Neo-Islet Dannelse i leverskader av diabetiske mus med Helper-avhengig adenovirusvektor-mediert genoverføring

Summary

Vi beskriver nedsatt neo-holme formasjonen i STZ (streptozotocin)-indusert diabetiske mus ved genoverføring av Neurogenin3 (Ngn3) og Betacellulin (BTC) med helper-avhengig adenovirusvektor (HDAd) og reversering av hyperglykemi. Vår metode tar fordeler av helper-avhengige adenovirale vektorer med sin svært effektiv in vivo transduksjon og langvarig genuttrykk.

Abstract

Type 1 diabetes er forårsaket av T-celle-mediert autoimmun ødeleggelse av insulin-produserende celler i bukspyttkjertelen. Inntil nå insulin erstatning er fortsatt den store terapi, fordi holme transplantasjon har vært begrenset av donor tilgjengelighet og av behovet for langsiktig immunsuppresjon. Indusert holme neogenesis ved genoverføring av Neuogenin3 (Ngn3), holmen avstamning-definerende spesifikk transkripsjonsfaktor og Betacellulin (BTC), har en holme vekstfaktor potensial til å kurere type 1 diabetes.

Adenovirale vektorer (ADS) er svært effektiv genoverføring vektor, men tidlig generasjon Ads har flere ulemper for in vivo bruk. Helper-avhengige Annonser (HDAds) er de mest avanserte Annonser som ble utviklet for å forbedre sikkerheten profilen tidlig generasjon av annonser og å forlenge transgene uttrykk ^en. De mangler kronisk toksisitet fordi de mangler viral kodende sekvenser ^2-5 og beholde bare Ad cis elements nødvendige for vektor replikering og emballasje. Dette tillater kloning av opptil 36 kb gener.

I denne protokollen beskriver vi metoden for å generere HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC og å levere disse vektorer i STZ-induserte diabetiske mus. Våre resultater viser at co-injeksjon av HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC induserer 'neo holmer "i leveren og reverserer hyperglykemi hos diabetikere mus.

Protocol

1. Klone terapeutiske gener til HDAd Shuttle Vector

1. Clone mus Ngn3 og BTC cDNA'ene inn i pLPBL1 plasmid vektor som inneholder en allestedsnærværende elongeringsfaktor-1 promoter (BOS) og en poly et signal. Ved ferdigstillelse bekrefte vektorer ved sekvens analyse og deretter subklon disse ekspresjonskassetter inn pΔ28 HDAd shuttle plasmid ^6.
2. Digest HDAd shuttle vektorer av PmeI å frigjøre plasmid ryggraden, rense DNA ved fenol / kloroform / isoamylalkohol utvinning etterfulgt av etanol nedbør og gjeninnføre med transfeksjon-grade vann.

2. Helper-avhengige adenovirusvektor Produksjon

HDAd vektor produksjon innebærer flere trinn som må følges nøye for optimale resultater.

2,1 Transfeksjon

1. To dager før transfeksjon, frø 116 celler ⁷ i 6-cm rett til å nå 70-80% confluent den dagen transfeksjon.
2. Tre timer før transfeksjon, fjerne medium og tilsett 5 ml frisk dyrkningsmedium [MEM supplert med 10% FBS og 1% PSG (penicillin, streptomycin og glutamin), Invitrogen].
3. Transfektere 116 celler med 10 mikrogram DNA fra trinn 1.2), ved hjelp av ProFectionR Mammalian Transfeksjon kit fra Promega i henhold til produsentens instruksjoner.
4. Neste dag, vaske cellene med 1 ml vekstmedium 2 ganger. Legg helper virus (HV) ved 500 vektor partikler (VP) / celle til 0,1 ml PBS inneholdende kalsium og magnesium (PBS + +) og overlegget til cellene. Rist retter å fordele HV hvert 10 min.
5. Etter 60 min, tilsett 1,5 ml opprettholdelsesmedium (MEM, 5% FBS, 1% PSG).
6. Legge til en annen 1 ml opprettholdelsesmedium neste dag.
7. Observere celler for CPE (cytopatisk Effect - celler blir avrundet og frittliggende). Større enn 80% av celler bør vise CPE 2 dager etter infeksjon.
8. Utlevering råolje cellelysat (CVL, celler og medium), etdd 10% volum 40% sukrose og oppbevar ved -80 ° C. Den CVL er merket som passasje 0 - (CVL-P0).

