Bu yöntem, Platelet dolayımlı topaklanma fenotip inceler<em> Plasmodium falciparum</emKlinik izolatlarında> ile enfekte eritrositler (pRBC). Bu, trombosit açısından zengin plazma ve pRBC bir süspansiyonu izole edilmesi ve co-kuluçkaya yatırarak gerçekleştirilir.
Plasmodium falciparum sıtma enfeksiyonu ciddi bir çoğunluğu neden olur. Serebral sıtma (CM) altında yatan patofizyolojik mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve çeşitli hipotezler P. tarafından mikrodamarlar mekanik tıkanıklığı da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür falciparum-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC). Gerçekten de, yaşam döngüsünün içi eritrositik aşamasında, S. falciparum RBC membran üzerine yapışkan özellikleri değişen yüzey antijenleri ihraç ederek enfekte eritrosit yüzeyine değiştirmek için eşsiz bir yeteneği vardır. Bu post-kapiller venüllerde 1 mikrovasküler astar endotel hücrelerine yapışma birden fazla doku ve organlarda pRBC ihtiyati haciz sağlar. Böyle yaparak, parazitin olgun formları deforme enfekte eritrositlerin dalak boşluğu önlemek 2 ve daha uygun bir düşük oksijen basıncı 3 çevreleri kısıtlamak. Bu SEQUEST bir sonucu olarakrasyon, sadece olgunlaşmamış aseksüel parazitleri ve periferik kan tespit edilebilir gametocytes olduğunu.
Mikrovasküler yatak üzerinde ifade çok sayıda ev sahibi reseptörlerine olgun pRBC bir Cytoadherence ve haciz şiddetli ve komplike olmayan hastalık ortaya çıkar. Ancak, kanıt birkaç satır sadece belirli yapışkan fenotipleri sıtma ciddi patolojik sonuçlar ile ilişkili olması muhtemel olduğunu göstermektedir. Bu tür özel ana parazit etkileşimleri bir örneği, belirli bir yapışma özelliklerine sahip pRBC bağlayıcı desteklemek için hücreler arası yapışma molekülü-1 kabiliyeti 4,5 serebral malarya gelişimi ile bağlantılı olmuştur in vitro olarak gösterilmiştir. Plasenta da chondrotin sülfat ile, sıtma ile enfekte gebe kadınlarda tercihli pRBC birikimi bir site olarak kabul edilmiştir bir sinsityotrofoblastlarda üzerinde ifade bu hat ana reseptör 6 olarak plasental intervillöz alanı. PRBC t rozetlenmesitamamlayıcı reseptör 1 (CD35) 7,8 ile o bulaşmamış eritrosit de ağır hastalık 9 ile ilişkilendirilmiştir.
En son anlatılan S. biri falciparum'un cytoadherence fenotipleri in vitro trombosit aracılı topaklar oluşturmak için pRBC kabiliyetidir. Bu tür pRBC kümeleri oluşumu CD36, trombosit yüzeyinde ifade edilen bir glikoprotein gerektirir. Endotel hücreleri ve trombositler de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde ifade başka bir insan reseptörü gC1qR/HABP1/p32, aynı zamanda kümeleri 10 oluşturmak için trombositler üzerinde pRBC yapışmasını kolaylaştırmak için gösterilmiştir. In vivo olarak oluşur topaklanma belirsizliğini koruyor, ancak CM 11 öldü Malavili çocukların beyin mikrovasküler açıklanan trombositlerin önemli birikimi için sorumlu olabilir olsun. Buna ek olarak, klinik yeteneği in vitro olarak gelme kültürleri izole doğrudan Malawi'li 12 hastalığın şiddeti ile bağlantılıydı </sup> Ve Mozambik hasta 13, (olmasa da Malili 14).
Kötü karakterize pRBC topaklanma fenotip çeşitli yönleri ile, bu konuda mevcut çalışmalar standart bir prosedür takip değil. Bunun nedeni tahlil 15 doğasında bilinen yüksek değişkenliğin önemli bir konudur. Burada, P. in vitro trombosit aracılı clumping için bir yöntem sunar diğer gruplar için tutarlı bir yöntem için bir platform sağlamak ve gelecekteki çalışmalarda bu fenotip soruşturmada sınırlamalar konusunda bilinçlendirilmesi umuyor ile falciparum. Malavi merkezli olmak, biz yeni toplanmış klinik izolatları dondurulması için gerek kalmadan fenotip için incelenebilir avantajı ile, özellikle sınırlı bir kaynak ayarı için tasarlanmış bir protokol sağlar.
