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Medicine

3-Dimensional Resin Casting und Imaging of Mouse Pfortader oder intrahepatische Gallengang-System

doi: 10.3791/4272 Published: October 25, 2012

Summary

Ein Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung der 3-dimensionalen Struktur von Maus Pfortader oder intrahepatischen Gallengang wird beschrieben. Dieses Harz gegossenen Technik kann auch auf andere duktalen oder vaskulären Systemen angewendet werden und ermöglicht

Abstract

In Organen, ist die richtige Architektur von vaskulären und duktalen Strukturen für die richtige physiologische Funktion unentbehrlich, und die Bildung und Aufrechterhaltung dieser Strukturen ist ein hoch regulierten Prozess. Die Analyse dieser komplexen 3-dimensionalen Strukturen hat sich stark auf beiden 2-dimensionalen Prüfung im Bereich oder auf Farbstoffinjektion Studien abhängt. Diese Techniken sind jedoch nicht in der Lage, eine vollständige und quantifizierbare Darstellung der duktalen oder Gefäßstrukturen sie vorgesehen sind aufzuklären bereitzustellen. Alternativ erzeugt der Natur der 3-dimensionalen Kunststoffharz Abgüsse eine permanente Momentaufnahme des Systems und ist ein neuartiges und nützliches Verfahren weithin zur Visualisierung und Quantifizierung von 3-dimensionalen Strukturen und Netze.

Ein entscheidender Vorteil des Harzes Gießsystem ist die Fähigkeit, die intakt und verbunden oder kommuniziert, Struktur eines Blutgefäßes oder Kanal zu bestimmen. Die Struktur von vaskulären und ductal-Netzwerke sind entscheidend für Organfunktion, und diese Technik hat das Potential Studie von vaskulären und Duktus-Netzwerke in mehrfacher Hinsicht zu unterstützen. Gießharz kann verwendet werden, um normale Morphologie und funktionelle Architektur eines luminalen Struktur analysieren, Entwicklungsstörungen morphogenetischen Veränderungen und aufzudecken morphologischen Unterschiede im Gewebe Architektur zwischen Normal-und Krankheitszuständen werden. Frühere Arbeiten haben Harz Gießen zu studieren Verwendete beispielsweise architektonischen und funktionalen Mängeln in der Maus intrahepatischen Gallengang System, die nicht in 2-dimensionale Analyse der Struktur reflektiert wurden 1,2, Veränderungen im Gehirn Gefäßsystem eines Alzheimer Mausmodell 3 , Pfortader Abnormalitäten in Portal hypertensiven und Leberzirrhose Mäusen 4, Entwicklungsschritte in Ratten lymphatischen Reifung zwischen unreifen und adulte Lunge 5, sofortige mikrovaskulären Veränderungen in der Rattenleber, Pankreas und Niere in Antwort auf chemische Schädigung in6.

Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Erzeugung einer 3-dimensionalen Resin einer Maus vaskuläre oder Milchgangsystem, die speziell auf die Pfortader und intrahepatischen Gallengang. Diese Umwandlungen können durch Löschen oder Mazerieren des Gewebes visualisiert werden und kann dann analysiert werden. Diese Technik kann auf nahezu jedem Gefäß-oder duktalen System angewendet werden und wäre direkt anwendbar für jeden Studie anfragenden in die Entwicklung, Funktion, Wartung, oder der Verletzung eines 3-dimensionalen duktalen oder vaskuläre Struktur.