2.2 Vector forsterkning

1. Freeze (-80 ° C, 3-5 min) / tining (37 ° C, 1-2 min) 3 ganger.
2. Overlegg 0,5 ml CVL supplert med HV på 200 vp / celle til confluent 116 celler i 6-cm parabol og rock fatet forsiktig hver 5 min. Etter 30 min, tilsett 1 ml opprettholdelsesmedium.
3. Tilsett 1 ml av opprettholdelsesmedium neste dag. 2 dager senere, skal de fleste av cellene viser CPE.
4. Samle CVL og oppbevar ved -80 ° C (CVL-P1), som beskrevet for trinn 2.1.8).
5. Gjenta prosedyren for 3 ganger for å få CVL P2-P4.
6. Pakk DNA (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) fra 0,2 ml CVL samlet på P1-P4, og analysere vektor forsterkning av qPCR hjelp HV-og HDAd-spesifikke primere (tabell 1). Bruk avsnitt hvor HDAd eksponentielt forsterket i forhold til HV (P3 i figur 2) for subsequent prosedyre.
7. Co-smitte 90% confluent 116 celler i 15cm tallerken med 0,5 ml CVL og HV på 200 VP / celle. Rock fatet forsiktig hver 5 min. Etter 30 min, tilsettes 10 ml opprettholdelsesmedium.
8. Tilsett 5 ml av vedlikehold medium etter 24 timer.
9. Samle celler ved sentrifugering ved 1500 xg i 5 min nøyaktig 48 hr etter smitte.
10. Resuspendere cellene i 1 ml PBS + + inneholdende 4% sukrose (P5) og fryse ved -80 ° C.

2.3 Storskala HDAd produksjon

1. For å forberede 116 celler for infeksjon i suspensjon cellekultur, overføre confluent 116 celler i 8 x 15-cm rett inn 3 L spinner kolbe og tilsett suspensjon dyrkningsmedium (Joklik modifisert MEM supplert med 5% FBS, 0,1 mg / ml hygromycin og 1% PSG) til endelig en L, og inkuberes i en CO ₂ inkubator med spinning på 60 rpm ^8.
2. Tilsett 0,5 L av friskt medium hver dag i 2 dager (totalt 2 L).
3. Telle celler på den tredje dagen. Cellene er klar til å bruke hvis nå to total celle antall 1x10 ^9.
4. Fryse / tine P5 3 ganger.
5. Samle celler fra 3 L spinner kolbe ved sentrifugering ved 1000 xg i 5 min. Spar 100 ml supernatant å re-suspendere cellene.
6. Overføre celler til en 250-ml kolbe spinner. Legg P5 og HV på 200 vp / celle til cellene og inkuberes i 1 time ved 37 ° C ved 60 rpm.
7. Overfør celler og middels til 3 L spinner kolbe, tilsett 2 L suspensjon vekstmedium. Overfør 1 ml cellesuspensjon til en brønn i en 12-brønns plate å observere cellene for CPE.
8. Inkuber celler i spinner kolbe for 2 dager på CO ₂ inkubator ved 60 rpm.
9. Samle celler ved sentrifugering og re-suspendere med 15 ml 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) og oppbevar ved -80 ° C (P6) til rensing.

