Summary
시각화 및 마우스 간문맥 정맥 또는 intrahepatic의 담즙 덕트의 3 차원 구조를 정량화하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 수지 주조 기술은 다른 ductal이나 혈관 시스템에 적용이 가능 할 수 있습니다
Abstract
장기에 혈관과 ductal 구조의 올바른 아키텍처는 적절한 생리적 기능에 필수 불가결하며, 이러한 구조의 형성 및 유지 보수는 매우 규제 과정입니다. 이러한 복잡한 3 차원 구조의 분석은 크게 섹션 또는 염료 분사 연구에서 중 2 차원 검사에 의존하고 있습니다. 이 기술은, 그러나, 그들은 명료하게하다하기위한 것입니다 ductal 또는 혈관 구조의 완벽하고 객관적 표현을 제공 할 수 없습니다. 또한, 3 차원 플라스틱 수지 캐스트의 성격은 시스템의 영구적 인 스냅 샷을 생성하고 3 차원 구조와 네트워크를 시각화하고 정량화를위한 소설 널리 유용한 기술입니다.
수지 주조 시스템의 중요한 장점은 혈관이나 덕트의 온전하고 연결 또는 통신, 구조를 결정하는 기능입니다. 혈관과 둑의 구조할거야, 네트워크는 장기의 기능에 중요한 있으며,이 기술은 여러 가지 방법으로 혈관과 ductal 네트워크의 연구에 도움을 수있는 가능성이 있습니다. 수지 주조는 luminal 구조의 일반적인 형태 및 기능 구조를 분석 발달 morphogenetic 변경 사항을 식별하고 정상과 질병 상태 사이의 조직 구조의 형태학의 차이를 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 이전 작업은 예를 들어, 공부 주조 수지를 활용했다 구조 1,2의 2 차원 분석에 반영되지 않은 마우스 intrahepatic의 담즙 덕트 시스템 내의 건축 및 기능 결함, 알츠하이머 병 마우스 모델 3 뇌 vasculature의 변경 , 포털 고혈압과 cirrhotic 마우스 4,지나 성인 폐 사이 쥐 림프 성숙의 발달 단계 5, 화학 부상에 대한 응답으로 쥐 간, 췌장 및 신장의 즉각적인 microvascular 변화에 포털 정맥 이상6.
여기 우리는 포털 정맥과 intrahepatic의 담즙 덕트에 특별히 초점을 맞추고 마우스 혈관이나 ductal 네트워크의 3 차원 수지 주물을 생성하는 방법을 제시한다. 이 캐스트는 조직을 삭제하거나 macerating으로 시각화 할 수 있으며 다음 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 거의 모든 혈관이나 ductal 시스템에 적용 할 수 있으며 3 차원 ductal 또는 혈관 구조의 개발, 기능, 유지 보수, 또는 부상에 문의하는 연구에 직접 적용 할 것입니다.
Protocol
1. 캐뉼라 준비
- 손끝으로 PE10 튜브의 1 인치 긴 부분을 따뜻하게하고 튜브는 얇은 될 수 있도록 그것을 스트레칭.
참고 : cannulated 할 용기 또는 덕트의 크기가 필요한 스트레칭에 노출 된 정도를 확인하는 것입니다. 캐뉼라는 담즙 덕트 캐스트에 대해 잘 늘어나해야 만 적당히 큰 포털 정맥 내에 맞게 늘어 될해야 할 수 있습니다. - beveled 팁을 생성하는 대각선에서 신장 튜브를 잘라.
- 5-6 인치 세그먼트를 만들 수있는 튜브의 다른 가장자리를 잘라.
- 튜브의 비 beveled 가장자리에, ½ 인치의 피하 주사기 바늘을 32 게이지를 삽입합니다.
2. PBS로 주사기 준비
- PBS로 3 ML의 주사기를 채우십시오.
- 첨부과 피하 주사기 바늘에 주사기를 망치는 PE10 튜브는 이전에 다음 ID로 준비 꺼냈다.