Biz doğrudan alanında klinik izolatlarının pRBC incelemek için kullanılan bir Platelet dolayımlı topaklanma testi tanımlamışlardır. Platelet dolayımlı topaklanma, S., karakteristik bir davranış falciparum'un klinik izolat, CD36 bağlayıcı izole 12,23-24 sık ayrı bir yapıştırıcı fenotipi olarak tespit edilmiştir. 1) P. in vitro topaklanma fenotip güçlü: Biz üç ana noktaları belirlemek için bu testte kullanmış falciparum hastalık şiddeti ve tanı 2) CD36, 3 ile birlikte trombositler üzerinde topaklanma yeni reseptör P-selektin mediaties) CM hastalarda mevcut trombositopeni derecesi ile ilişkilidir Malavili çocuk izole içinde pRBC kümeleri daha da oluşumunu sınırlamak için yeterlidir in vitro 12. Topak oluşumu trombositlerin katılımı bölüm 6'da tarif edildiği gibi bir ıslak-preparat hazırlama incelenerek gösterilmiştir. Trombositler yüksek hızda santrifüj ile TZP izole edilebilirkan grubu antijenik reaksiyonları en aza indirmek amacıyla, bununla birlikte, aşırı kullanımdan kaynaklanan ve yüksek hızlı santrifüj ile erken trombosit aktivasyonu en aza indirmek amacıyla bütün PRP kullanılır. Trombosit aktivitesi zayıf trombosit agonistleri, epinefrin veya 26'da belirtildiği gibi, adenosin difosfat (ADP) 25 kullanılarak platelet agregasyonu testi ile ölçülebilir.
Daha önce zayıf bir şekilde karakterize edilmiştir, tahlilin çeşitli yönleri, PRP kaynakları ve deney sonucunu kan antijen gruplarının etkisi seçiminin önemini bunlardan biri bulunmaktadır. Biz kan grubu O olan bireylerden PRP hazırlanan + ve bazı ilaç trombosit davranışını etkileyebilir gibi kan çizilir önceki son 7-10 gün içinde herhangi bir ilaç almamıştı.
Başarı topaklanma etkileyebilecek diğer faktörler pRBC hematokrit, parasitaemia düzeyleri ve topaklanma testinin süresini içerir. Yüksek hematokrit ve trombosit ortak kullanılmasıbu küme gerçekten bir yığın olan ya da yoğun 15 dolu olduğu için olmadığını çok fazla hücre sadece birlikte oturan olup olmadığını söylemek zor olacaktır unt. Topaklanma da genellikle uzun inkübasyon süreleri ile artar. Bu topaklanma çalışmalar tasarlarken dikkat edilmesi gereken tüm yararlı kurallar vardır.
Farklı klinik gruplarından örnekler bunu yapmak mümkün olup olmadığını paralel aynı donörden TZP kullanarak analiz edilebilir, ancak bu alanda siteleri gibi sınırlı kaynak ayarları transfüzyonu havuzu genellikle sınırlı olduğunu bulmak. Bu tahliller standardize etmek için tek bir O + verici olması zordur. Bu nedenle mümkün olan her yerde kan grubu uyumluluğu sağlamak için çeşitli O + bağış tespit. Kan bağışı bu yükü sadece bir bireysel girmemektedir birden çok donör kullanılması da büyük örnekleri boyutlarda durumlarda yararlıdır.
Tek bir pe ise 15-20 dk Örnekleme noktaları çok daha mümkün olanrson ıslak-slayt hazırlıkları için izin ve üst üste örnekleme süreleri olmaksızın tahlil kinetik performans, deneyleri yürütüyor. Mikroskobik verilerin çoğu görsel ve biraz amacı, bu nedenle, hücre sayımı bir fazla kişi tarafından doğrulanır önemlidir. Bu durumda, her seferinde bir numune işleme kişisel etkinliğine bağlı olarak 3-4 numune bir gün arasında tam bir analiz izin verebilir.
Platelet dolayımlı topaklanma klinik ve laboratuar izolat her ikisini de kullanarak gerçekleştirilebilir. Laboratuvar hatları için, CD36 bağlama parazit topaklanma frekansları en üst düzeye çıkarmak için kullanılır önerilir. Tahlil, örneğin rozetleme veya pRBC bağlayıcı, bu fenotip bir anlaşılamamıştır ve incelenen yönü aracılık edebilir, trombositlerin reseptörlerinin çalışma sağlayacak inhibisyon deneyleri topaklanma olarak kullanılan diğer aglütinasyon deneyleri ile akuple edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Wellcome Trust fon ile mümkün olmuştur. JM (080.964) ve SCW (080.948) bir Malavi-Fenerbahçe-Wellcome Trust öğrencilik tarafından Wellcome Trust burs ve DT tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |