Intraoperativ Påvisning af Subtle Endometriose: et nyt paradigme for påvisning og behandling af bækkensmerter forbundet med tab af Peritoneal Integrity

Summary

Tab af peritoneal integritet giver et nyt paradigme til at forstå og behandle kroniske bækkensmerter hos kvinder med milde former for endometriose og let kan afsløres ved hjælp af intraoperativ instillation af farvestof på tidspunktet for laparoskopi.

Abstract

Endometriose er en almindelig sygdom, der påvirker 40 til 70% af reproduktive-alderen kvinder med kroniske bækkensmerter (CPP) og / eller infertilitet. Formålet med denne undersøgelse var at demonstrere anvendelsen af ​​et blåt farvestof (methylenblåt) at farve peritoneale overflader under laparoskopi (L / S) til at detektere tabet af peritoneal integritet hos patienter med bækkensmerter og formodede endometriose. Fyrre kvinder med CPP og 5 kvinder uden smerte blev evalueret i denne pilotundersøgelse. I L / S, blev koncentreret farvestof sprøjtet på peritoneale overflader, derefter aspireret og skyllet med Lactated Ringers opløsning. Områder med lokaliseret farvestofoptagelse blev bedømt for tilstedeværelsen af ​​synlige endometriske læsioner. Områder med intens peritoneal farvning blev resektion og nogle fikseret i 2,5% bufret glutaraldehyd og undersøgt ved scanning (SEM) elektronmikroskopi. Blå farvestofoptagelse var mere almindelig hos kvinder med endometriose og kroniske bækkensmerter end kontrol (85% vs 40%). Resektion af det blå staivelafgrænsede områder afslørede endometriose ved SEM og tab af peritoneal celle-cellekontakt sammenlignet med normale, ikke-farvende peritoneum. Berørte peritoneum var forbundet med synlige endometriske implantater i de fleste, men ikke alle patienter. Subjektiv smertelindring blev rapporteret i 80% af deltagerne. Baseret på scanningselektronmikroskopi, konkluderer vi, at endometriske celler går langt ud over synlige implantater af endometriose og synes at forstyrre den underliggende mesothelium. Subtle læsioner af endometriose kan derfor forårsage bækkensmerter ved afbrydelse af peritoneal integritet, så menstruation eller ovulatoriske blod og tilhørende smerter faktorer adgang til de underliggende sensoriske nerver. Komplet resektion af berørte bughinde kan give en bedre langsigtet behandling for endometriose og CPP. Denne simple teknik synes at forbedre afsløring af subtile eller nær usynlig endometriose hos kvinder med CPP og minimal visuelle resultater ved L / S og kan tjene til at ophøje diagnostisk præcision for endometrioseved laparoskopi.

Protocol

1. Patient Selection

1. Kvinder med kroniske bækkensmerter gennemgå en historie og fysisk eksamen.
2. Lokalisering af smerte, timing med hensyn til menstruationscyklus, associerede symptomer, herunder irritabel tarm klager eller blære klager noteres og registreres.
3. Kvinder, der gennemgår laparoskopi er tilladt til eventuel resektion af endometriose og brug af deres væv til forskning.

2. Laparoskopiske teknikker

1. Laparoskopi udføres under anvendelse af standardteknikker gennem et 5 mm umbilical port og yderligere 5 mm havne i underlivet.
2. Omhyggelig kontrol af hoftebenet udføres for at korrelere alle resultaterne af endometriose med den præoperative lokalisering af smerte, som indikeret ved patienten.
3. Methylenblåt farvestof blandes 1:200 med sterilt saltvand og injiceret på bækken overflader ved anvendelse af en aspiration nål.
4. Sugning vanding udføres for at fjerne overskuddetfarvning og skyl de peritoneale overflader.
5. Bækkenet er inspiceret og de områder af blåt farvestof-optagelse registreres.
6. Når det er muligt, resektion af de berørte områder i bughinden udført.

3. Scanning Electron Microscopy

1. Peritoneale sektioner er syet til en steril telfa bestyrelse til at flade prøven og vedligeholde orientering (intraperitoneal side op) og anbragt i glutaraldehyd fiksativ (Sigma, St. Louis, MO) i SEM.
2. Prøver var orienteret og efterfikseret i 1% bufret osmiumtetroxid i 1 time og dehydratiseret med sekventielle ethanolkoncentrationer.
3. Prøverne blev tørret ved hjælp af flydende carbondioxid og monteret på aluminium scanningselektronmikroskop stubbe med kolloid sølvpasta og katodeforstøvning med guld: platinlegering til en tykkelse på 20 nM.
4. Scanningselektronmikroskopi blev udført under anvendelse af et JEOL model JSM-6400 Scanning mikroskopi og mikrofotografier opnået fra 12 tilfældige områder.

Representative Results

Et eksempel på subtil endometriose, der var næsten usynlige er vist i figur 1A. Før påføring af blåt farvestof en uregelmæssig område med stiplede peritoneum blev værdsat hjulpet af refleksion af laparoskopisk lys. I figur 1B, viser udseendet af dette samme område efter farvning samme uregelmæssigt mønster over blæren (figur 1 B). Når denne del af peritoneum blev resekteret (figur 1C) blev underkastet SEM, som viser overliggende endometriske celler og forstyrrelser i celle-celle-kontakter i den underliggende mesothelium. Normal peritoneum fra en ikke-blåt farvede område viser intakte celle-celle-kontakter og ingen endometriske celler til stede (figur 1D). I en anden kvinde med CPP og en diagnose af interstitiel cystitis (IC), blev ingen indlysende endometriose set før påføring af blåt farvestof (fig. 1E). Med anvendelse af farvestof, viste blærenindlysende blåfarvning (figur 1F). Hendes symptomer på CPP og IC forbedret dramatisk i over 6 måneder med resektion af disse områder af blåfarvede peritoneum, selv om der ikke endometriose blev set visuelt. Endometriose blev set på patologi rapport fra venstre uterosacral biopsi, dog.

Som vist i tabel 1, af 40 patienter med CPP, fandt vi MB farvning i 34 (85%) i forhold til 2/5 (40%) af kvinder uden CPP. Alderen var ens i de tilfælde vs kontrol og ved etape af endometriose fundet. Blåt farvestof optagelse blev set i de fleste af prøverne med endometriose og kun 2/5 af kvinder uden synlig endometriose. Endometriosis var stærkt forbundet med lokalisering af det blå farvestof. Subjektivt, blev smertelindring hævdes at blive forbedret i de fleste patienter (32/40, 80%), med undtagelse af kvinder uden synlig endometriose.

Fig. 1. Eksempler på laparoskopiske fund før anvendelse af blåt farvestof er vist i (A) og (E) i to kvinder med CPP, både med blære klager, som blev værre ved menstruation. I (A), lige refleksion af laparoskopisk lys viste områder mistænkelige for klare læsioner af endometriose (pile). Blåt farvestof påføres disse områder farves forskellige områder af over blæren (B (pile), og F). Resektion af den påvirkede peritoneum blev undersøgt ved scanningelektronmikroskopi (SEM). I prøven resekteres fra blæren (C), kan et enkelt lag af endometriske celler ses på toppen af ​​peritoneum ved scanningselektronmikroskopi (SEM) (D). De mesotelceller i peritoneum har huller i deres celle-celle-kontakter udsætter underliggende ekstracellulære matrix. I tilfælde af en normal peritoneum uden blåt farvestof farvning, thESE-celler er stramt forbundet som vist i (G). Målestokbjælkerne for SEM er inkluderet nederst til højre (D og G). Klik her for at se større figur .

Parameter	Tilfælde (n = 40)	Kontroller (N = 5)	Signifikans * (p <0,05)
Alder (middel ± SD)	30,17 ± 4,65	32,0 ± 2,55	p = 0,39
Alder ved Stage O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	33,16 ± 3,82 29,2 ± 4,85 32,0 ± 3,03	N / A
MB Optagelse O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(34/40) 85% (2/6) 33,3% (28/29) 96,5% (4/5) 80%	(2/5) 40%	p = 0,2
MB associeret w / endometriose O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(0/6) 0% (28/29) 96,5% (5/5) 100%	N / A
Subjektiv Smertelindring	(32/40) 80%	N / A
Smertelindring ved Stage (%) O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(1/6) 16,7% (27/29) 93,1% (4/5) 80%	N / A

Tabel 1. Erfaring med blåt farvestof farvning hos kvinder med kroniske bækkensmerter.

• Statistiske sammenligninger blev udført under anvendelse Pearson chi square test.