- 그 PBS을 위해 영화의 주사기와 푸시 주사기 플런저는 바늘과 튜브 등을 작성하고 있습니다주사기에 공기 거품이 없습니다.
- 모델링 점토 밖으로 모양의 주사기 보유자에 PBS로 준비된 주사기를 삽입합니다. 튜브가 덕트에 삽입되어있는 동안이 홀더는 주사기는 꾸준히 할 것입니다.
3. 기타 설정
- 작은 용기, 예를 들어, 24 잘 접시의 잘 하나에 촉매 0.1 g을 무게.
- 3 ML의 주사기에 1 ML 수지를 당겨.
참고 : 촉매와 수지의 상대적 금액은 경화 시간을 변경 조정할 수 있습니다. 촉매 5 월의 양을 감소하지만, 수축을 캐스팅하고 덜 바람직 캐스트로 이어질 향상시킬 수 있습니다.
참고 : 수지를 취급 할 때, 수지 상당량의 연료를 수지 또는 흡입과 접촉을 피하기 위해 예방 조치를. 항상 장갑을 착용하고 화학 퓸 배출 후드 등 환기가 잘되는 지역에서 수지를 포함한 단계를 수행 - 끈으로 사용할 약 5 인치 5.0 실크 봉합 한 조각을 잘라 버릴거야.
4. 마우스를 준비합니다
참고 :이 단계는 perfo 수대신 PBS의 4 % paraformaldehyde로 rmed. 4 % paraformaldehyde를 사용 특별히 작은 혈관 구조의,보다 정확한 주물에 혈관 무결성 및 결과를 증가시킬 수있다.
5. Extrahepatic 포탈 정맥 혹은 일반적인 담즙 덕트를 Cannulate
- 간에서 약 ¼ 인치, 포털 정맥 또는 담즙 덕트 아래에 수술 봉합 봉합사를 통과하는 곡선 포셉을 사용합니다.
- 느슨한 일반적인 매듭으로 봉합을 묶어주세요. 매듭을 조여하지 마십시오.
- 당신이 개방형 시스템으로 작업하는 경우, 시스템의 다른 쪽 끝에서 끈을 묶고 강화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 당신은 포털 정맥에서 혈액을 배출하는 일반적인 기본 정맥를 개설 한 경우, 포털 정맥 내 압력을 증가시키고 중앙 간정맥에 수지 누설을 방지하기 위해 주위 끈을 묶어.
- 약 ¼ 인치 봉합 매듭 아래의 포털 정맥 또는 담즙 덕트의 작은 컷을 만들기 위해 봄 가위를 사용합니다. 이 세제곱t는 중간 포털 정맥 또는 담즙 덕트의 직경을 통해보다 더 이상 침투 없습니다.
- # 5 포셉을 사용하여 컷의 사이트에서 포털 정맥 또는 담즙 덕트를 개최하고 담즙 덕트에 튜브의 beveled 끝을 삽입합니다.
- 미리 묶어 끈 과거와 간 대한 튜브의 끝을 밀어 넣습니다.
- 캐뉼라를 통해 PBS를 주입하고 포털 정맥 또는 담즙 덕트를 입력하는지 관찰하여 cannulation 정확도를 테스트합니다.
- 장소에 캐뉼라를 잡아 끈을 조인다.
6. 수지는 포털 정맥 또는 Intrahepatic의 담즙 덕트를 던져
- 사전 측정 된 0.1 g의 촉매로 미리 측정 한 ML 수지를 추가하고 철저하게 섞는다. 기포를 생성하지 마십시오.
- 3 ML의 주사기에 다시 수지 촉매 혼합물을 그립니다. 부드럽게 주사기를 flicking과 거품을 추방하여 기포를 제거합니다.
