Neo-Islet Bildning i Lever från diabetiska möss genom Helper-beroende adenovirusvektor genöverföring

Summary

Vi beskriver hepatisk neo-ö formation i STZ (streptozotocin)-inducerad diabetiska möss genom genöverföring av Neurogenin3 (Ngn3) och betacellulin (BTC) med hjälpare-beroende adenovirusvektor (HDAd) och återföring av hyperglykemi. Vår metod tar fördelar hjälpare beroende adenovirusvektorer med sin mycket effektiva in vivo transduktion och långvariga genuttryck.

Abstract

Typ 1-diabetes orsakas av T-cell-medierad autoimmun destruktion av insulin-producerande celler i bukspottkörteln. Hittills insulin ersättare är fortfarande den största terapi, eftersom ö transplantation har begränsats av givare tillgänglighet och av behovet av långsiktig immunsuppression. Inducerad holme neogenesis genom genöverföring av Neuogenin3 (Ngn3), den lilla ön härstamning, definiera specifika transkriptionsfaktor och betacellulin (BTC), har en liten ö tillväxtfaktor potential att bota typ 1-diabetes.

Adenovirusvektorer (Ads) är mycket effektiva genöverföringsvektor, men tidiga generationen annonser har flera nackdelar för användning in vivo. Hjälpare beroende annonser (HDAds) är de mest avancerade annonser som utvecklats för att förbättra säkerhetsprofilen för tidig generation annonser och förlänga transgenexpression ^1. De saknar kronisk toxicitet eftersom de saknar virala sekvenser ^2-5 och behålla endast Ad cis-elements nödvändiga för vektorreplikation och förpackning. Detta möjliggör kloning av upp till 36 kb gener.

I detta protokoll beskriver vi den metod för att generera HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC och leverera dessa vektorer i STZ-inducerade diabetiska möss. Våra resultat visar att samtidig injektion av HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC inducerar 'neo öar "i levern och vänder hyperglykemi hos diabetiska möss.

Protocol

1. Klon de terapeutiska generna till HDAd skyttelvektor

1. Klon mus Ngn3 och BTC cDNA in i pLPBL1 plasmidvektor som innehåller en allestädes närvarande förlängningsfaktor-1-promotorn (BIM) och en poly A-signalen. Efter avslutad, kontrollera vektorer genom sekvensanalys och subklona dessa expressionskassetter i pΔ28 HDAd skyttelplasmid ^6.
2. Smälta HDAd skyttelvektorer från Pmel att frigöra plasmidryggraden, rena DNA genom fenol / kloroform / isoamylalkohol extraktion följt av etanolutfällning och rekonstituera med transfektion-kvalitet vatten.

2. Hjälpar-beroende adenovirusvektor Produktion

HDAd vektor framställning innebär flera steg som måste följas noga för optimalt resultat.

2,1 Transfektion

1. Två dagar före transfektion, utsäde 116 celler ⁷ in 6-cm skål för att nå 70-80% sammanflytande på dagen för transfektion.
2. Tre timmar före transfektion, avlägsna mediet och tillsätt 5 ml färskt tillväxtmedium [MEM kompletterat med 10% FBS och 1% PSG (penicillin, streptomycin och glutamin), Invitrogen].
3. Transfektera 116 celler med 10 ng DNA från steg 1,2), med hjälp av ProFectionR Mammalian transfektion kit från Promega enligt tillverkarens anvisningar.
4. Nästa dag, tvätta cellerna med 1 ml tillväxtmedium 2 gånger. Lägg hjälparvirus (HV) vid 500 vektorpartiklar (rd) / cell till 0,1 ml av PBS innehållande kalcium och magnesium (PBS + +) och överlägg till cellerna. Skaka rätter att jämnt fördela HV varje 10 min.
5. Efter 60 minuter, tillsätt 1,5 ml upprätthållande medium (MEM, 5% FBS, 1% PSG).
6. Lägga till ytterligare 1 ml underhållsmedium nästa dag.
7. Observera celler för CPE (cytopatisk effekt - cellerna blir rundade och villa). Mer än 80% av cellerna bör visa CPE 2 dagar efter infektion.
8. Samla råcell-lysatet (CVL, celler och medium), endd 10% volym av 40% sackaros och lagra vid -80 ° C. Den CVL är märkt som passagen 0 - (CVL-P0).