Protocol

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Ein. Bereiten Kanüle

  1. Warm eine 1-Zoll langen Abschnitt der PE10-Schlauch mit Ihren Fingerspitzen und strecken, so dass der Schlauch dünn wird.
    Anmerkung: die Größe des Gefäßes oder Gangs zu kanüliert werden den Grad der Dehnung zu bestimmen. Die Kanüle muss Gallengang wirft gut gedehnt werden kann aber nur dann erforderlich, bis mäßig gedehnt werden, um innerhalb der größeren Pfortader angepasst werden.
  2. Schneiden Sie das gestreckte Schlauch an einer Diagonale eine abgeschrägte Spitze zu generieren.
  3. Schneiden Sie die andere Kante des Schlauchs an einen 5-6 Zoll-Segment zu schaffen.
  4. Einfügen einer 32 Gauge, ½ Zoll Injektionsnadel in die nicht abgeschrägte Kante des Schlauchs.

2. Bereiten Spritze mit PBS

  1. Füllen Sie eine 3 ml Spritze mit PBS.
  2. Schrauben Sie die Spritze auf die Injektionsnadel mit angeschlossenem gezogen PE10 Schlauch zuvor vorbereitet.
  3. Flick Spritze und Push Spritzenkolben, dass PBS zu gewährleisten, hat die Nadel und Schläuche gefülltes gibt keine Luftblasen in der Spritze.
  4. Legen Sie die gefüllte Spritze mit PBS in eine Spritze-Halter aus Modelliermasse geformt. Diese Halterung hält die Spritze stetig, während der Schlauch in den Kanal eingeführt wird.

3. Andere Set-up

  1. Wiegen 0,1 g Katalysator in einen kleinen Behälter, z. B. eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
  2. Ziehen Sie 1 ml Harz in eine 3 ml Spritze.
    Anmerkung: die relativen Mengen des Katalysators und des Harzes eingestellt werden, um Aushärtungszeit zu verändern. Sinkende Menge des Katalysators kann jedoch erhöht gegossen Schrumpfung und führen zu einer weniger wünschenswert Stimmen.
    Hinweis: Beim Umgang mit Harz, Vorsichtsmaßnahmen ergreifen, um Kontakt mit Harz oder Einatmen der Dämpfe Harz zu vermeiden. Tragen Sie immer Schutzhandschuhe und führen Sie die Schritte mit Harz in einem gut belüfteten Raum, wie einer chemischen Abzugshaube
  3. Schneiden Sie ein Stück von 5,0 Seidennaht von ca. 5 cm als einer Ligatur verwendet werden.

4. Bereiten Maus

Sacrifice erwachsenen Maus. Legen Sie mit der Maus auf den Rücken und öffnen Sie die Bauchhöhle.
  • Lay Maus auf Binokular Plattform. Positionieren Sie eine 15 ml konischen Röhrchen senkrecht der Unterseite der Maus, um die Sichtbarkeit und Zugänglichkeit der Leber zu erhöhen.
  • Befeuchten Sie ein Wattestäbchen mit PBS und verwenden Sie es, um die Leber nach oben und weg von Ihnen, um die dorsale Ansicht der Leber zusammen mit dem extrahepatischen Pfortader oder Choledochus Setzen kippen.
  • Für Pfortader Abgüsse, können Sie verhindern die Blutgerinnung durch Spülen der Vene mit Raumtemperatur PBS. Bringen Sie eine Nadel in eine 3 ml Spritze mit PBS gefüllt und Nadel in extrahepatischen Pfortader so weit von der Leber, wie Sie können. Schieben PBS durch in die Pfortader. Machen Sie einen nick in der gemeinsamen Cardinalvene Blut abfließen. Benutzen Sie einen nassen Wattestäbchen zur Massage der Leber, verbessert Blut Entwässerung. Dieser Schritt ist für den Gallengang empfohlen und eventuell nicht notwendig, dass alle Gefäßsystems.
    Hinweis: Dieser Schritt kann auch perfo werdenRMED mit 4% Paraformaldehyd anstelle von PBS. Verwendung von 4% Paraformaldehyd kann vaskuläre Integrität und führen zu einer genaueren gegossenen erhöhen, speziell von kleineren Gefäßstrukturen.
  • 5. Kanülieren extrahepatischen Pfortader oder Choledochus

