注意：カニューレを挿入する血管やダクトのサイズが必要なストレッチの度合いを決定します。カニューレを胆管キャストのためによく伸ばさなければなりませんが、適度に大きい門脈内に収まるように延伸することが必要になることがあります。 - ベベルチップを生成するために対角線で延伸チューブをカットします。
- 5から6インチのセグメントを作成するためにチューブのもう一方の端をカットします。
- チューブの非傾斜端に32ゲージ、½インチの皮下注射針を挿入します。
2。 PBSでシリンジを準備
- PBSで3ミリリットル注射器を埋める。
- 先に調製したPE10チューブを引っ張っ添付で注射針にシリンジをねじ込みます。
- フリックシリンジとプッシュシリンジプランジャPBSは針やチューブを埋めていることを保証し、シリンジ内に気泡がありません。
- 粘土から出状シリンジホルダにPBSを用いてプリペアドシリンジを置きます。チューブがダクト内に挿入されながら、このホルダーは、注射器を安定に保つでしょう。
3。他のセット·アップ
- 小さ な容器、 例えば 、24ウェルプレートのウェル1に触媒0.1gを計量する。
- 3ミリリットル注射器に1ミリリットル樹脂を引き出します。
注意：触媒と樹脂の相対量は、硬化時間を変更するように調整することができる。触媒05の量を減少させる一方、鋳造収縮を増加させ、あまり望ましくキャストにつながる。
注：樹脂を取り扱う際に、樹脂ヒュームの樹脂または吸入との接触を避けるための予防措置を取る。常に手袋を着用し、そのような化学ヒュームフードなど換気の良い場所で樹脂を含む手順を実行します。 - 字として使用される約5インチの5.0絹縫合糸の部分を切り取ります。
4。マウスを準備
注：このステップはまたperfoすることができます代わりにPBSの4％パラホルムアルデヒドでrmed。 4％パラホルムアルデヒドの使用は、特に小さな血管構造の、より正確なキャストで血管の整合性と結果を高める可能性があります。
5。肝外門脈または総胆管カニューレを挿入
- 肝臓から約¼インチ、門脈や胆管の下に外科的縫合結紮を渡すように湾曲したピンセットを使用しています。
- 緩い共通の結び目に糸を結びます。結び目を締めないでください。
- あなたはオープンエンドのシステムで作業している場合、それはシステムのもう一方の端に合字を結ぶ締めすると便利かもしれません。あなたは門脈から血液を排出するために総主静脈を開いている場合、門脈内の圧力を増加させ、中央の肝静脈への樹脂漏れを防止するために、その周りに合字を結ぶ。
- 縫合糸の結び目の下約¼インチ、門脈や胆管に小さなカットをする春のはさみを使用しています。このCutは中途半端な門脈や胆管の直径を通じ以上のものを貫通するべきではありません。
- 第5ピンセットを用いて、カットのサイトで門脈や胆管を保持し、胆管にチューブの傾斜端を挿入します。
- プリタイドリガチャー過ぎ、肝臓に向かってチューブの先端を押してください。
- カニューレを介してPBSを注入し、それは門脈や胆管に入っているかどうかを観察することで、カニュレーションの精度をテストします。
- 代わりにカニューレを保持するために字を締めます。
6。樹脂は門脈や肝内胆管をキャスト
- 予め測定された0.1グラムの触媒に予め測定された1ミリリットル樹脂を加え、よく混ぜる。気泡を発生させることは避けてください。
- 3 mlの注射器に戻す樹脂触媒混合物を描画します。優しくシリンジをフリックし、気泡を追い出すことにより、任意の気泡を除去する。
注：小さな構造をキャストするために、それは目から非常に小さな気泡を除去するために真空チャンバーを使用すると便利かもしれませんeは樹脂とキャストの質を向上させる。この手順を実行するための時間を考慮するためには、樹脂の硬化を遅くするために、上記示唆から触媒/樹脂比を低下させることが必要である。 - 慎重にカニューレに取り付けられた32ゲージの針を残して、樹脂含有注射器を含むPBS含有注射器を交換してください。
- 抵抗が増加し、肝臓がいっぱいになるまでゆっくりと優しく門脈や胆管に樹脂を押してください。
- 優しく肝臓をマッサージしても塗りつぶしを奨励するためにぬれた綿棒を使用してください。
- 構造からカニューレを取り外し、速やかに樹脂漏れを防ぐために字を締め直してください。
- マウスは樹脂が硬化しながら20分間室温で平らにすることができ、その後、肝臓を削除します。
- どちらかの肝臓をクリアしたり、マセレーションを続行します。
7。 その場で可視化するための明確な肝
- 4℃、ロッキングで一晩、4％パラホルムアルデヒド中で肝臓を修正しました。