참고 : 작은 구조를 주조을 위해, 그것은 일의 매우 작은 기포를 제거하기 위해 진공 챔버를 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다전자 수지와 주조의 품질을 향상시킬 수 있습니다. 이 단계를 수행 할 시간을 허용하기 위하여, 수지 경화를 늦출하기 위해 위의 제안 그에서 촉매 / 수지 비율을 감소 할 필요가 있습니다. - 조심스럽게 삽입 관에 부착 된 32 게이지 바늘을두고, 수지 - 함유 주사기와 PBS 함유 주사기를 교체하십시오.
- 저항 증가 및 간이 가득 될 때까지 천천히 부드럽게 포털 정맥 또는 담즙 덕트에 수지를 밀어.
- 부드럽게 간을 마사지하고도 채움을 장려하기 위해 서부 유럽 표준시 면봉을 사용합니다.
- 구조에서 캐뉼라를 제거하고 빠르게 수지 유출을 방지하기 위해 끈을 다시 조입니다.
- 수지 치료 한 다음 간을 제거하는 동안 마우스를 20 분 동안 실온에서 평면 레이아웃 할 수 있습니다.
- 중 간을 삭제하거나 macerating로 진행합니다.
7. 현장의 시각화에 대한 삭제 간
- 4 ° C, 요동에서 밤새 4 % paraformaldehyde에 간 문제를 해결했습니다.
- 간을 씻어최소한 네 시간, 흔들를위한 PBS 인치 원하는 경우이 시점에서, 당신은 간 엽 (叶)을 분리 할 수 있습니다.
- 실온에서 흔들, 최소한 네 시간마다 50 %의 메탄올을 입력 한 다음 100 % 메탄올의 탈수.
- 최소 24 시간, 락에 대한 벤질 알코올 및 벤질 벤조산 (BABB)의 1시 2분 솔루션에 간을 해제합니다. 긴 세탁 시간이 필요 할 수 있습니다. 간 완전히 2~3일 이후 명확하지 않을 경우, 다시 24 시간에 100 % 메탄올로 이동 BABB 개간를 반복합니다.
- 현장에서 영상의 유리는 배양 접시에 BABB에 잠기 간.
8. 간 조직을 물에 담가서 부드럽게
- 마우스에서 간을 제거하고 50 ML 원뿔 튜브를 물에 넣어. 전체 수지 경화에 1 시간을 기다립니다. 경우 별도의 간 엽이 원하는.
- 물을 부어과 유리 병으로 간을 이동합니다. 15% 코에 잠기. 실온에서 하룻밤 둡니다. 락하지 마십시오.
- 조심스럽게 코를 부어하고 증류수에 깁스를 씻는다. 참고 : 캐스트 버전입니다Y되기 쉬운는 극단적 인주의해서 취급해야합니다. 관에서 유체를 추가하거나 제거 할 때 캐스트를 방해하지 마십시오.
- 수지 캐스트가 깨끗하면, 부드럽게 건조 할 수있는 Kimwipe에 누워 다음, 저장 할 수있는 용기에 전송할 수 있습니다.
9. 대표 결과
포털 정맥 또는 담즙 덕트의 성공적인 캐스트 hilum에서 간 주변에 확장 점차적으로 작은 가지의 연속 네트워크를 표시합니다.
그림 1은 포털 정맥은 BABB 삭제 해보세요. 그림 1A는 전체 왼쪽 간 엽의 주물과 주물의 모양과 크기를 보여줍니다 후 원위치에서 시각화에 캐스팅. 그림 1b는 같은 캐스트의 근접보기를 보여을 보여주는 표시 간 주변에있는 작은 포털 정맥 지점에 수지의 침투.
그림 2는 코 교장 마쳤습니다 포털 정맥 캐스트를 보여줍니다ceration. 그림 2A는 전체 왼쪽 간 엽과 그림 2B는 작은 주변 지점의 가까이에 있습니다 보여줍니다.
이 기술은 성공적으로 intrahepatic의 담즙 덕트에 적용하고 BABB 개간과 코를 물에 담가서 부드럽게 함 기술 1,2,7를 모두 사용하여 게시되었습니다.