    1. Verwenden gekrümmten Zange, um das chirurgische Nahtmaterial Ligatur unterhalb der Pfortader oder Gallengang passieren, ungefähr ¼ Zoll von der Leber.
    2. Binden Sie die Naht in einem lockeren gemeinsamen Knoten. Ziehen Sie die Knoten.
    3. Wenn Sie mit einem offenen System arbeiten, kann es hilfreich sein zu binden und ziehen eine Ligatur am anderen Ende des Systems. Wenn Sie die gemeinsame Cardinalvene geöffnet haben, um das Blut aus der Pfortader abfließen, binden eine Ligatur um ihn herum, um den Druck in der Pfortader zu erhöhen und zu verhindern, Harz Leckage in der zentralen Lebervene.
    4. Verwenden Frühjahr Schere einen kleinen Schnitt in der Pfortader oder Gallengang, etwa ¼ Zoll unter der Naht Knoten zu machen. Diese cut sollte dringen nicht mehr als der Hälfte des Durchmessers der Pfortader oder Gallengang.
    5. Mit # 5 Zangen, halten Sie die Pfortader oder Gallengang an der Stelle des Schnittes und legen abgeschrägte Ende des Schlauches in den Gallengang.
    6. Schieben Spitze des Schlauchs an der Pre-gebundenen Blattschraube und zur Leber.
    7. Test für Kanülierung Genauigkeit durch die Injektion von PBS durch die Kanüle und beobachten, um zu sehen, ob es die Pfortader oder Gallengang gelangt.
    8. Ziehen Sie die Ligatur um die Kanüle in Position zu halten.

    6. Resin Cast der Pfortader oder intrahepatischen Gallengang

    1. Fügen abgemessene 1 ml Harz abgemessene 0,1 g Katalysator und gründlich mischen. Vermeiden Erzeugung von Luftblasen.
    2. Zeichnen Harz-Katalysator-Gemisch wieder in den 3 ml Spritze. Entfernen Sie alle Luftblasen durch leichtes Ausklopfen der Spritze und Vertreibung Blasen.
      Hinweis: zum Gießen kleine Strukturen, kann es hilfreich sein, um eine Vakuumkammer verwenden, um sehr kleine Luftblasen aus th entfernene Harz und verbessern Gussqualität. Um Zeit für diesen Schritt zu ermöglichen, wird es erforderlich sein, den Katalysator / Harz-Verhältnis von dem oben vorgeschlagen, um Harzhärtung verlangsamen verringern.
    3. Vorsichtig wieder PBS-haltigen Spritze mit Harz enthaltenden Spritze, so dass die 32-Gauge-Nadel an der Kanüle.
    4. Langsam und vorsichtig Harz in die Pfortader oder Gallengang, bis Widerstand ansteigt und Leber gefüllt ist.
    5. Verwenden nassen Wattestäbchen sanft massieren Leber und fördern eine gleichmäßige Füllung.
    6. Entfernen Kanüle aus der Struktur und schnell wieder anziehen Ligatur Harz zu verhindern.
    7. Lassen Maus lag bei Raumtemperatur Wohnung für 20 min, während das Harz härtet, dann entfernen Sie Leber.
    8. Fahren Sie mit dem entweder für die Beseitigung oder Mazeration der Leber.

    7. Klare Leber für Visualisierung in situ

    1. Fix die Leber in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C, Schaukeln.
    2. Waschen Sie die Leberin PBS für mindestens vier Stunden, Schaukeln. An dieser Stelle können Sie trennen die Leberlappen, falls gewünscht.
    3. Entwässern in 50% Methanol und anschließend in 100% Methanol für mindestens vier Stunden jeden, Schütteln bei Raumtemperatur.
    4. Deaktivieren Sie die Leber in einer 1:2-Lösung von Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB) für mindestens 24 Stunden, Schaukeln. Längere Waschzeiten notwendig sein. Wenn die Leber nicht vollständig nach 2-3 Tagen klar, wieder auf 100% Methanol für 24 Stunden zu verschieben und wiederholen BABB Lichtung.
    5. Tauchen Leber in BABB in einem Glas Petrischale für die Bildgebung in situ.