- 肝臓を洗うPBS中で少なくとも4時間、ロッキングのために。必要であればこの時点では、肝葉を分離することができる。
- 室温で揺らし、少なくとも4時間ごとに50％メタノールにした後、100％メタノールで脱水する。
- ロッキング、少なくとも24時間ベンジルアルコールと安息香酸ベンジル（Babbの）の1:2溶液中で肝臓をクリアします。長い洗浄時間が必要になることがあります。肝臓は2-3日後には完全にクリアされない場合は、24時間、100％メタノールに戻って移動し、Babbのクリアを繰り返す。
- 上皮内イメージング用ガラスシャーレ内に沈めBabbの肝。
8。肝臓組織を柔らかく
- マウスから肝臓を取り出して、水で50 mlコニカルチューブに入れた。完全に樹脂硬化で1時間待ちます。必要に応じて独立した肝葉。
- 水を捨て、ガラスボトルに肝臓に移動します。 15パーセントのKOHに沈め。室温で一晩にしておきます。動かさないでください。
- 慎重にKOHを捨て、蒸留水でキャストを洗う。注：キャストは、verです壊れやすいとyは、細心の注意を払って取り扱ってください。管から流体を追加または削除するときにキャストを中断することは避けてください。
- レジンキャストがきれいになったら、そっと格納するコンテナに転送して、乾燥させるキムワイプ上に横たわっていた。
9。代表的な結果
門脈や胆管の正常なキャストは、へそから肝臓周囲に伸びる徐々に小さく枝の連続的なネットワークが表示されます。
図1は、門脈がBabbのクリア。 図1Aは、全体の左肝葉のキャストとキャストの形状とサイズを示した後、その場で可視化としてキャスト。 図1Bは同じキャストの拡大図を示し、実証を示してい肝周囲で最小の門脈枝への樹脂の浸透。
図2は、KOHミリアンペアを遂げている門脈キャストを示していますceration。 図2Aは、全体の左肝葉と図2Bは末梢小型の枝のクローズアップであることを示している。
この手法はまた、正常肝内胆管に適用され、Babbの清算とKOHマセラシオン手法1,2,7の両方を使用して公開されています。
一般的な問題がいっぱいに不完全含む、周囲のシステムまたは組織への樹脂と、オーバーフローで泡。 図3に門脈からの不完全な充填（ 図3A）、気泡（ 図3A）、樹脂のオーバーフローを認識する方法を示してい中心静脈（ 図3B）。
すべての画像はライカMZ-16のFAステレオスコープを使用していて、RETIGA 4000RカメラをQImaging取られる。
図1。肝左葉の門脈のレジンキャストをBabbのクリアされた。 A.レジンキャストは門部から肝周囲に伸びる階層的な分岐構造を示しています。レジンキャストは、青みがかった肝葉内に黄色で表示されます。 B.は近くアップ樹脂塗りが肝周囲に小さな枝に及ぶことを示しています。樹脂はクリア肝臓を通して白っぽいです。スケールバーは= 1ミリメートル。
図2肝臓の組織浸軟樹脂キャストは葉の門脈を残しました。全肝葉のA.レジンキャストは、さまざまなサイズの多くの枝を示しています。 Bのクローズアップは、肝臓の周囲に小さな枝を示しています。小さな枝の外観をフェザリングする正弦スペースの充填樹脂を表し、又は樹脂キャストに表示されない可能性はありますが、存在しなければ明らかに枝の密度が増加します。樹脂の色は白です。スケールバーは= 1ミリメートル。
図3樹脂キャストの一般的な問題。 A.左葉の門脈の不完全な充填は、肝臓周囲に拡張するために失敗し、一部またはすべてのキャストに分岐によって明らかである。このキャストはまた、連続鋳造（矢印）でブレークなど目に見える気泡が表示されます。いくつかの場所で門脈と中心静脈枝の近さのために、Bを、門脈樹脂は、多くの場合、中心静脈を入力して記入します。二つの異なる肺門枝（矢印）と異なるパターンと重複している2つの分岐構造がある場合にこれを認識することができます。技術的なエラーと真の形態学的変化とを区別するには2つの方法で行うことができます。まず、鋳造組織は、2次元解析、または他の方法に基づいて予想される構造に比較されるべきである。第二に、それはいくつかが複製を実行することが重要であり、可能な場合は、構造体を定量UREと異なる実験群と対照群間で統計学的に有意と内の形態学的変化がある場合には、再現性を決定するとするために統計分析を実行します。
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Discussion
我々は、肝臓の門脈および肝内胆管系はキャストすることができますが、この技術は若干の適応と他のほとんどすべての乳管や血管系にどのように適用できるかの具体例を記載している。前の仕事は10,11子ガモマウス1,2,7-9を含む複数種、、、ウサギ12,13、犬14、豚15、および鼻腺14を含む多くの器官における本手法の有効性を実証してきました心臓16、12,13膀胱、肝臓1,2,7,8。これらのキャストは異なる発達段階5、または遺伝や環境の変化や影響1-4の構造上の効果で同じ構造、同じ組織内の複数のシステム（例えば、門脈、胆管）を比較するために使用することができ、6,7。種や臓器全体にこの技術の幅広いアプリケーションは、sのための非常に貴重なツールを注型用樹脂を作る血管および腺管構造の形態をtudyingと大幅動物疾患モデルで、私たちのこれらの構造の正常な機能の知識だけでなく、それらがどのように影響されるか、またはそれらがどのように影響するか臓器を増加させる可能性を秘めています。
3次元のキャストを作成するための樹脂を使用することで、乳管や血管系の恒久的なスナップショットを提供し、同様の技術に比べていくつかの利点を持っています。まず、キャストは、墨又は類似のインク注入を上回る利点を提供し、マセラシオン後のスタンドアロン構造として分析することができます。第二に、構造物の耐久性は、分析のしやすさを向上させます。最後に、Babbの清算手続きに耐えるMercox IIの樹脂の能力があっても、大規模または密集組織内のインサイツの構造を視覚化するユニークな能力を可能にします。
異なる特性を持つ利用可能な樹脂のいくつかの種類があります。 Mercox IIは、その多くのADVのためにこの技法のために選ばれましたantages; Mercox IIはそれは小さな末梢門脈、胆管枝を浸透させる、低粘度であり、それは、スタンドアロン浸軟キャストを分析するための必須の、室温での迅速かつ完全な硬化を持っている、それは硬化時に最小限の収縮を持っており、それBabbの組織クリアに耐えることができます。樹脂、Microfil（Flowtech、カーバー、MA）のもう一つのタイプはいくつか発表された研究8,9,15で使用されています。比較的、Microfilは室温で完全に硬化し、組織のクリアを通じて最高の可視化されていません。 Microfilは門脈のキャスト以前ethanolmethylサリチル酸8で10％ホルマリン固定、その後の決済を通じて分析されている。
樹脂添加剤は、キャストの可視化の追加メソッドを提供することができます。着色染料、蛍光分子、またはマイクロスフェアのほか、分析を強化することができます。配慮が選ばれた色素分子がINTEを貫通するのに十分に小さいことを確認するために、しかし、注意しなければならない彼らはかなり彼らが組織のクリアまたはマセラシオン、彼らは分析の目的のメソッドと互換性があり、そのどちらかに耐えていることを、樹脂の性質を変えない又、作業血管や腺管構造。樹脂添加剤を選択すると、特定のアプリケーションに大きく依存します：例えば、マイクロスフェア（Molecular Probes社）は、通常の正弦アーキテクチャの研究が、門脈体循環シャントの発達を調査するための完璧なツールに適していません、肝類洞を通過するには大きすぎる、遺伝的に改変されたマウスモデル8で、微小球を収容するのに十分な大きさである。
最後に、レジンキャスト分析はどちらかクリアされるか、漬けキャストで行うことができます。 Babbのクリアされたキャストは、それが内部に存在する器官に関連するシステムの構造を測定するのに有用である。 KOH-浸軟のキャストは、複数の方法で分析することができます。これまでの研究では、走査型電子顕微鏡を使用している（SEM）の微小循環網や血管構造12,13,17を可視化する。キャストはまた、枝番号、直径、microcomputed断層撮影（microCT）1,15,18、19,20の使用を持つボリュームの定量化することができる。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、分子医学におけるHHMI /バンダービルト大学の証明書プログラムを通じてハワードヒューズ医学研究所（HHMI）からTJWにSSHで接続するには、米国立衛生研究所（NIH）からの助成金（R01-DK078640）、（GRDOT56006779）によってサポートされていましたバンダービルト糖尿病研究·研修センター（P30〜DK020593）とコア·サービスを提供するバンダービルト消化器病研究センター（P30〜DK058404）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
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