Summary
Este método investiga el fenotipo de aglutinación de plaquetas mediada por
Abstract
P. falciparum causa la mayoría de las infecciones de malaria graves. Los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la malaria cerebral (CM) no se entienden completamente y varias hipótesis se han propuesto, incluyendo la obstrucción mecánica de microvasos por P. células falciparum-eritrocitos parasitados (GRP). En efecto, durante la etapa intra-eritrocítica del ciclo de vida, P. falciparum tiene la capacidad única para modificar la superficie de los eritrocitos infectados mediante la exportación de antígenos de superficie con diferentes propiedades adhesivas sobre la membrana de glóbulos rojos. Esto permite que el secuestro de GRP en múltiples tejidos y órganos por adhesión a las células endoteliales que revisten la microvasculatura de las vénulas post-capilares 1. De este modo, las formas maduras del parásito evitar liquidación esplénica de los eritrocitos infectados deformado 2 y restringen su medio ambiente a una presión de oxígeno de baja más favorable 3. Como consecuencia de esta SEQUESTración, es sólo parásitos asexuales y gametocitos inmaduros que pueden ser detectados en la sangre periférica.
Cytoadherence y secuestro de pRBC maduros como para los receptores de escenario para numerosos expresadas en camas microvasculares se produce en la enfermedad severa y complicaciones. Sin embargo, varias líneas de evidencia sugieren que sólo los fenotipos adhesivos específicos son susceptibles de ser asociados con consecuencias patológicas graves de la malaria. Un ejemplo de tales interacciones huésped-específicas del parásito se ha demostrado in vitro, en donde la capacidad de la molécula-1 de adhesión intercelular para apoyar la unión de GRP con particulares propiedades adhesivas se ha relacionado con el desarrollo de la malaria cerebral 4,5. La placenta también ha sido reconocido como un sitio de la acumulación de GRP preferencial en las mujeres embarazadas infectadas por la malaria, con sulfato de condroitina A expresada en sincitiotrofoblastos que recubren el espacio intervellosa placentaria como el receptor principal 6. Rosetas de pRBC teritrocitos no infectados o a través del receptor del complemento 1 (CD35) 7,8 también se ha asociado con la enfermedad grave 9.
Uno de los más recientemente descrito P. falciparum fenotipos cytoadherence es la capacidad de la GRP a formar montones mediadas por plaquetas in vitro. La formación de tales grupos pRBC requiere CD36, una glicoproteína expresada en la superficie de las plaquetas. Otro receptor humano, gC1qR/HABP1/p32, expresada en diversos tipos de células incluyendo las células endoteliales y las plaquetas, también se ha demostrado para facilitar la adhesión GRP en las plaquetas para formar grupos 10. Si la aglutinación se produce in vivo no está clara, pero puede dar cuenta de la importante acumulación de plaquetas descritos en la microvasculatura del cerebro de los niños de Malawi que murieron por CM 11. Además, la capacidad del aislado clínico culturas a agruparse in vitro estaba directamente relacionado con la gravedad de la enfermedad en Malawi 12 13, (aunque no en Malí 14).
Con varios aspectos del fenotipo de aglutinación pRBC mal caracterizado, los estudios actuales sobre este tema no han seguido un procedimiento estandarizado. Este es un problema importante debido a la conocida alta variabilidad inherente en el ensayo 15. A continuación, presentamos un método in vitro para el agrupamiento de plaquetas mediada por P. falciparum con la esperanza de que va a proporcionar una plataforma para un método consistente para otros grupos y crear conciencia de las limitaciones en la investigación de este fenotipo en estudios futuros. Al estar basado en Malawi, proporcionamos un protocolo diseñado específicamente para una configuración de un recurso limitado, con la ventaja de que los aislados clínicos recién recogidas se pueden examinar para fenotipo sin necesidad de criopreservación.
Protocol
1. Recogida de muestras
Las plaquetas pueden activarse fácilmente a través de la temperatura, la agitación o el almacenamiento, por lo que deben ser manejados con cuidado. El uso de tubos al vacío para recoger sangre para la preparación de plaquetas es inevitable en la mayoría de las situaciones clínicas, pero se debe considerar cuidadosamente como aspiración puede potencialmente causar la activación plaquetaria. Debido al protocolo clínico utilizado en nuestro centro de investigación, las muestras se recogen cuidadosamente vacutainers citrato de sodio. No hemos tenido ningún problema con la prematura activación plaquetaria en esta o en nuestro estudio anterior 12. Recopilamos la sangre para la preparación de plaquetas a partir del grupo sanguíneo O + individuos para reducir al mínimo el grupo sanguíneo de agregación no específica de antígeno. Asimismo, los donantes no han tomado la medicación en los días 7 a 10 anteriores, se sabe que algunos medicamentos influyen sobre la función plaquetaria.
1.1 Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP)
- Recoge aproximadamente 5 mlde la sangre entera desde un host ingenua la malaria o 2,5 ml de sangre de CM o malaria grave (SM) de los pacientes en un vacutainer de citrato de sodio (BD número de producto 36276).
- Centrifugar la sangre total a 250 xg durante 10 min a temperatura ambiente. No centrifugar a 4 ° C como bajas temperaturas pueden causar que las plaquetas a agregarse.
- Transferir cuidadosamente el sobrenadante turbio en un tubo de 15 ml limpio. Las plaquetas son fácilmente activados por las variaciones de temperatura y choques físicos y por lo tanto debe ser manejado con cuidado. Evite sacudidas o los movimientos bruscos del tubo.
- Usar hematocitómetro de un Neubauer para contar y ajustar la suspensión de plaquetas a> 300 x 10 3 plaquetas / l de donantes sanos y <150 x 10 3 plaquetas / l de CM y los pacientes SM utilizando 1X tampón de fosfato (pH 7.2-7.4; PBS). Asegúrese de elegir un alto factor de dilución para facilitar el recuento de plaquetas y garantizar su exactitud.
Nota: La malaria patients tienen un recuento de plaquetas reducido en comparación con los individuos sanos 16,17,18. Por lo tanto las concentraciones de plaquetas para CM y UM se ajustan de acuerdo a los recuentos de plaquetas promedio para los pacientes dentro de cada grupo de diagnóstico de la malaria. El P. falciparum fenotipo de aglutinación es común en los aislados CM y muestra una fuerte afinidad de unión por lo tanto, las concentraciones de plaquetas no afecta a la reducción de tamaño de agrupamiento o de la frecuencia ya que la concentración de plaquetas es estandarizado para todos los casos CM.
1.2 Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP)
- Para obtener PPP, centrifugar una parte del PRP obtenido anteriormente a 1500 xg durante 10 min. La mayoría de las plaquetas se sedimentan en la parte inferior del tubo.
- Tanto PRP y PPP se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta dos semanas. Lo ideal es utilizar las plaquetas frescas para el ensayo de aglutinación. Después de 8-10 días la mayor parte de las plaquetas son propensos a estar inactivo y probablemente agregada.
2. Parasite Cultura
- Lavar las sedimentadas pRBC tres veces con 5-10 ml de RPMI 1640 por centrifugación a 370 xg durante 5 min.
Nota: en este protocolo todas las culturas empezaron a aproximadamente 1 ml de hematocrito (PCV) y se mantuvieron a 5% de hematocrito. Los cultivos se pueden iniciar con cualquier PCV de GRI y ajustarse en consecuencia con la no infectada RBC y los medios para alcanzar el hematocrito deseado. - Coloque el GRP en un matraz de cultivo y el suplemento con medio de cultivo estándar de la malaria de RPMI 1640 suplementado con 25 mM de HEPES, 5% Albumax II o 10% de suero y 40 mg / ml de gentamicina para lograr un hematocrito 5%.
- Permeado frascos de cultivo con una mezcla de 92,5% de nitrógeno, 2,5% de oxígeno y dióxido de carbono al 5% antes de sellar e incubar. Alternativamente, el método de jarra de anaerobiosis hermético al aire de Trager-Jensen se puede utilizar.