일반적인 문제가 채워 불완전 포함 주변 시스템 또는 조직에 수지와 오버 플로우에 거품. 그림 3은에 포털 정맥에서 불완전 채우기 (그림 3A), 거품 (그림 3A) 및 수지의 오버플로를 인식하는 방법을 보여줍니다 중앙 정맥 (그림 3B).
모든 이미지는 Leica MZ 16 FA의 입체경을 사용하고 RETIGA 4000R 카메라를 QImaging 이동합니다.
그림 1간장의. BABB - 해제 수지 캐스트 엽 포털 정맥을 떠났다. A. 수지 캐스트 hilum에서 간 주변에 확장 계층 분기 구조를 보여줍니다. 수지 캐스트 블루 썬팅 간 엽에서 노란색으로 나타납니다. B.이 가까이가 수지 채우기은 간 주변의 작은 가지에 확장을 보여줍니다. 수지는 삭제 간을 통해 약간 흰 있습니다. 스케일 바 = 1 음.
그림 2. 간장의 조직 - 분해 수지 캐스트 엽 포털 정맥을 떠났다. 전체 간 엽의 캐스팅 A. 수지는 다양한 크기의 여러 가지를 보여줍니다. B. 주변 업 간 주변의 작은 가지를 보여줍니다. 작은 가지의 모양을 페더 링은 정현파 공간의 충전 수지를 대표하고 또는 수지에 보이지 않을 수도 있습니다 캐스트 만약 존재한다면 명백한 지점 밀도를 증가 할 것이다. 수지 색 흰색입니다. 스케일 바 = 1 음.
그림 3. 수지 캐스트로 일반적인 문제. A.은 왼쪽 엽 포털 정맥의 완전 충전은 간 주변에 연장 실패 일부 또는 전부 주조 가지들에 의해 명백합니다. 이 캐스트는 연속 주조 (화살표)의 중단으로 보이는 거품을 표시합니다. 일부 지역은 포털 정맥 및 중앙 정맥 가지의 근접으로 인해 B.은 포털 정맥 수지는 종종 입력하고 중앙 정맥을 채울 것입니다. 두 개의 hilar 가지 (화살표)와 다른 패턴과 중복 둘 분기 구조가 때를 인식 할 수 있습니다. 기술 오류와 진실 형태학의 변경 사이의 차별은 두 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다. 첫째, 주조 구조는 2 차원 분석 또는 기타의 방법에 따라 예상 구조에 비해되어야합니다. 둘째, 여러가 복제 수행하는 것이 중요하며, 가능한 경우, 구조체을 수량화우레와 재현성을 결정하기 위해 통계 분석을 수행하고 사이 다른 실험 및 제어 팔을 내 통계적으로 유의미한 형태학의 변경이있는 경우.
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Discussion
우리는 포털 정맥과 간 intrahepatic의 담즙 덕트 시스템은 주조 할 수있는 방법에 대한 구체적인 예를 설명했지만,이 기술은 약간의 적응과 거의 다른 ductal이나 혈관 시스템에 적용 할 수 있습니다. 이전 작품 10,11을 오리 쌔끼 마우스 1,2,7-9 등 다양한 종,,, 토끼 12,13, 개 14, 그리고 돼지 15과 코 선 14 등 많은 기관,이 기술의 가능성을 입증 심장 16, 방광 12,13, 그리고 간 1,2,7,8. 이 캐스트는 동일한 조직, 다른 발달 단계 5에서 동일한 구조, 또는 유전 또는 환경 변경 또는 영향 1-4의 구조에 미치는 영향에서 여러 시스템을 (예를 들어, 포털 정맥 및 담즙 덕트) 비교하는 데 사용할 수 있습니다 , 6,7. 종 장기에 걸쳐이 기술의 다양한 응용 프로그램은 s의 매우 유용한 도구를 주조 수지합니다혈관과 ductal 구조의 형태 tudying 크게 동물 질병 모델에서, 우리의 이러한 구조의 정상적인 기능에 대한 지식뿐만 아니라, 그들이 영향을하는 방법, 또는 사람들이 미치는 영향 오르간을 높일 수있는 가능성이 있습니다.
3 차원 캐스트를 만드는 수지의 사용은 ductal 또는 혈관 시스템의 영구적 인 스냅 샷을 제공하고 유사한 기술을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 캐스트는 인도 잉크 또는 이와 유사한 잉크 주사에 비해 이점을 제공 물에 담가서 부드럽게 함 후 독립 구조로 분석 할 수 있습니다. 둘째, 구조의 보존성 분석의 용이성을 증가시킵니다. 마지막으로 BABB의 개간 절차를 견딜 수있는 Mercox II 수지의 능력도 크거나 조밀 한 조직 내에 현장에서 구조를 시각화 할 수있는 독특한 능력을 할 수 있습니다.
다른 특성을 사용할 수 수지의 몇 가지 종류가 있습니다. Mercox II는 많은 ADV이 기술에 선정되었습니다antages, Mercox II가 작은 주변 포털 정맥 및 담즙 덕트 지점을 통과 할 수 있도록, 낮은 점도를 가지고, 그것은 독립 실행 형 분해 캐스트를 분석 필수, 룸 온도에서 신속하고 완전한 경화가있어, 치료하면 최소한의 수축이 있으며, BABB 조직 개간을 견딜 수. 수지, Microfil (Flowtech, 카버, MA)의 또 다른 유형은 여러 출판 연구 8,9,15에 사용되었습니다. 비교적, Microfil는 상온에서 완전히 치료하고 조직 개간을 통해 최선의 시각화입니다하지 않습니다. Microfil은 포털 정맥의 캐스트 이전에 ethanolmethyl 살리실산 8 10% 포르말린 고정과 이후의 개간을 통해 분석되었습니다.
수지 첨가제는 주조 시각화의 추가 방법을 제공 할 수있는, 색 염료, 형광 분자, 또는 마이크로의 추가 분석을 향상시킬 수 있습니다. 검토가 선택한 염료 분자가 inte을 관통 할 수있을만큼 작은 있는지 확인하기 위해, 그러나, 이동해야합니다그들은 크게들이 조직 삭제하거나 물에 담가서 부드럽게 함, 그리고 그들이 분석의 원하는 방법으로 호환되는 중 하나를 견딜 수 있는지, 수지의 속성을 변경하지 않는 nded 혈관이나 ductal 구조. 수지 첨가제를 선택하면 특정 응용 프로그램에 크게 의존합니다 : 예를 들어, 마이크로 (분자 프로브)는 일반 정현파 건축의 연구하지만, portosystemic 분로의 발전을 조사 할 수있는 완벽한 도구들을 적합하고, 간 동양 혈관을 통과하기에 너무 큰 , 그 유전자 조작 마우스 모델 8, 마이크로를 수용 할 수있을만큼 충분히 큽니다.
마지막으로, 수지 주조 분석 중 해제 또는 분해 캐스트에서 수행 할 수 있습니다. BABB - 삭제 캐스트는이 상주하는 내 기관에 관련된 시스템의 구조를 측정하는 데 유용합니다. 코 - 분해 캐스트는 여러 가지 방법으로 분석 할 수 있습니다. 이전 연구는 전자 현미경을 스캔 사용했습니다 (SEM)은 microcirculation 네트워크 및 선박 구조 12,13,17을 시각화합니다. 캐스트는 지점 번호, 직경, 그리고 microcomputed 단층 촬영 (microCT) 1,15,18, 19,20의 사용과 볼륨에 대해 정량화 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 TJW에 분자 의학 HHMI / 밴더빌트 대학 인증 프로그램을 통해 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI) (GRDOT56006779)에서 SSH에 대한 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금 (R01-DK078640)에 의해 지원되었다 밴더빌트 당뇨병 연구 및 교육 센터 (P30-DK020593)와 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터 (P30-DK058404)는 코어 서비스를 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
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