Summary
Cette méthode étudie le phénotype agglutination des plaquettes induite par des
Abstract
P. falciparum est responsable de la majorité des infections paludéennes graves. Les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent le neuropaludisme (CM) ne sont pas entièrement comprises et plusieurs hypothèses ont été avancées, notamment une obstruction mécanique des microvaisseaux par P. globules rouges parasités falciparum (CGR). En effet, lors de la phase intra-érythrocytaire de son cycle de vie, P. falciparum a la capacité unique de modifier la surface des érythrocytes infectés par l'exportation des antigènes de surface avec différentes propriétés d'adhérence sur la membrane des globules rouges. Cela permet à la séquestration de CGR dans de nombreux tissus et organes par adhésion aux cellules endothéliales qui tapissent la microvascularisation des veinules post-capillaires 1. Ce faisant, les formes matures du parasite éviter dégagement splénique des globules rouges déformés infectés 2 et limitent leur environnement pour une plus favorable faible pression d'oxygène 3. En conséquence de cette sequestration, il est seulement parasites et les gamétocytes qui peuvent être détectés dans le sang périphérique asexués immatures.
Cytoadhérence et la séquestration du pRBC mature pour les nombreux récepteurs de l'hôte exprimées sur des lits microvasculaires survient dans la maladie grave et sans complication. Toutefois, plusieurs éléments de preuve suggèrent que seuls les phénotypes adhésifs spécifiques sont susceptibles d'être associées à des résultats pathologiques graves de paludisme. Un exemple de ces interactions hôte-parasite spécifique a été démontrée in vitro, où la capacité de la molécule-1 d'adhésion intercellulaire pour soutenir liaison de pRBC avec notamment des propriétés adhésives a été liée au développement du neuropaludisme 4,5. Le placenta a également été reconnu comme un site d'accumulation pRBC préférentiel chez les femmes enceintes infectées par le paludisme, avec chondroïtine sulfate A exprimée sur syncytiotrophoblastes qui bordent la chambre intervilleuse placentaire que le récepteur principal 6. Rosettes de pRBC to érythrocytes non infectés par le récepteur du complément 1 (CD35) 7,8 a également été associée à une maladie grave 9.
Un des P. décrit plus récemment falciparum phénotypes cytoadhérence est la capacité de la décharge afin de former des touffes à médiation plaquettaire in vitro. La formation de ces amas CGR nécessite CD36, une glycoprotéine exprimée à la surface des plaquettes. Un autre récepteur humain, gC1qR/HABP1/p32, exprimée sur divers types de cellules, y compris les cellules endothéliales et les plaquettes, a également été montré pour faciliter l'adhérence pRBC sur les plaquettes à former des amas 10. Si elles s'agrègent in vivo reste incertain, mais il pourrait expliquer l'accumulation importante de plaquettes décrites dans microvascularisation cérébrale des enfants du Malawi qui sont morts de CM 11. En outre, la capacité d'isolat clinique cultures à s'agglutiner in vitro est directement liée à la gravité de la maladie dans malawite 12 13, (mais pas dans malien 14).
Avec plusieurs aspects du phénotype agglutination pRBC mal caractérisés, les études actuelles sur ce sujet n'ont pas suivi une procédure standardisée. C'est une question importante en raison de la grande variabilité inhérente connue dans le test 15. Ici, nous présentons une méthode in vitro pour agglutination des plaquettes médiée par P. falciparum avec l'espoir qu'elle fournira une plate-forme pour une méthode cohérente pour les autres groupes et de sensibiliser les limitations à enquêter sur ce phénotype dans les études futures. Étant basé au Malawi, nous fournissons un protocole spécifiquement conçu pour une mise de ressources limitées, avec l'avantage que les isolats cliniques fraîchement récoltées peuvent être examinées pour phénotype sans avoir besoin de cryoconservation.