- Para pRBC obtiene directamente de los pacientes, incubar su frasco de cultivo de 24 a 36 horas en un 37 ° C incubadora de CO2 al 5% para obtener parásitos maduros.
NOTA: Most laboratorio y líneas adaptadas al cultivo son muy fáciles de mantener en cultivo bajo condiciones estándar. Existen técnicas simples descritas a continuación que se pueden utilizar para sincronizar las diferentes etapas de parásitos para mantener la tasa de crecimiento. - Preparar un frotis de sangre delgado como se describe a continuación y examinar la maduración del parásito al microscopio óptico.
3. Thin Blood Film Slide Preparación
- Coloque aproximadamente 10-15 l de sangre en un extremo de un portaobjetos de vidrio esmerilado que descansa sobre una superficie plana.
- Toque la gota de sangre con el borde de un segundo portaobjetos hasta que la sangre se distribuye uniformemente a través del borde de la segunda corredera.
- Mientras mantiene la segunda diapositiva en un ángulo de 45 °, de forma rápida, pero suavemente, sin ejercer demasiada presión sobre la primera diapositiva, deslice la sangre a través de la primera diapositiva de hacer una película delgada de sangre que se distribuye uniformemente. Deje secar al aire.
- Sumergir el portaobjetos en metanol durante 10 seg. Deje secar al aire.
- Sumerja el portaobjetos en 2% Giemsa stain durante al menos 10 min. Aclarar exhaustivamente hasta que el agua salga clara. Deje secar al aire.
- Examine diapositiva utilizando una lente de emulsión de aceite 90-100x en un microscopio de luz
4. Purificación y sincronización de las etapas asexuales
La purificación de P. madura falciparum GRP es un paso necesario para el ensayo de aglutinación. En efecto, sólo los parásitos maduros son capaces de unirse a los receptores de plaquetas, ya que es en esta etapa del ciclo de vida que los ligandos pertinentes se expresan y sobresalen de la superficie de eritrocitos infectados. Hay varios métodos para purificar y sincronizar las etapas asexuales de P. falciparum: etapas asexuales tardías pueden ser enriquecidas por gradiente de Percoll 19; magnética de células de clasificación 20 o mediante el protocolo de gelatina de sedimentación 21 se describe aquí.. Sorbitol-sincronización selecciona para las etapas de anillo 22, después de lo cual los anillos se cultivaron durante 24-26 horas para obtener estados maduros (sin need para llevar a cabo la flotación de gelatina).
4.1 Plasmagel flotación
Plasmagel flotación utiliza una solución similar a gelatina para seleccionar para el peso inferior nudoso eritrocitos a permanecer en solución, mientras que las formas de anillo densos y rosetas hunden hasta el fondo. Esta técnica da hasta un 90% de pureza de los eritrocitos infectados etapa-maduros y se puede utilizar tanto para el campo y aislamientos de laboratorio. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, plasmagel flotación elimina rosetas de GRI, así como los estados inmaduros que podrían resultar en una frecuencia reducida aglutinación en las muestras con una alta frecuencia de formación de rosetas. Sin embargo, la ausencia de la formación de rosetas GRP después de plasmagel de flotación no afectaría el ensayo de formación de grumos debido a la formación de rosetas es una interacción de los eritrocitos pRBC y no infectadas, mientras que la aglutinación es pRBCs la unión mediada por las plaquetas. El ligando implicado en estos dos rasgos es diferente; con complementar principalmente receptor de CR-1 en los eritrocitos no infectados que median la formación de rosetas.
- Solución Gelofusine Precalentar y medianas II-libre de suero / Albumax a 37 ° C en un baño de agua.
- Transferir la cultura a un tubo estéril de 15 ml limpio y sedimentar las células por centrifugación a temperatura ambiente a 370 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante con cuidado a fin de no perturbar el sedimento y se resuspenden las células en un volumen igual de Gelofusine y medio libre de proteínas.