2,2 Vector förstärkning

1. Freeze (-80 ° C, 3-5 minuter) / upptining (37 ° C, 1-2 minuter) 3 gånger.
2. Overlay 0,5 ml CVL kompletteras med HV vid 200 VP / cell till sammanflytande 116 celler i 6-cm skål och rocka skålen försiktigt varje 5 min. Efter 30 minuter, tillsätt 1 medelstor ml underhåll.
3. Tillsätt 1 ml av underhållsmedium nästa dag. 2 dagar senare, bör de flesta av cellerna visar CPE.
4. Samla CVL och förvara vid -80 ° C. (CVL-P1) såsom beskrivits för steg 2.1.8).
5. Upprepa proceduren för 3 gånger för att få CVL P2-P4.
6. Extrahera DNA (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) från 0,2 ml CVL insamlade vid P1-P4, och analysera vektorn amplifiering med qPCR hjälp HV-och HDAd-specifika primrar (Tabell 1). Använd passagen där HDAd exponentiellt förstärkt i förhållande till HV (P3 i Figur 2) för subsequent förfarande.
7. Co-smitta 90% sammanflytande 116 celler i 15 cm skål med 0,5 ml CVL och HV vid 200 rd / cell. Rock skålen försiktigt varje 5 min. Efter 30 minuter, tillsätt 10 ml av underhåll medium.
8. Tillsätt 5 ml underhållsmedium efter 24 timmar.
9. Samla cellerna genom centrifugering vid 1.500 x g under 5 minuter exakt 48 timmar efter infektion.
10. Re-suspendera celler i 1 ml PBS + + innehållande 4% sukros (P5) och frys vid -80 ° C.

2,3 Storskalig HDAd produktion

1. För att bereda 116-celler för infektion i suspension cellodling, överföra konfluenta 116 celler i 8 x 15-cm skål i 3 L spinnerflaska och tillsätt medelhög fjädring tillväxt (Joklik modifierat MEM kompletterat med 5% FBS, 0,1 mg / ml hygromycin och 1% PSG) till slutlig 1 L, och inkubera i en CO ₂ inkubator med spinning vid 60 varv per minut ^8.
2. Tillsätt 0,5 liter färskt medium varje dag i 2 dagar (totalt 2 liter).
3. Räkna cellerna på den tredje dagen. Celler är redo att använda om nå to totala cellantalet av 1x10 ^9.
4. Frys / tina P5 3 gånger.
5. Samla cellerna från 3 L spinnkolv genom centrifugering vid 1.000 x g under 5 min. Spara 100 ml supernatant till återsuspendera cellerna.
6. Överför celler till en 250-ml spinnkolv. Lägg P5 och HV vid 200 rd / cell för celler och inkubera under 1 timme vid 37 ° C vid 60 varv per minut.
7. Överför celler och medium till 3 L spinner kolv, tillsätt 2 L medelhög fjädring tillväxt. Överför 1 ml cellsuspension till en brunn i en 12-brunnars platta för att observera celler för CPE.
8. Inkubera cellerna i spinnerflaska under 2 dagar i en CO ₂ inkubator vid 60 varv per minut.
9. Samla cellerna genom centrifugering och återsuspendera med 15 ml 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) och förvaras vid -80 ° C (P6) tills rening.

2,4 Vector rening

1. Tillsätt 1,0 ml av 5% natriumdeoxikolat till P6. Blanda försiktigt och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur.
2. Tillsätt 400 | il 2 M MgCb _2, 300 μl RNas A (10 mg / ml), och 300 pl DNas I (10 mg / ml) och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
3. Centrifugera vid 6.000 xg i 10 min vid rumstemperatur för att samla supematanten.
4. Sterilisera NVT 65 ultracentrifug rör (Beckman) under UV-ljus under 1 timme i vävnadsodling huva.
5. Lägg 2,8 ml låg densitet CsCl-lösning (1,25 g / ml), underlag 2,8 ml hög densitet CsCl densitet lösning (1.41g/ml) och sedan överlagring 5-6 ml av supernatanten för att fylla röret till halsen. Använd 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) för att fylla röret vid behov.
6. Centrifugera vid 10 ° C under 30 minuter vid 50.000 rpm vid 10 ° C med Beckman LE-80K med NVT-65 rötor.
7. Torka området med 70% etanol för nålstick, och samla den nedre opaliserande bandet med en 3-ml spruta utrustad med 22-G nål genom sidoförstärkning (figur 3a). Ibland en mycket svag hjälpare band kan ses under mer framträdande vektorn bandet. Försöka få så mycket av the vektor band som möjligt, utan hjälpare bandet. Det är acceptabelt i detta steg, även om en del av hjälpar-bandet aspireras, eftersom det kommer att separeras vid efterföljande natten centrifugering som följer.
8. Placera de insamlade banden i en steriliserad ny ultracentrifug rör. Fyll rören till halsen genom att lägga 1,35 g / ml CsCl densitet lösning.
9. Centrifugera vid 10 ° C vid 50.000 varv per minut över natten. Samla den opaliserande bandet (figur 3b).
10. Överför bandet i en dialys kassett (Slide-a-Lyzer, 10.000 MWCO, Thermo-vetenskaplig).
11. Dialysera mot 3 liter autoklaverat 10 mM Tis-HCl, pH 7,2 innehållande ₂ mM MgCl2 och 4% sackaros vid 4 ° C över natten.
12. Ta bort HDAd vektor från dialys kassett. Alikvotera 20 ul för fysisk titer och 50 pl för DNA karakterisering. (Obs: För Ngn3 vektor, upprepa "P6" tre gånger för att få tillräckligt med vektor eftersom utbytet av HDAd-Ngn3 är dålig jämfört med HDAd-BTC eller HDAd-tomt.)

2,5 Karakterisering av HDAd vektorer

1. Bestäm fysiska titern (vp / ml) med användning av optisk densitet (OD). Tillsätt 20 | il vektor eller 20 pl dialysbuffert till 380 pl TE-buffert innehållande 0,1% SDS och inkubera vid 56 ° C under 20 minuter. Mät OD vid 260 nm. Den fysiska titer = OD260 x 1,1 x 10 ¹² X 20 (vp / ml).
2. Analysera HV kontaminering av qPCR. Använd 50 ^ alikvot att extrahera DNA med användning DNeasy vävnad / blod DNA Extraction-kit (Qiagen). Späd DNA 1000-faldigt och ta 5 pl för qPCR analys med användning av hjälparfag och vektor-specifika primrar (Tabell 1). Hjälpar kontaminering bör vara mindre än 1%, såsom visas i figur 4A.
3. Använd Southern blöt för att analysera vektorn struktur. Utför Southern blot-analys ¹⁰ med användning av en sond för den inverterade terminala upprepningen (ITR). Den representativt resultat visas i Figur 4B.
4. Bestäm in vitro-effekt. Infektera käntantal 116-celler i en 12-brunnsplatta med HDAd vektor vid 1000 rd / cell i kvadruplikat. Skörda cellerna efter 48 timmar och extrahera RNA för att bestämma uttryck av Ngn3 och BTC mRNA från QRT-PCR (tabell 1). Representativa resultat visas i Figur 5.

3. Behandling av diabetiska möss genom HDAd-Ngn3 och-BTC

3,1 Induktion av diabetes hos möss och injektion av HDAd vektorer

1. Beredning av STZ: Förbered 0,1 M citratbuffert och justera pH till 4,3-4,5. Filtrera detta genom en 0,22 mm sprutfilter. Användning av sterilt vatten späda detta till 0,01 M Na-citrat pH 4,2-4,5. Lös lämplig mängd av STZ (Sigma) i denna lösning för att uppnå en slutlig koncentration av 12,5 mg / ml. Vid denna koncentration finns ingen utfällning. Förvara denna STZ lösning vid 4 ° C tills användes. Öka temperaturen hos den injicering lösningen till rumstemperatur omedelbart före injektion. Den STZ lösningen should beredas på nytt varje dag och injiceras inom 5-10 minuter för att upplösas.
2. Injicera detta STZ lösning intraperitonealt (10 ^ / g för att uppnå en dos av 125 pg / g kroppsvikt), på kvällen mellan 5-7 pm (innan släcks i mus anläggningen och mössen börja mata aktivt), på två på varandra följande dagar ^9.

3,2 Övervakning möss glukos och injektion av HDAd vektorer.

1. Snabba möss för 6 timmar och mäta kroppsvikt och blodsocker vecka tills möss har hyperglykemi (≥ 250mg/dl). Använd en One Touch glukometer för blod samlas in av svansen klipp. När blodsockret är ≥ 250 mg / dl, kontrollera igen blodsockret igen 48 timmar efter 6 timmar snabbt för att säkerställa ihållande hyperglykemi och blodglukos ligger inom målintervallet för behandling: 250-500 mg / dl.
2. Behandla möss med ihållande hyperglykemi genom en enda intravenös injektion av HDAd vektorer via svansvenen. Den totala vektor dosen är 6x10 ¹¹ rdför alla behandlingsgrupper (i 0,25 ml): 5x10 ¹¹ rd Ngn3 en x10 ¹¹ vp BTC för kombination grupp, 5x10 ¹¹ rd Ngn3 + 1x10 ¹¹ VP för Ngn3 grupp, och 1x10 ¹¹ vp BTC + 5x10 ¹¹ rd tom vektor för BTC-gruppen och 6x10 ¹¹ rd tom vektor för kontrollgruppen.
3. Svansveninjektion. Sätt möss i Tailveiner fixeringsutrustning (TV-150, Braintree Scientific Inc.), och använd varmt vatten för att vidga svansvenerna, rengör svansen med 70% alkohol. Håll svansen under injektionsstället mellan tummen och pekfingret i handen, använd en annan hand för injektion. Före injektion se till att det inte finns några bubblor i sprutan (med 30 ^1/2 G nål och 1 ml spruta). Sätt i nålen och injicera vektorn långsamt. Om nålen är i venen, kan en blixt av blod ses i navet av nålen och det finns också något motstånd under injektion. Efter avlägsnande av nålen, håll injektionsstället med gasväv för att stoppa blödning innan han återvände möss tO bur.
   Om nålen inte i venen det finns en betydande motstånd mot injektion och en liten subkutan strimmigt uppstår. Vid denna tid bort nålen och försök igen på ett annat ställe.

3,3 Analys av effekter av HDAd-Ngn3 + HDAd-BTC behandling.

1. Monitor 6 h fasteglukos och kroppsvikt varje vecka efter vektor behandling.
2. Samla blod från vena saphena eller svansven i benet var 2 veckor för att analysera insulin (mus Insulin ELISA kit, Mercodia) och leverenzymer (ASAT och ALAT Infinity reagenser, Thermo Scientific) med kommersiella kit.
   1. Placera musen i ett icke-begränsade 50 ml Falcon-rör med hål gjorda i den slutna änden.
   2. Musens huvud är vid den slutna änden av röret och ben och svans vid den öppna sidan av röret. Att samla upp blod från vänster ben, förlänga den vänstra ben utsidan av röret och försiktigt klämma huden på låret mellan tummen och pekfingret för att immobilisera benet.
   3. Använden rakapparat för att ta bort hår från skenbenet / underben område, för att exponera vena saphena, som är närvarande på den laterala sidan av underbenet. Rengör rakade huden med 70% alkohol och låt den torka.
   4. Punktera vena saphena med en 25 gauge nål, Samla blodet med Microvette CB300 rör (Sarstedt) och sätta rören på isen.
   5. Tryck på stickstället med gasväv för att stoppa blödning innan han återvände mössen till burarna.
   6. Centrifugera rören vid 3.000 x g under 5 minuter, ta supernatanten och lagra vid -20 ° C för vidare analys.