    8. Mazerieren Lebergewebe

    1. Entfernen der Leber von Mäusen und in einem 50 ml konischen Röhrchen mit Wasser. Warten Sie 1 Stunde zur vollständigen Aushärtung. Separate Leberlappen falls gewünscht.
    2. Gießen Sie das Wasser und bewegen Leber zu einer Glasflasche. Tauchen in 15% KOH. Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur. Nicht rocken.
    3. Vorsichtig abgießen KOH und waschen Besetzung in destilliertem Wasser. Hinweis: Die Besetzung ist very zerbrechlich und sollte mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Verhindern, dass die Besetzung beim Hinzufügen oder Entfernen von Flüssigkeit aus dem Rohr.
    4. Wenn Harz gegossenen sauber ist, sanft auf einem Kimwipe zum Trocknen lag, dann zu einem Behälter abgelegt werden übertragen.

    9. Repräsentative Ergebnisse

    Eine erfolgreiche Besetzung der Pfortader oder Gallengang zeigen ein kontinuierliches Netzwerk von immer kleiner Zweige, die sich aus dem Hilus der Leber Peripherie.

    Abbildung 1 zeigt eine Pfortader gegossen als visualisierte in situ nach BABB Lichtung. 1A die Besetzung des gesamten linken Leberlappen und die Form und Größe der Besetzung zeigt. Abbildung 1B zeigt eine Nahaufnahme der gleichen Besetzung, was die Eindringen des Harzes in die kleinsten Pfortaderäste an der Leber Peripherie.

    Abbildung 2 zeigt eine Pfortader Besetzung, KOH ma durchlaufen hatceration. 2A zeigt die gesamte linke Leberlappen und 2B ist eine Nahaufnahme der kleinen peripheren Äste.

    Diese Technik wurde auch erfolgreich auf die intrahepatischen Gallengang eingesetzt und veröffentlicht sowohl mit dem BABB Clearing und KOH Mazeration Techniken 1,2,7.

    Häufige Probleme sind unvollständig ausfüllt, demonstriert Blasen in dem Harz, und Überlauf in umgebenden Systemen oder Geweben. Abbildung 3, wie eine unvollständige Füllung (3A), Blasen (3A) und einen Überlauf von Harz aus der Pfortader zu erkennen, um die Zentralvene (3B).

    Alle Bilder sind aufgenommen mit einem Leica MZ 16 FA Stereoskop und QImaging RETIGA 4000R Kamera.

    Abbildung 1
    Abbildung 1. BABB geräumten Resin der Leber links lobe Pfortader. A. Resin gegossen zeigt eine hierarchische Verzweigung Struktur, die sich aus dem Hilus der Leber Peripherie. Resin erscheint in gelber Farbe in blau getönt Leberlappen. B. Eine Nahaufnahme zeigt, dass Harz zu füllen, um kleine Äste in der Leber Peripherie erstreckt. Resin ist weißlich über gelöscht Leber. Maßstab = 1 mm.

    Abbildung 2
    Abbildung 2. Tissue-mazerierten Resin der Leber links lobe Pfortader. A. Resin ganzer Leberlappen gegossen zeigt viele Niederlassungen in unterschiedlichen Größen. B. Close-up zeigt, kleine Äste in der Peripherie der Leber. Weiche Auftreten von kleinen Zweigen stellt Harzfüllung von sinusförmigen Räume und kann oder kann nicht auf Harz sichtbar wirft und die scheinbare Niederlassung Dichte zu erhöhen, falls vorhanden. Resin ist in der Farbe weiß. Maßstab = 1 mm.


    Abbildung 3. Gemeinsame Probleme mit Harz Würfe. A. Eine unvollständige Füllung des linken Lappens Pfortader ist durch einige oder alle Stimmen Niederlassungen nicht gelingt, auf die Leber Peripherie erweitern offensichtlich. Diese Besetzung zeigt auch Blasen, sichtbar als Pausen in der kontinuierlichen Besetzung (Pfeil). B. Durch die Nähe der Pfortader und zentrale Vene Niederlassungen in einigen Orten wird die Pfortader Harz oft geben und füllen Sie die zentrale Vene. Dies erkennt man, wenn zwei unterschiedliche hilar Niederlassungen (Pfeile) und zwei verzweigte Strukturen, die unterschiedliche Muster und Überschneidungen haben sollen. Unterscheidung zwischen technischen Fehlern und wahre morphologische Veränderungen kann auf zwei Arten erfolgen. Erstens sollte das Gußgefüge der Struktur erwartet bezogen auf 2-dimensionale Analyse oder andere Verfahren verglichen werden. Zweitens ist es wichtig, führen mehrere Wiederholungen, und wenn möglich, zu quantifizieren structure und statistische Analysen, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen und wenn es eine statistisch signifikante morphologische Veränderung zwischen und in verschiedenen experimentellen und Querlenker.

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    Discussion

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    Wir haben die spezifischen Beispiele, wie die Pfortader und intrahepatische Gallengang Systemen der Leber umgewandelt werden kann beschrieben, aber diese Technik kann auf praktisch jedem anderen Duktus oder Gefäßsystem mit geringen Anpassungen aufgebracht werden. Frühere Arbeiten haben die Machbarkeit dieser Technik in mehreren Arten, darunter Maus 1,2,7-9, Entlein 10,11, Kaninchen 12,13, Hund 14 und Schwein 15, und in vielen Organen, einschließlich nasaler Stopfbuchse 14 gezeigt, Herz 16, Blase 12,13 und Leber 1,2,7,8. Diese Umwandlungen lassen sich mehrere Systeme (z. B. der Pfortader und Gallengang) innerhalb des gleichen Gewebes der gleichen Struktur in unterschiedlichen Entwicklungsstadien 5, oder die Wirkung auf einer Struktur von genetischen Veränderungen oder Umweltschäden oder Einflüsse 1-4 vergleichen , 6,7. Die breite Anwendung dieser Technik über Arten und Organen macht Harz Gießen ein wertvolles Hilfsmittel für studying die Morphologie von vaskulären und Gangstrukturen und hat das Potential, stark erhöhen unser Wissen über die normale Funktion dieser Strukturen und wie sie betroffen sind, oder wie sie sich auf ein Organ, in Tierkrankheitsmodellen.

    Die Verwendung von Harz, um 3-dimensionale Abgüsse erstellen stellt eine dauerhafte Momentaufnahme einer duktalen oder Gefäßsystem und hat mehrere Vorteile gegenüber ähnlichen Techniken. Erstens kann der gegossene als Stand-alone-Struktur nach der Mazeration analysiert werden, bietet einen Vorteil gegenüber Tusche oder Tinte ähnlich Injektionen. Zweitens erhöht die Dauerhaftigkeit des Aufbaus die Leichtigkeit der Analyse. Neue, ermöglicht die Fähigkeit der Mercox II Harz die BABB Clearingverfahren standhalten für eine einzigartige Fähigkeit, um eine Struktur in situ noch in großen oder dichtem Gewebe zu visualisieren.

    Es gibt mehrere Arten von Harz mit unterschiedlichen Eigenschaften. Mercox II hat für diese Technik wurde für seine vielen adv gewähltantages; Mercox II hat eine niedrige Viskosität, so dass sie kleine peripheren Pfortader und Gallenwege Zweige durchdringen, es schnell und vollständigen Aushärtung bei Raumtemperatur hat, die für die Analyse der eigenständigen mazerierten gegossen, es hat minimale Schrumpfung beim Härten und hält BABB Gewebe Lichtung. Eine andere Art von Harz, Microfil (Flowtech, Carver, MA), wurde in mehreren Studien veröffentlicht 8,9,15 verwendet worden. Vergleichsweise ist Microfil nicht vollständig heilen bei Raumtemperatur und wird am besten durch das Gewebe Lichtung. Microfil wirft der Pfortader zuvor über 10% Formalin-Fixierung und anschließender Reinigung mit ethanolmethyl Salicylat 8 analysiert.

    Harzadditive kann zusätzliche Methoden der gegossenen Visualisierung; Zusatz von Farbstoffen, Fluoreszenzmolekülen, oder Mikrokugeln können Analyse zu verbessern. Überlegung ist darauf jedoch, um sicherzustellen, dass die Farbstoffmoleküle klein genug gewählt, um die Integration zu durchdringennded vaskuläre oder duktalen Struktur, dass sie nicht wesentlich verändern die Eigenschaften des Harzes, dass sie in der Lage, entweder Gewebe Clearing oder Mazeration, und dass sie kompatibel sind mit der gewünschten Methode der Analyse standhalten. Die Wahl Harzadditiven wird stark davon abhängen, die spezifische Anwendung: zum Beispiel, sind Mikrosphären (Molecular Probes) zu groß, um durch die Leber Sinusoide passieren, was sie ungeeignet für die Untersuchung der normalen sinusförmigen Architektur, sondern eine perfekte Werkzeug, um die Entwicklung von portosystemischen Shunts untersuchen , die groß genug sind, um Mikrokugeln unterzubringen, in einem genetisch veränderten Mausmodell 8.

    Schließlich können Resin Analyse entweder gelöscht oder mazeriert Würfe durchgeführt werden. BABB geräumten Abgüsse sind nützlich, um die Struktur eines Systems zu messen, wie es an das Organ, in dem es sich befindet, betrifft. KOH-mazerierten Umwandlungen können in vielfältiger Weise analysiert werden. Frühere Studien haben eingesetzt Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zu visualisieren Mikrozirkulation Netzwerke und Gefäßstruktur 12,13,17. Umwandlungen können auch für Zweig Anzahl, Durchmesser und Volumen unter Verwendung microcomputed Tomographie (MicroCT) 1,15,18, 19,20 quantifiziert werden.

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    Disclosures

    Keine Interessenskonflikte erklärt.

    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (NIH), SSH (R01-DK078640), aus dem Howard Hughes Medical Institute (HHMI) durch die HHMI / Vanderbilt University Certificate Program in Molecular Medicine, um TJW (GRDOT56006779), die unterstützt Vanderbilt Diabetes Research and Training Center (P30-DK020593) und der Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404), die Core Services.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    PE10 polyethylene tubing Fisher Scientific 1417012P
    5-0 surgical black braided silk Roboz Surgical SUT-15-1
    Steriject 32 G x 13 mm needle Air-tite TSK3213
    Spring scissors Fine Science Tools 15000-08
    Number 5 forceps Fine Science Tools 91150-20
    Mercox II kit Ladd Research 21247
    Benzyl alcohol Fisher Scientific 1816-04 Only required for BABB-clearing
    Benzyl benzoate MP Biomedicals, LLC 154839 Only required for BABB-clearing
    Phosphate-buffered saline (PBS)
    Modeling clay
    Scale
    Laboratory scissors
    15 ml cap polypropylene tubes
    4% paraformaldahyde
    15% potassium hydroxide (KOH) Only required for maceration
    Razor blade
    100% methanol
    3 ml luer lock syringe

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System. J. Vis. Exp. (68), e4272, doi:10.3791/4272 (2012).More

    Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System. J. Vis. Exp. (68), e4272, doi:10.3791/4272 (2012).

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