Protocol
1. Prélèvement
Les plaquettes peuvent être facilement activées par la température, l'agitation ou de stockage et par conséquent, ils doivent être manipulés avec soin. L'utilisation de vacutainers pour recueillir le sang de préparation de plaquettes est inévitable dans la plupart des situations cliniques, mais devrait être soigneusement considéré comme aspiration peut causer l'activation plaquettaire. Grâce au protocole clinique utilisée dans notre hôpital de recherche, nos échantillons sont soigneusement recueillis dans vacutainers de citrate de sodium. Nous n'avons pas connu de problèmes avec prématurée activation plaquettaire dans tel ou notre précédente étude 12. Nous recueillons sang pour la préparation des plaquettes de groupe sanguin O + personnes non spécifique pour minimiser l'agrégation de l'antigène de groupe sanguin. Les bailleurs de fonds n'ont pas non plus pris des médicaments dans les 7-10 jours précédents que certains médicaments sont connus pour influencer la fonction plaquettaire.
1.1 Préparation du plasma riche en plaquettes (PRP)
- Recueillir environ 5 mldu sang total à partir d'un hôte naïf du paludisme ou de 2,5 ml de sang de CM ou le paludisme sévère (SM) des patients dans un Vacutainer citrate de sodium (BD numéro de produit 36276).
- Centrifuger le sang total à 250 g pendant 10 min à température ambiante. Ne pas centrifuger à 4 ° C en températures basses pourraient provoquer des plaquettes à s'agréger.
- Soigneusement transférer le surnageant de pluie dans un tube de 15 ml propre. Plaquettes sont facilement activés par les variations de température et aux chocs physiques et doivent donc être manipulés avec soin. Évitez de secouer ou de mouvements saccadés du tube.
- Utilisez le haematocytometer d'un Neubauer à compter et à régler la suspension plaquettaire> 300 x 10 3 plaquettes / pl pour les donneurs sains et <150 x 10 3 plaquettes / pl de CM et les patients SM aide du tampon 1X de phosphate (pH 7,2-7,4; PBS). Veillez à choisir un facteur de dilution pour faciliter la numération plaquettaire et s'assurer de leur exactitude.
Remarque: le paludisme patients ont une numération plaquettaire réduite par rapport aux individus sains 16,17,18. Par conséquent concentrations de plaquettes de CM et de messagerie unifiée sont ajustés selon les numérations plaquettaires moyennes des patients au sein de chaque groupe de diagnostic du paludisme. Le P. falciparum phénotype agglomérante est courante dans les isolats de CM et affiche une forte affinité de liaison par conséquent, les concentrations de plaquettes réduite ne pas affecter la taille du bouquet ou la fréquence puisque la concentration plaquettaire est standardisée pour tous les cas de CM.
1.2 Préparation de plasma pauvre en plaquettes (PPP)
- Pour obtenir PPP, centrifuger une partie du PRP obtenu ci-dessus à 1500 g pendant 10 min. La majorité des plaquettes sont sédimentées au fond du tube.
- Les deux PRP et PPP peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Idéalement, utiliser des plaquettes fraîches pour le dosage agglutination. Après 8-10 jours la plupart des plaquettes sont susceptibles d'être inactifs et probablement agrégé.
2. Parasite Culture
- Laver les granulés CGR trois fois avec 5-10 ml RPMI 1640 par centrifugation à 370 g pendant 5 min.
Remarque: dans ce protocole toutes les cultures ont commencé à partir d'environ 1 hématocrite ml (PCV) et maintenu à 5% d'hématocrite. Les cultures peuvent être démarrés avec une PCV de CGR et ajustés en conséquence avec RBC non infectés et des médias pour obtenir un hématocrite désiré. - Placez le pRBC dans un flacon de culture et compléter avec un milieu de culture paludisme niveau de RPMI 1640 supplémenté avec 25 mM d'HEPES, 5% Albumax II ou 10% de sérum et de 40 pg / ml de gentamycine pour atteindre un hématocrite de 5%.
- Perméat des flacons de culture avec un mélange de 92,5% d'azote, 2,5% d'oxygène et 5% de dioxyde de carbone avant de sceller et incubation. Sinon, la méthode de pot bougie étanche à l'air de Trager-Jensen peut être utilisé.