3,4 Utför glukostoleranstest (GTT) vid 6 veckor efter behandlingen.

1. Upplöst D-glukos (Sigma) i destillerat vatten för att göra 15% glukos (15 g / 100 ml) och sterilfilter glukos.
2. Snabba möss för 6 timmar. Använd varm dyna att värma mössen och samla blodet (0 min tidpunkt). Sedan injicera 1,5 g / kg av D-glukos ip (10 | il / g 15% glukos).
3. Collect blod vid 15, 30, 60, 120 minuter.
4. Mät glukos och insulin i dessa prover.

3,5 Mjukpapper analys för att bedöma uttrycket av vektorerna och bedöma induktion av ö neogenesis.

I alla dessa steg de kontroller som krävs för att tillförlitligt tolka resultaten är: (1) Tom vektor som behandlats diabetiska möss (2) icke-diabetiska möss och (3) icke-diabetiker bukspottkörtel fungerar som en positiv kontroll för att uttrycka holmen specifika hormoner och transkriptionsfaktorer.

1. Skörd lever och bukspottkörtel vid 3 och 6 veckor efter behandling. Dela upp i 2 delar, den första för snäpp frysning i flytande kväve och lagring vid -80 ° C för RNA och protein extraktion, och det andra att fastställa med 10% formalin över natten för immunohistokemi analys.
2. Extrahera RNA genom ett standardprotokoll och analysera uttryck av ö specifika hormoner och transkriptionella faktorer, tillsammans med Ngn3 och BTC till bekräftelsem vektor uttryck i levern genom QRT-PCR med specifika primers ^{9, 10.}
3. Extrahera insulin och C-peptid från levern genom syra-etanolextraktion metod och kvantifiera av ett kommersiellt ELISA-kit (ultra känsliga insulin analys Mercodia, C-peptid ELISA-kit, Wako).
4. Utför immunfärgning för ö specifika hormoner (insulin, glukagon, PP, SST) tillsammans med ö specifika transkriptionsfaktorer i paraffininbäddade sektionerna ^{9, 10.} Uttrycket av Ngn3 och BTC kan också bekräftas genom immunfärgning.

4. Representativa resultat

Vi klonade Ngn3 och BTC cDNA i pΔ28 vektorer som drivs av allestädes närvarande promotor eIF2a (BOS) och genererade HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC. Såsom visas i figur 2, minskad relativ HV kontamination avsevärt (vilket innebär mer vektor förstärkning och mindre hjälpar förstärkning) vid passage 3. Därför använde vi P3 för efterföljande vektor produktion. Efter den förstaCsCl diskontinuerlig gradient och ultracentrifugering, uppsamlades vi den lägsta vektorn bandet och sedan uppsamlas den opaliserande bandet motsvarande HDAd vektor i den andra ultracentrifugering (figur 3). Det renade HDAd vektorn hade mindre än 1% av HV förorening (Figur 4A) av qPCR och hade ingen hjälpare förorening synlig på Southern blotting (Figur 4B), vilket indikerar tillräcklig kvalitet för vektor infusion i möss. Ytterligare analys ingår transgenexpression genom infektion av 116 celler. MRNA expressionsnivåer av Ngn3 och BTC var högre i vektor infekterade celler med över 10.000-faldigt jämfört med dem i icke-infekterade celler (Figur 5).

HDAd-Ngn3 och-BTC administrerades sedan till STZ-inducerade diabetiska möss via svansvensinjektion med tom vektor injicerad och HDAd-BTC injicerade möss diabetiska tjänar som negativ kontroll. Hyperglykemi vändes och glukos-stimulerad insulinsekretionåterställdes i möss som behandlats med både HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC men inte hos möss som behandlats med enda gen vektor eller kontroll tom vektor (Figur 6). Den HDAd-Ngn3-BTC behandling inducerad holme neogenesis och detta kvantifierades genom analys av den totala insulin och C-peptid innehåll (figur 6E) med icke-diabetiker, diabetiska tom behandlade vektor möss tjänar som kontroller. Närvaron av C-peptid och insulin i ekvimolära förhållanden bekräftar att insulinet som detekteras i levern verkligen syntetiseras i levern. RT-qPCR bekräftade att levern av HDAd-Ngn3-BTC behandlade möss uttryckte alla ö-specifika hormoner och transkriptionsfaktorer ^9. Immunohistokemi visade insulin positiva celler i levern hos möss som behandlats med HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC, men inget insulin positiva celler observerades i möss behandlade med kontroll vektorn (figur 7). Vi bekräftade också att det inte fanns några rester öar i bukspottkörteln av Ngn3-BTC treated möss jämfört med de många öarna i icke-diabetiker bukspottkörteln. Vector (Ngn3 och BTC) tillsammans med ö specifik härstamning transkriptionsfaktor (PDX-1 och Nkx6.1) uttryck bedömdes också genom immunfärgning av levern (Figur 7).

Figur 1. Flödesschema för genterapi av diabetiska möss med hjälpare-beroende virus-system. Först Ngn3 och BTC, i en kassett som drivs av en allestädes närvarande BIM promotor, klonas i HDAd buss (pΔ28) vektorer. HDAd produceras av flera steg inklusive transfektion, seriella passager av amplifiering, och en storskalig infektion följt av vektor rening. Efter att karakterisera kvalitet, HDAds injiceras intravenöst i STZ-inducerade diabetiska möss genom svansvenen. Effekterna av behandling bedöms genom att mäta glukos, kroppsvikt, GTT och genom analyser av genuttrycki levern.

Figur 2. Bestämning HDAd vektor förstärkning. DNA extraheras från passagen P0 till P4 med kit DNA extraktion (Qiagen). DNA späds 1000-faldigt och 5 pl DNA används för realtids-PCR (qPCR). Hjälpare och vektor-specifika primers används. Standardkurvor genereras av serieutspädningar (10 ^-5 till 1 ng / ml) av HDAd plasmid och HV skyttelvektor plasmid (toppanelerna). Använda standardkurvorna och Ct-värdena för vektorn och hjälparviruset kopieantalet beräknas och förhållandet HDAd / HV plottas som en procentandel av den totala viruset (hjälpare + HDAd). Därför är relativ vektor förstärkning beräknas som: [vektor kopieantal / (vektor + hjälpvirus antalet exemplar)]. I det visade exemplet (nedre panelen) HDAd vektor förstärkning planade på P4, medan den relativa HDAd / HV ökar i P3. Därför, P3 väljs för det efterföljande steget.

Figur 3. Representativa HDAd vektor band efter diskontinuerlig CsCl densitet ultracentrifugering. HDAd vektor renas från en 3L spinnerkultur över sekventiell CsCl densitetsgradient. (A) Efter första densitetsgradient ultracentrifugering, är en enda opaliserande vektor band synligt (pil) under ogenomskinlig cellrester (CD). Den opaliserande bandet (pil) samlas in för den andra densitetsgradientcentrifugering. (B) Efter den andra densitetsgradient ultracentrifugering är opaliserande bandet (pil) samlas in för dialys.

Figur 4. Analys av hjälparvirus kontaminering. DNA extraheras från 50 ^ renat virus och hjälpare kontaminering är ettssessed såsom i figur 2. Figuren visar hjälpare förorening av HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC är mindre än 1%.

Figur 5. Analys av strukturen av HDAd vektor. Southern blöt utförs såsom beskrivits tidigare (Oka K, et al.). Bana 1: DNA från hjälparvirus, Bana 2: DNA från P3, Bana 3: DNA från P4, Bana 4: renat vectopr. Öppna pilar indikerar hjälpvirus härledda band och de fyllda pilarna indikerar ITR banden härledda från HDAd vektorn.

Figur 6. Expression nivå Ngn3 eller BTC i 116 celler infekterade med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC vektor. 116 celler i en 12 brunnar är infekterade med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC eller tom vektor vid 1000 rd / cell under 2 dagar. CeLLS skördas och total-RNA extraheras med Trizol reagens. QRT-PCR utförs med användning Ngn3-eller BTC-specifika primrar. Den relativa Ngn3 eller BTC mRNA-expression ökade med drygt 10.000-faldigt i celler infekterade med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC. Figuren återges från Dev.Cell mar 2009, 16 (3): 358-73, Yechoor et. al., med tillstånd från Elsevier.

Figur 7. Genöverföring av HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC i STZ-inducerade diabetiska möss leder till återföring av diabetes och induktion av ö neogenesis i levern. (A) plasma glukos och (B) kroppsvikt av STZ-inducerade diabetiska möss behandlade med HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC. (C) plasma glukos och insulin under en IP-GTT vid 6 veckor efter behandling. (D) Representant insulin färgning i levern 12 veckor efter behandling. * P <0,05 (jämfört med tom vektor grupp). Figuren återges från Dev. CelL 2009 Mar, 16 (3): 358-73; Yechoor et al, med tillstånd från Elsevier..

namn	framåtriktad primer	omvänd primer
hjälpare	GACCATCAATCTTGACGACC	ATGTCGCTTTCCAGAACCC
vektor	TTGGGCGTAACCGAGTAAG	ACTTCCTACCCATAAGCTCC
Ngn3	AAGAGCGAGTTGGCACTCAG	TCTGAGTCAGTGCCCAGATG
BTC	GCACAGGTACCACCCCTAGA	TGAACACCACCATGACCACT

Tabell 1. Primersekvenser.

Discussion

HDAds har utvecklats för att övervinna den svaga tidiga generationen annonser och utnyttja för genterapi applikation. Men tekniska utmaningar återstår. Till exempel kräver HDAd HV för HDAd förpackning och vektor förstärkning är inte lika effektiv som tidiga generationen annonser. HV är ett första generationens annons och kontaminering av HV kompromiss effektivitet HDAd. Därför mycket effektiv transfektion och optimala förhållanden för varje seriepassage är kritiska. En annan kritisk parameter för vektorproduktion är vilken passage (P1-P4) bör användas för efterföljande passage 5 som direkt används som inokulum för suspensionsceller. Till vår erfarenhet är de bästa resultaten erhålls genom att använda passagen genom vilken HDAd vektor andel dramatiskt i följande avsnitt (P3 i figur 2). Utbytet för HDAd vektorer beror på transgena kassetter. Under vektor produktion båda transgenerna uttrycks eftersom båda generna är underallestädes närvarande promotor. Ngn3 är en transkriptionsfaktor och BTC är en tillväxtfaktor, vilket tyder på att HDAd vektor som uttrycker transkriptionsfaktor som kan påverka cellinje hämmar vektor förstärkning medan uttrycker tillväxthormon hjälper vektorreplikation och förpackning.

Med diabetes antar epidemiska proportioner, nya metoder för att återställa B-cell massa som krävs. I denna rapport beskriver vi metoder för att utnyttja fördelarna med HDAd vektorer för att åstadkomma genöverföring av ö-härstamning, definition transkriptionsfaktor, Ngn3 tillsammans med den lilla ön tillväxtfaktor, till betacellulin framkalla holme neogenesis i periportala regioner i levern. För att bedöma effekten av detta är det viktigt att välja möss med stabil hyperglykemi och se till att lämpliga kontroller alltid ingår. För detta experiment genöverföring, behandlade den tomma vektorn diabetiska möss alltid bör användas. Dessutom, med hjälp av HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC individuellt behandlad diabetes kmce tjänar att testa enskilda bidraget från dessa två gener i holme neogenesis. Eftersom våra data visar att Ngn3 ensam är tillräcklig för att inducera holme neogenesis, men tillsatsen av tillväxtfaktorn, BTC, tjänar till att förstärka svaret leder till robusta induktion av ö neogenesis. Det är också viktigt att testa att vektorn expressionen verkligen uppnås i målvävnaden, levern och även att visa att insulinet analyseras i plasman hos behandlade möss inte kommer från kvarvarande cellöar i bukspottkörteln, genom att visa frånvaron av pankreatiska cellöar i diabetiska möss.

Sammanfattningsvis ligger fördelen med HDAd-vektorsystem för genöverföring i dess höga kapacitet kloning, effektiv transduktion och långvarig genexpression i levern med minsta kronisk toxicitet samt dess karaktär av icke-integrering av vektorgenomet i värden kromosom. De primära begränsningarna är de komplexa stegen i sin generation och dessin vivo-applikation är primärt begränsad till levern med den mest populära annonser serotyp 5. Holme neogenesis kan induceras till fullo återställa plasma insulin och glukos tolerans i diabetiska möss genom att inducera ö neogenesis i levern genom genöverföring av ö härstamning-definierad transkriptionsfaktor, Ngn3 tillsammans med den lilla ön tillväxtfaktorn, betacellulin. I denna rapport visar vi den optimala protokollet för att generera hög kvalitet HDAd-Ngn3 och HDAd-BTC, och visa tekniker att inducera och bedöma holme neogenesis i levern hos diabetiska möss att vända hyperglykemi.

Fotnot: De virala vektorer och cellinjer som beskrivs här är tillgängliga från Vector Production Core-Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731 ). Vissa kommersiella kit finns också för att generera HDAd virus (t.ex. Microbix biosystems Inc.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ProFectionR Mammalian Transfection kit	Promega	E1200
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Qiagen	69504
PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROX	Quanta Biosciences	95055-500
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
MEM powder	Invitrogen	61100087
Penicillin Streptomycin	Sigma	15140122
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
L-glutamine	Invitrogen	25030-081
Hygromycin B	Sigma	H0654-1G
MEM EAGLE JOKLIK	Sigma	M0518-10L
Rnase	Roche	10109169001
DNase I, grade II	Roche	10104159001
Streptozocin	Sigma	s0130
Glass spinner flasks	Corning	4500-3L
Glass spinner flasks	Corning	4500-250
Slide A-lyzer casset	PIERCE CH	PI66380
Tube optiseal poly allomer, 11.2 ml	Beckman Coulter	362181
Cesium chloride 1 kg	JT4042-2	VWR
Beckman LE-80K	Beckman Coulter	Optimal LE-80K ultracentrifuge
Filter	VWR	28143-338
centrifuge tube 500 ml	Corning	431123
tailveiner restrainer	Braintree scientific , INC	tv-150
Insulin, Mouse ELISA	Mercodia	10-1247-01
microvette CB300	Sarstedt	16.443.100
D-glucose	Sigma	G8270
Mouse C-peptide ELISA Kit	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	#631-07231
guinea pig anti-insulin antibody	Abcam	ab7842
goat anti-Pdx1 antibody	gift from Dr. Christopher Wright
mouse anti Ngn3 antibody	Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania	AB2013
mouse anti Nkx6.1 antibody	Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania	F64A6B4
anti- betacellulin antibody	Cell Sciences	PAAQ1
ALT (SGPT) Color Reagent SET.	Teco Diagnostics	A526 - 120
AST/(SGOT), Color Endpoint Reagent Set	Teco Diagnostics	A561-120
Table 2. Specific Reagents and Equipment.