Discussion

Kronisk bækkensmerter hos kvinder er en bekostelig og dårligt forstået problem ^1. Dysmenoré er den mest almindelige form for bækkensmerter påvirker 60% af kvinder ² og 72% af unge ^3. Endometriose er en inflammatorisk sygdom, der rammer 5% af normale kvinder, men er til stede i op til 70% af kvinder med bækkensmerter. Mens endometriose bidrager til kroniske bækkensmerter (CPP), en mekanisme, hvormed læsioner forårsager smerte fortsat usikkert ^4. Paradoksalt nok er graden af smerte ikke korrelerer med graden af endometriose ^5,6. Kroniske smerter symptomer, herunder associeret irritabel tyktarm (IBS) og IC kan gå udiagnosticeret årevis ^7,8. De anslåede omkostninger ved endometriose er over 22 milliarder dollar alene i USA ^9, selv om ægte regnskaber er vanskelig at vurdere, da endometriose er forbundet med andre kroniske sygdomme, herunder migræne hovedpine, kronisk træthedssyndrom, IBS og IC ^10,11. Etablering af en diagnose for endometriose kræver laparoskopi, men denne sygdom er ofte diagnosticeres sent ^12. Uenighed hvad der udgør endometriose og mangel på specialiseret træning bidrager til forsinket detektion ^13. Når visualiseret, kan ikke alle mistænkte læsioner kontrolleres af en patolog ¹⁴ og i mange tilfælde af CPP, er endometriose ikke værdsat ^15, måske på grund af subtile eller usynlige former af sygdommen ^16-19. Det er klart et nyt paradigme er nødvendig for at løse denne kløft mellem kliniske symptomer på smerte og vores diagnostiske tilgang til denne vigtige sygdom.

Mens nervebanerne involveret i ætiologien af bækkensmerter forbundet med endometriose i stigende grad ved at blive undersøgt ^20-25 overraskende lidt er kendt om, hvordan mild endometriose bidrager til lokaliseret kroniske bækkensmerter (CPP). Kirurgiske og medicinsk behandling ofte undlader at tage fat på i forbindelse smertemed denne lidelse ⁴ og gentagelse er fælles. Baseret på studier, der præsenteres i denne undersøgelse, hypotesen vi, at lokaliseret, gentagne menstruation og præmenstruelle bækkensmerter forbundet med endometriose sandsynligvis skyldes en afbrydelse i peritoneal integritet, sekundært til overliggende endometriose. Inflammatoriske cytokiner og blod i bughulen af ​​endometriose patienter ville have direkte adgang til de underliggende innerverede bækken væv steder ved peritoneal forstyrrelser. Mens substans P er blevet målt og blev ikke fundet at være forskellige i endometriose patienter versus kontroller ^26, TNF-α og glycodelin er to kandidater, der er blevet forbundet med smerter i endometriose patienter ^27. Mens nervetråde er blevet beskrevet i endometrium og endometriske læsioner ^25,28-30, disse fund ikke forklare lokaliseret smerte forbundet med subtile eller minimal sygdom.

Rapporter vedrørende anvendelse af methylen blue dato tilbage til 1994, da Manhes rapporterede dens anvendelighed i at identificere subtile former for endometriose ^31. Methylenblåt farvestof ikke er FDA godkendt til påvisning af endometriose og derfor erkender vi, at der er et off-label anvendelse af produktet. Vi har brugt methylenblåt farvning af bughinden at hjælpe med at identificere subtile eller på anden måde usynlig endometriose (Lewis og Lessey Abstract AAGL / AGES Brisbane, Australien 2008). For nylig rapporterede Rauh-Hain og Laufer lignende anvendelse af indigocarmin at opdage subtile former for denne sygdom ^32. Det er vores erfaring, er indigotin farvestof ikke udføre det samme og hos nogle patienter, ikke plette områder af endometriose, som MB genkender. Grundlaget for farvestofoptagelse kan være forbundet med forstyrrelser af epiteloverflader, som vist i rotte blæren model af Morrison ^22. Her rapporterer vi for første gang bevis for, at peritoneal optagelse af farvestof er forbundet med mesothelial forstyrrelser og forbundet subtileeller usynlige endometriosis ved scanningelektronmikroskopi. Desuden bemærker vi, at de farvede peritoneal overflader syntes at korrelere med forudgående vurdering lokalisering af smerter hos kvinder med CPP. For eksempel,. Hvis en patient, at hendes smerte er karakteristisk på højre, det er den side, vi typisk se blåfarvning Desuden fandt vi signifikant forbedring i de post-operative rapporter om smerter i de fleste patienter, hvor disse peritoneale læsioner blev resektion eller poleres. Vi mener, at denne simple teknik vil give mulighed for bedre diagnostisk nøjagtighed til identifikation af subtile endometriose samtidig skabe en mere komplet behandling af endometriose er forbundet med CPP. Det paradoksale mangel på sammenhæng mellem den fase af endometriose og opfattelsen af ​​smerte kan til sidst blive forstået i form af peritoneale defekter, der strækker sig meget længere end det synlige læsion af endometriose.