- Transfiera la mezcla a un tubo estéril de 15 ml y se deja reposar durante 15-20 minutos en un 37 ° C incubadora o hasta una demarcación clara se puede ver entre un nivel superior e inferior.
- Transferir cuidadosamente la capa superior a un tubo nuevo estéril de 15 ml y añadir 10 ml de RPMI fresco.
- Centrifugar a 370 xg durante 5 minutos y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
- Evaluar fase parasitemia y de desarrollo de frotis de sangre delgado y examinar bajo un microscopio de luz como se describe en la sección 4.
NOTA: Mature gama pRBC entre 60-90% de los eritrocitos infectados depending sobre la parasitemia inicial del cultivo. Para un alto porcentaje de parásitos maduros, utilice las culturas con una parasitemia inicial de ≥ 10%.
5. Ensayo de Aglutinación
- Utilice hematocitómetro del Neubauer para contar y ajustar la suspensión pRBC obtenido después de la flotación plasmagel a 1 x 10 8 pRBC / l.
- En un tubo de 1,5 ml frescos, resuspender GRP a 5% de hematocrito, naranja de acridina a 20 mg / ml de concentración final y PRP en 10% del volumen total.
En lugar de naranja de acridina, culturas parásitos se pueden teñir con 25 g / ml de bromuro de etidio durante 5 min antes de su uso.
Por ejemplo, para una mezcla de reacción de 200 l, añadir 10 l de GRI maduro, 20 l de 300 x 10 3 plaquetas / l de PRP de donantes sanos o 150 x 10 3 / l plaquetas de pacientes SM y 170 l de medio libre de proteínas.
NOTA: La relación de las plaquetas: pRBC en las reacciones finales es 20:01. Esto es importante ya que se permite la máximaum frecuencia de agregación de una muestra que se determine. Si se agregan las plaquetas menos en los controles y luego no todos los pRBCs agrupamiento podría tener la oportunidad de agruparse. - De la misma manera preparar los siguientes controles, células rojas de la sangre no infectadas y PRP, y pRBC con PPP para determinar el papel de las plaquetas en la formación de grumos pRBCs.
- Transferir la suspensión a un vial cónico ml con tapón de rosca 1,5-2,0.
- Colocar el vial con agitación suave por laminado a 10-12 rpm a temperatura ambiente.
- Compruebe si la formación de un grupo húmedo diapositiva preparada con la pipeta 10 l de pRBC ± mezcla de plaquetas en un portaobjetos, cubra con un vaso resbalones y examen con fluorescencia.
- El muestreo puede hacerse en intervalos de 15-20 min para un total de 120 min. Un grupo se considera como un conjunto de tres o más eritrocitos infectados.
Representative Results
Un ejemplo de un ensayo de grupo de plaquetas mediada por el uso de aproximadamente el 70% etapas maduras de P. falciparum después del enriquecimiento por Plasmagel flotación se muestra en la Figura 2. Un grupo es un conjunto de tres o más eritrocitos infectados. La tinción con naranja de acridina o bromuro de etidio puede ser visualizada por microscopía de fluorescencia. El naranja de acridina es espectralmente similares a la fluoresceína, con un máximo de excitación a 502 nm y un máximo de emisión a 525 nm (verde), mientras que el bromuro de etidio tiene un máximo de excitación a 493 nm y un máximo de emisión a 620 nm (similar a colorantes de rodamina, rojo ). Los montones son fácilmente identificables en el microscopio como con la luz normal aparecen como agregados celulares y bajo de fluorescencia en forma de manchas de color verde o rojo cuando se tiñen con naranja de acridina o bromuro de etidio colorantes, respectivamente, como se muestra en la figura 2 (punto de tiempo de 30 min usando naranja de acridina ). El más grande de los grupos, el más grande es el agregado celular aparece sinder la luz normal y el más grande de los puntos de color verde o rojo bajo fluorescencia para los respectivos colorantes. Dado que el ADN diana colorantes y por lo tanto núcleos mancha, plaquetas y RBC no infectados no se detectan bajo microscopía fluorescente debido a su falta de núcleos.