- Pour pRBC obtenu directement à partir de patients, incuber leur flacon de culture à 24-36 heures dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO 2 pour obtenir parasites matures.
NOTE: Most laboratoire et des lignes adaptée à la culture sont très faciles à maintenir en culture dans des conditions normales. Il existe des techniques simples décrites ci-dessous qui peuvent être utilisés pour synchroniser les différents stades parasitaires de conserver le taux de croissance. - Préparer un frottis sanguin mince comme décrit ci-dessous et examiner maturation du parasite sous un microscope optique.
3. Thin Film sang préparation des lames
- Placer environ 10 à 15 pl de sang sur une extrémité d'une lame de verre dépoli reposant sur une surface plane.
- Toucher la goutte de sang avec le bord d'une deuxième glissière jusqu'à ce que le sang est uniformément répartie sur le bord de la seconde lame.
- Tout en maintenant la deuxième diapositive à une ° 45 angle, rapidement mais doucement, sans exercer trop de pression sur la première diapositive, faites glisser le sang à travers la première diapositive de faire un film mince filet de sang qui est uniformément répartie. Air sec.
- Plonger la lame dans du méthanol pendant 10 sec. Air sec.
- Plonger la lame dans 2% Giemsa stain pendant au moins 10 min. Rincez abondamment jusqu'à ce que l'eau soit claire. Air sec.
- Examinez diapositive à l'aide d'une lentille d'émulsion huile à 90-100x sur un microscope optique
4. Purification et la synchronisation des stades asexués
La purification de P. maturité falciparum pRBC est une étape nécessaire pour le dosage agglutination. En effet, seuls les parasites matures sont capables de se lier aux récepteurs plaquettaires comme il est, à ce stade du cycle de vie que les ligands concernés sont exprimés et dépassent de la surface des érythrocytes infectés. Il existe plusieurs méthodes pour purifier et synchroniser les stades asexués de P. falciparum: stades asexués tardives peuvent être enrichies par gradient de Percoll 19; cellule magnétique tri 20 ou en utilisant le protocole gélatine de sédimentation 21 décrit ici.. Sorbitol-synchronisation sélectionne pour les étapes du cycle 22, après quoi les noyaux sont cultivées pendant 24 à 26 h pour obtenir les stades matures (sans nRéalisation nécessaire pour effectuer flottation gélatine).
4.1 plasmagel Flotation
Plasmagel flottation utilise la solution de gélatine comme à sélectionner pour poids inférieur knobbed érythrocytes de rester en solution tandis que les formes et les rosettes en anneau denses coulent au fond. Cette technique donne jusqu'à 90% de pureté des érythrocytes matures stade infectés et peut être utilisé à la fois pour le terrain et les isolats de laboratoire. Cependant, comme mentionné précédemment, plasmagel flottation élimine pRBC rosettes ainsi que les stades immatures qui pourraient aboutir à une fréquence réduite agglutination dans les échantillons présentant une fréquence élevée de rosettes. Toutefois, l'absence de la pRBC rosettes après plasmagel flottation n'affecterait pas le test agglutination parce rosettes est une interaction des érythrocytes CGR et non infectées tandis que l'agglutination est pRBCs médiation contraignant par les plaquettes. Le ligand impliqué dans ces deux traits est différent, avec complément principalement récepteur CR-1 sur les érythrocytes non infectés médiation rosettes.
- Solution de milieu et Gelofusine Préchauffer II sans sérum / Albumax à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Transférer la culture à un tuyau stérile de 15 ml propre et un culot de cellules par centrifugation à température ambiante à 370 xg pendant 5 min.
- Aspirer délicatement le surnageant afin de ne pas perturber le culot et remettre les cellules dans un volume égal de Gelofusine et un milieu sans protéines.
- Transférer le mélange dans un tube stérile 15 ml et laisser reposer pendant 15-20 min dans un incubateur à 37 ° C ou jusqu'à une ligne de démarcation claire peut être vu entre un niveau supérieur et inférieur.
- Soigneusement transférer la couche supérieure dans un tube stérile 15 ml fraîche et ajouter 10 ml de RPMI frais.
- Centrifuger à 370 g pendant 5 min et jetez soigneusement surnageant.
- Évaluer stade parasitémie et de développement par frottis sanguin mince et d'examiner sous un microscope optique comme décrit dans la section 4.
NOTE: Mature gamme pRBC entre 60-90% des érythrocytes infectés depending sur la parasitémie initiale de la culture. Pour un pourcentage élevé de parasites matures, utiliser des cultures avec une parasitémie initiale de ≥ 10%.
5. Agglomérante Assay
- Utilisez le haematocytometer d'un Neubauer à compter et à régler la suspension pRBC obtenu après flottation plasmagel à 1 x 10 8 pRBC / ul.
- Dans un nouveau tube de 1,5 ml, remettre en suspension pRBC à 5% d'hématocrite, l'acridine orange à 20 pg / ml de concentration finale et PRP à 10% du volume total.
Au lieu d'acridine orange, cultures parasitaires peuvent être colorées avec 25 pg / ml de bromure d'éthidium pendant 5 minutes avant de l'utiliser.
Par exemple, pour un mélange réactionnel de 200, ajouter 10 ul pRBC mature, 20 pl de 300 x 10 3 plaquettes / pl pour PRP provenant de donneurs sains ou 150 x 10 3 plaquettes / pl de patients SM et 170 pi de milieu exempt de protéines.
NOTE: Le rapport de plaquettes: CGR dans les réactions finales est de 20:1. Ceci est important car on permet la maximeum fréquence agglutination d'un échantillon à déterminer. Si le nombre de plaquettes sont ajoutés dans les contrôles alors pas tous pRBCs agglutination pourraient avoir la chance de touffe. - De la même façon de préparer les commandes suivantes, les globules rouges non infectés et PRP, et CGR avec PPP pour déterminer le rôle des plaquettes dans l'agglutination des pRBCs.
- Transférer la suspension dans un flacon conique ml 1,5-2,0 bouchon à vis.
- Placer le flacon sous agitation douce en roulant à 10-12 min à température ambiante.
- Vérifiez la formation de touffe par une lame humide préparé par pipetage 10 pi de pRBC ± mélange des plaquettes sur une lame de verre, couvrir avec un glissement d'un verre et d'examiner sous fluorescence.
- Le prélèvement peut être effectué à intervalles de 15-20 minutes pour un total de 120 min. Un bloc est considéré comme un agrégat de trois ou plus érythrocytes infectés.
Representative Results
Un exemple d'un test de touffe plaquettaire induite par l'utilisation d'environ 70% stades matures de P. falciparum après enrichissement par flottation plasmagel est montré à la figure 2. Un bloc est un ensemble de trois ou plus érythrocytes infectés. La coloration à l'acridine orange ou du bromure d'éthidium peut être visualisé par microscopie à fluorescence. L'acridine orange est spectralement semblable à de la fluorescéine, avec un maximum d'excitation à 502 nm et un maximum d'émission à 525 nm (vert), alors que le bromure d'éthidium présente un maximum d'excitation à 493 nm et un maximum d'émission à 620 nm (proche de colorants rhodamine, rouge ). Les bouquets sont facilement repérables au microscope comme sous une lumière normale, ils apparaissent comme des agrégats de cellules et sous fluorescence des taches de vert ou rouge lorsqu'ils sont colorés à l'acridine orange ou éthidium colorants de bromure, respectivement, comme le montre la figure 2 (30 point de temps de minutes en utilisant l'acridine orange ). Plus les amas, plus l'agrégat de cellules apparaît ONUder la lumière normale et plus les taches de vert ou rouge sous fluorescence pour les colorants respectifs. Depuis l'ADN des colorants cible et donc noyaux tache, plaquettes et non infectés RBC ne sont pas détectés par microscopie fluorescente en raison de leur manque de noyaux.
Formation aléatoire de petites touffes CGR de 4,7 ± 1,6 pRBCs / touffe surviennent après 30 min. La taille de l'amas augmente de manière significative à une moyenne de> 15 / CGR touffes après une incubation de 120 min avec quelques bouquets contenant de nombreux pRBC / touffe qui ne pouvait être compté visuellement. La fréquence du phénotype agglutination est calculé comme étant le nombre de cellules infectées présentent en touffes / 1000 cellules infectées, compté dans les dosages en double.
Figure 1. Le flux de travail agglutination expérience. Plaquettes rich et pauvres plasma (A) et un P. culture érythrocytes infectés par P. falciparum (B) sont préparés et ensuite combiné pour le dosage agglutination (C).
Figure 2. Agglutination des globules rouges parasités par P. falciparum laboratoire isoler. touffes formées par HB3 au temps 0, 30 et 120 min en plasma riche en plaquettes (A) et une mauvaise formation de touffe en plasma pauvre en plaquettes (B).
Limitations de dosage
Il ya des limites qui affectent spécifiquement la fonction plaquettaire ou influence les résultats et la plupart ont déjà été mis en évidence par Arman et Rowe 15. Ici, nous mentionnons quelques-uns des problèmes qui pourraient être rencontrés à différent étapes de l'essai:
- Adaptation isolats cliniques de la culture in vitro peut être un défi que parfois des périodes de culture plus longs sont nécessaires afin d'atteindre assez parasitémie élevée pour permettre la formation de grumeaux. Avec des taux de variation antigénique élevé dans P. falciparum, le phénotype adhésif de la culture adaptée parasite peut ne pas refléter la population d'origine de l'infection parasite après des périodes prolongées dans la culture.
- Afin d'éviter l'agglutination non spécifique due à des antigènes de groupes sanguins, les donneurs de plaquettes doivent être adaptées pour l'antigène de groupe sanguin avec des isolats cliniques utilisés dans le même essai, ou le groupe d'antigène dans le sang de donneur universel O-utilisé. Toutefois, les personnes atteintes de groupe sanguin O-sont rares dans les sites africains comme le Malawi et plaquettes donc couramment utilisées sont obtenues à partir de sang du groupe O + et les bailleurs de fonds doivent être assorties de groupe sanguin.
- Compter sur un amas de préparation des lames humide est lourde et difficile pour la capture d'image que le cElls sont en mouvement constant. Habituellement, pRBC s'accumuler sur les bords de la lamelle ou ils ont tendance à coller ensemble pour former des touffes de «fausses» qui peuvent être facilement confondus avec de vrais grumeaux. Afin de réduire le mouvement des cellules, permettre aux cellules de sédiments pendant 15 min à température ambiante avant l'analyse.
- Le test agglutination est sensible au temps et donc ne permet qu'un seul échantillon à analyser par personne à la fois pour une précision optimale. Échantillonnage points dans le temps pour deux échantillons différents peut facilement se chevaucher, ce qui entraîne des points de temps d'échantillonnage ne correspondent pas entre les échantillons pour manipuler plus d'un échantillon en même temps. Dans de telles circonstances, le logiciel quantitatif sophistiqué pourrait calculer la taille de touffe ou bien encore des anticorps spécifiques des cellules pourrait être utilisé pour analyser la composition des bouquets. Bien que ces techniques peuvent améliorer considérablement l'importance des données, dans les milieux pauvres en ressources où ce test est susceptible d'être utilisée, ces techniques et de l'équipement ne sont pas facilement disponibles.
Discussion
Nous avons décrit un test agglutination des plaquettes médiée utilisé pour l'étude pRBC dans des isolats cliniques directement sur le terrain. Agglutination des plaquettes induite, un comportement caractéristique de P. isolats cliniques falciparum, a été identifié comme un phénotype adhésif distinct, fréquents dans les isolats CD36 contraignantes 12,23-24. Nous avons utilisé ce test pour identifier les trois points principaux: 1) une forte agglutination dans le phénotype in vitro de P. falciparum isolé enfants malawites qui est associé à la gravité de la maladie et le diagnostic 2) de nouveaux récepteurs de mediaties P-sélectine agglutination sur les plaquettes avec CD36, 3) le degré de thrombocytopénie présente chez les patients atteints CM est suffisante pour limiter la formation ultérieure des touffes CGR dans vitro 12. L'implication des plaquettes dans la formation de touffe est démontrée par l'examen d'une préparation humide glissière comme décrit dans la section 6. Les plaquettes peuvent être isolés à partir de PRP par centrifugation à grande vitesseafin de minimiser les réactions antigéniques des groupes sanguins, mais nous avons utilisé toute la PRP afin de minimiser prématuré activation plaquettaire d'une manipulation excessive et de la centrifugation à grande vitesse. L'activité plaquettaire peut être mesurée par un test d'agrégation plaquettaire en utilisant faibles agonistes plaquettaires, l'adrénaline ou l'adénosine diphosphate (ADP) 25 comme décrit dans 26.
Il ya plusieurs aspects de l'essai qui ont déjà été mal caractérisées, l'un d'entre eux étant l'importance de la sélection des sources PRP et l'effet des groupes d'antigènes sanguins sur les résultats de l'analyse. Nous avons préparé PRP de personnes qui étaient du groupe sanguin O + et n'avait pas pris de médicaments dans les derniers jours 7-10 avant de sang est prélevé comme certains médicaments peuvent affecter le comportement des plaquettes.
D'autres facteurs qui peuvent influer sur l'agglutination succès incluent pRBC hématocrite, les niveaux de parasitémie et la durée de l'essai agglutination. Utiliser hématocrite élevé et co plaquettairesUNT, il serait difficile de dire si le groupe est vraiment une touffe ou si trop de cellules sont simplement assis ensemble parce qu'ils sont denses 15. Généralement agglutination augmente également avec des temps d'incubation plus longs. Ce sont toutes des indications utiles qui devraient être considérés lors de la conception des études en suspension.
Nous constatons que les échantillons provenant de différents groupes cliniques peuvent être analysés en parallèle en utilisant PRP provenant du même donneur s'il est possible de le faire, mais dans des contextes de ressources limitées telles que les sites sur le terrain de la piscine de transfusion est généralement limitée. Il est donc difficile d'avoir un seul donateur + O pour standardiser les tests. Nous avons donc identifié plusieurs O + donateurs pour assurer la compatibilité du groupe sanguin mesure du possible. L'utilisation de plusieurs bailleurs de fonds est également utile dans les cas de grandes tailles d'échantillons de sorte que le fardeau du don de sang ne tombe pas sur une seule personne.
Les points de prélèvement à 15-20 min sont beaucoup plus réalisable que si une seule person effectue les dosages, ce qui permet des préparations humide diapositives et effectuer cinétique de dosage sans temps d'échantillonnage qui se chevauchent. La plupart des données microscopique est visuel et peu objective, par conséquent, il est important que le comptage des cellules est vérifiée par plus d'une personne. Dans ce cas, la manipulation d'un échantillon à la fois peut permettre une analyse complète de trois à quatre échantillons par jour en fonction de l'efficacité personnelle.
Agglutination des plaquettes à médiation peut être effectuée en utilisant les deux isolats cliniques et de laboratoire. Pour les lignes de laboratoire, il est recommandé de CD36 parasites obligatoires sont utilisés pour optimiser les fréquences agglutination. Le dosage peut être couplé avec d'autres tests d'agglutination comme rosettes ou utilisés dans l'agglutination des essais d'inhibition qui permettraient à l'étude des récepteurs sur les plaquettes qui peuvent médier contraignant pRBC, un aspect mal connu et étudié de ce phénotype.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été rendu possible grâce au financement du Wellcome Trust. JM (080 964) et SCW (080 948) ont été soutenus par des bourses du Wellcome Trust et DT par une bourse d'affectation spéciale Malawi-Liverpool-Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
| Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
| Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
| 1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
| Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
| Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
| Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
| Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |
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