Kirurgisk behandling resulterer ofte i symptomatic forbedring ^33,34, men 40 til 50% af kvinder, der gennemgår behandling har ufuldstændig relief eller hurtig tilbagevenden af deres symptomer ^35,36. Usynlige endometriosis eller subkliniske former af sygdommen er beskrevet ^16-19,37. Derfor kan meget subtil eller enkelt cellelag endometriose ikke let identificeres, hvilket fører til fejldiagnosticering af CPP patienter og tabt muligheder for at lindre smerter.

Bughinde er et under-studerede område af den menneskelige biologi med kun et par papirer, der beskriver biologi peritoneal heling ^38. Modeller til at studere peritoneal-endometrial interaktion har vist lovende ^39-43. Som tidligere vist ved Witz ^42, fandt vi, at endometriske celler er til stede på peritoneale overflader er forbundet med peritoneal celle-celle-forstyrrelser. Brug eksplantater af menneskelig peritoneum og isolerede endometriske epitel og stroma celler Witz og kolleger har vist, at endometrie celler letklæbe til peritoneal mesothelium ⁴² og invadere gennem mesothelium i 18-24 timer ^44. In vivo fandt vi, at endometriske celler klæbe til den ydre overflade af bughinden uden tilsyneladende invaderende. Således kan ikke-invaderende overflade endometriose være en stabil og vedvarende form af endometriose. Overflade "røde" læsioner kan være ens og er blevet anerkendt som en mere biologisk aktive form af endometriose ^45.

Koks beskrevet fastgørelse og spredning af menstruation celler kun til de områder af peritoneum, der blev beskadiget eller fraværende ^46, men yderligere arbejde med denne gruppe foreslog opløselige faktorer forårsagede mesothelial celleseparering, svarende til hvad vi har observeret ^47, herunder "tilbagetrækning, svinder ind, og kløften dannelse ". Mens deres studie og den senere undersøgelse af Witz ⁴⁰ konkluderede, at afbrydelse tilladt for lokaliteter af adhæsion og invasion, vores resultater af huller i mesothelium af patienter med endometriosis forbundet med MB absorption tyder på, at endometriske læsioner spredt langt fra den oprindelige læsion og forstyrre overfladen bughinden uden invaderende. Kendte stoffer af celle-cellekontakt udtrykt af endometrium eller endometriose indbefatter TNF-α ⁴⁸ og Ephrin A1 ^49,50.

Resektion eller ablation af MB farvede bughinde er endnu ikke standard for pleje af endometriose og CPP. Hvis sådanne områder af peritoneum, faktisk overtrukket med mikrolagene af endometriske celler, så er anvendelsen af ​​farvestof til at identificere ramte områder kunne forbedre den diagnostiske nøjagtighed for endometriose og muliggøre en mere fuldstændig resektion af ellers usynlige implantater. I denne indledende undersøgelse af CPP før og efter operationen i øvrigt fandt vi, at de fleste patienter rapporterede forbedringer i smerte symptomer. Hurd foreslog tre kriterier anvendes til at bevise sammenhængen mellem smerte og endometriose: 1) at smerten være cyklisk, 2) at endometriosis diagnosticeres ved laparoskopi og 3), at medicinsk eller kirurgisk behandling forbedrer smerten ^51. Mens yderligere validering er nødvendig for at bekræfte vores resultater, sammenslutningen af ​​minimal sygdom, CPP og peritoneale defekter passer Hurd kriterierne og tilbyder en ny måde at tænke om udredning og behandling af bækkensmerter forbundet med endometriose. Denne undersøgelse var begrænset af manglen på en formel smerte undersøgelse. Fremtidige undersøgelser er nu planlagt at bruge validerede bækkensmerter undersøgelser og visuelle analoge skalaer (VAS) før og efter operation for at kvantificere den langsigtede løsning af smerte i disse kvinder med subtile endometriose og CPP behandlet med resektion af blå-farvning områder i forbindelse med endometriose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	American Reagent	NDC0517-0310-110	Mixed 1:200 in saline