Formación aleatoria de pequeños grupos pRBC de 4,7 ± 1,6 pRBCs / de agrupamiento se producen después de 30 min. El tamaño de agrupamiento aumenta de manera significativa a un promedio de> 15 pRBC / grumos después de la incubación durante 120 min con algunos grupos que contienen numerosos GRP / grupo que no se podía contar visualmente. Se calcula la frecuencia del fenotipo de aglutinación como el número de células infectadas presentes en grumos / 1000 células infectadas, contado en ensayos por duplicado.
Figura 1. El flujo de trabajo de agrupamiento experimento. Plaquetaria rICH y plasma pobre en (A) y un p cultura de eritrocitos infectados por Plasmodium falciparum-(B) se preparan y luego se combinaron para el ensayo de aglutinación (C).
Figura 2. La aglutinación de eritrocitos infectados por P. aislar falciparum laboratorio. macizos formados por HB3 en el tiempo 0, 30 y 120 min en el plasma rico en plaquetas (A) y pobre formación de masa en plasma pobre en plaquetas (B).
Limitaciones del ensayo
Hay limitaciones que afectan específicamente a la función plaquetaria o influyen en el resultado y la mayoría de ellos ya se han destacado por Arman y Rowe 15. Aquí mencionamos algunos de los posibles problemas que podrían surgir en diferent etapas del ensayo:
- La adaptación de aislados clínicos en el cultivo in vitro puede ser un desafío ya que a veces se requieren períodos de cultivo más largos con el fin de lograr una alta parasitemia suficiente para permitir la formación de grumos. Con altas tasas de variación antigénica en P. falciparum, el fenotipo adhesivo de la cultura-adaptado parásito no puede reflejar la población de parásitos infectar original después de tiempos prolongados en cultivo.
- Con el fin de evitar la aglutinación no específica debida a los antígenos de grupos sanguíneos, los donantes de plaquetas se deben emparejar para el antígeno de grupo sanguíneo con aislados clínicos utilizados en el mismo ensayo, o el antígeno del grupo sanguíneo O-donante universal utilizado. Sin embargo, los individuos con grupo sanguíneo O-son raros en sitios africanos como Malawi, por lo que las plaquetas de uso general se obtienen de la sangre del grupo O + donantes y tiene que ir acompañada por el grupo sanguíneo.
- Contando grupos en una preparación de portaobjetos húmedo es engorroso y difícil para la captura de imagen como el cells están en constante movimiento. Por lo general, pRBC acumulan en los bordes de la hoja de la cubierta o que tienden a pegarse entre sí formando grumos "falsas" que pueden ser fácilmente confundidos con grupos reales. Con el fin de reducir el movimiento de células, permitir que las células sedimentar durante 15 min a temperatura ambiente antes del análisis.
- El ensayo de aglutinación es sensible al tiempo y por lo tanto sólo permite una muestra a ser analizada por persona a la vez para una precisión óptima. Muestreo puntos de tiempo para dos muestras diferentes se pueden superponer fácilmente, lo que resulta no coincidentes puntos de tiempo de muestreo entre las muestras si se manejan más de una muestra al mismo tiempo. En tales circunstancias, el software cuantitativa sofisticado podría calcular los tamaños de agrupamiento o como alternativa anticuerpos específicos de células podría ser utilizado para analizar la composición de los grupos. Aunque estas técnicas pueden mejorar en gran medida la importancia de los datos, en entornos de escasos recursos, donde es probable que se use este ensayo, las técnicas y los equipos no están disponibles.
Discussion
Hemos descrito un ensayo de aglutinación de plaquetas mediada utilizado para el estudio de GRP en los aislados clínicos directamente en el campo. Agregación plaquetaria mediada, un comportamiento característico de P. falciparum aislados clínicos, se ha identificado como un fenotipo adhesivo distinto, frecuente en los aislamientos de unión a CD36 12,23-24. Hemos utilizado este ensayo para identificar tres puntos principales: 1) una fuerte in vitro fenotipo de aglutinación de P. falciparum aislado de niños de Malawi que se asocia con la gravedad de la enfermedad y el diagnóstico 2) nuevo receptor mediaties P-selectina aglutinación de las plaquetas junto con CD36, 3) el grado de trombocitopenia presente en pacientes con CM es suficiente para limitar aún más la formación de grumos en pRBC in vitro 12. La participación de las plaquetas en la formación del grupo se demuestra mediante el examen de una preparación húmeda diapositiva como se describe en la sección 6. Las plaquetas pueden aislarse de PRP mediante centrifugación a altas velocidadescon el fin de reducir al mínimo la sangre reacciones antigénicas del grupo, sin embargo, se utilizó PRP conjunto a fin de minimizar prematura activación de las plaquetas y de la manipulación excesiva de la centrifugación de alta velocidad. Actividad de las plaquetas se puede medir mediante la prueba de agregación plaquetaria utilizando débiles agonistas de plaquetas o epinefrina, difosfato de adenosina (ADP) 25 como se describe en 26.
Hay varios aspectos del ensayo que han sido previamente mal caracterizado, siendo uno de ellos la importancia de seleccionar fuentes de PRP y el efecto de los grupos de antígenos en sangre en el resultado del ensayo. Preparamos PRP de personas que eran del grupo sanguíneo O + y no había tomado algún medicamento en los últimos 7-10 días antes de extraer la sangre, ya que algunos medicamentos pueden afectar el comportamiento de las plaquetas.
Otros factores que pueden afectar la formación de grumos éxito incluyen GRP hematocrito, niveles de parasitemia y la longitud del ensayo de aglutinación. Uso de alta hematocrito y plaquetas coUNT sería difícil decir si el grupo es realmente un grupo o si hay demasiadas células están simplemente sentados juntos porque están densamente empaquetadas 15. Aglutinación también aumenta generalmente con tiempos de incubación más largos. Estas son todas pautas útiles que deben ser considerados en el diseño de estudios de aglutinación.
Encontramos que las muestras de diferentes grupos clínicos pueden ser analizados en paralelo usando PRP del mismo donante si es posible hacerlo, pero en la configuración de recursos limitados, tales como los sitios de campo de la piscina transfusión se limita generalmente. Por lo tanto, es difícil tener un solo donante + O para estandarizar los ensayos. Por lo tanto, identificamos varios donantes + S para asegurar la compatibilidad de grupo sanguíneo sea posible. El uso de múltiples donantes también es útil en los casos de grandes tamaños de muestras para que la carga de la donación de sangre no entra en un solo individuo.
Los puntos de muestreo a 15-20 min son mucho más factible si una sola person está llevando a cabo los ensayos, teniendo en cuenta los preparativos húmedo diapositivas y la realización de la cinética de ensayo y sin tiempos de muestreo que se superponen. La mayor parte de los datos es microscópica visual y algo objetivo, por lo tanto, es importante que el recuento de células se verifica por más de una persona. En ese caso, el manejo de una muestra a la vez puede permitir el análisis completo de tres y cincuenta y siete muestras de un día en función de la eficiencia personal.
Aglutinación de plaquetas mediada puede llevarse a cabo utilizando tanto aislamientos clínicos y de laboratorio. Para las líneas de laboratorio, se recomienda que CD36 parásitos de unión se utilizan para maximizar la formación de conglomerados de frecuencias. El ensayo puede ser acoplado con otros ensayos de aglutinación, tales como formación de rosetas o utilizado en ensayos de inhibición de la aglutinación que permitan el estudio de los receptores en las plaquetas que pueden mediar la unión de GRI, un aspecto poco entendido y examinado de este fenotipo.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación de la Wellcome Trust. JM (080.964) y SCW (080.948) fueron apoyados por becas Wellcome Trust y de DT por una beca de Confianza Malawi-Liverpool-Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
| Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
| Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
| 1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
| Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
| Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
| Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
| Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |
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