2.4 Vector rensing

1. Tilsett 1,0 ml av 5% natrium-deoksycholat til P6. Bland forsiktig og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
2. Tilsett 400 ul av 2 M ₂ MgCl, 300 μl RNase A (10 mg / ml), og 300 pl av DNase I (10 mg / ml) og inkuber ved 37 ° C i 1 time.
3. Sentrifuger ved 6000 xg i 10 min ved romtemperatur for å samle supernatanten.
4. Steriliser NVT 65 Ultrasentrifuger rør (Beckman) under UV-lys for 1 hr i vevskultur panseret.
5. Legg 2,8 ml lav tetthet CsCl løsning (1,25 g / ml), 2,8 ml underlag av høy tetthet CsCl densitet løsning (1.41g/ml) og deretter overlegg 5-6 ml supernatant til fylle røret til halsen. Bruke 100 mM Tris-HCl (pH8.0) for å fylle røret om nødvendig.
6. Sentrifuger ved 10 ° C i 30 minutter ved 50.000 rpm ved 10 ° C med Beckman LE-80K med NVT-65 rotoren.
7. Tørk området med 70% etanol for nålestikk, og samle den nedre opaliserende band med en 3 ml sprøyte utstyrt med 22-G kanyle ved side punktering (Figur 3a). Noen ganger en veldig svak hjelper bandet kan sees under mer fremtredende vektor bandet. Prøv å få så mye av the vektor bandet som mulig, uten hjelperen bandet. Det er akseptabelt på dette trinnet, selv om noe av hjelperen bandet aspireres, slik det vil bli separert ved den påfølgende overnatter sentrifugering som følger.
8. Plasser de innsamlede band i en ny sterilisert Ultrasentrifuger rør. Fyll rørene til halsen ved overliggende 1,35 g / ml CsCl densitet løsning.
9. Sentrifuger ved 10 ° C ved 50.000 rpm over natten. Samle opaliserende band (Figur 3b).
10. Overfør bandet inn i en dialyse kassett (Slide-a-Lyzer, 10000 MWCO, Thermo-vitenskapelige).
11. Dialyser mot 3 L av autoklavert 10 mM Tis-HCl, pH 7,2 inneholdende 2 mM MgCl ₂ og 4% sukrose ved 4 ° C over natten.
12. Fjern den HDAd vektor fra dialyse kassett. Alikvot 20 ul for fysisk titer og 50 pl for DNA karakterisering. (Merk: For Ngn3 vektor, gjenta "P6" tre ganger for å oppnå tilstrekkelig vektor siden utbyttet av HDAd-Ngn3 er dårlig sammenlignet med HDAd-BTC eller HDAd-tom.)

2.5 Karakterisering av HDAd vektorer

1. Bestemme fysisk titer (VP / ml) ved hjelp av optisk tetthet (OD). Tilsett 20 pl vektor eller 20 ul dialysebuffer til 380 pl TE-buffer inneholdende 0,1% SDS og inkuber ved 56 ° C i 20 min. Mål OD ved 260 nm. Den fysiske titer = OD260 x 1,1 x 10 ¹² x 20 (VP / ml).
2. Analyser HV forurensning av qPCR. Bruk 50 ul prøve for å trekke DNA ved hjelp DNeasy vev / blod DNA-ekstraksjon kit (Qiagen). Fortynne DNA 1000 ganger og ta 5 pl for qPCR analyse med hjelper og vektor-spesifikke primere (tabell 1). Hjelperen forurensning bør være mindre enn 1%, som vist i Figur 4A.
3. Bruk Southern blot å analysere vektor struktur. Utføre Southern blot analyse ¹⁰ ved hjelp av en probe for inverterte terminal repeat (ITR). Den representative Resultatet er vist i figur 4B.
4. Bestem in vitro effekt. Infisere kjentantall 116 celler i en 12 brønns plate med HDAd vektor ved 1000 VP / celle i fire eksemplarer. Høste cellene etter 48 timers og ekstrakt RNA for å bestemme ekspresjon av Ngn3 og BTC mRNAs etter QRT-PCR (Tabell 1). Representative resultater er vist i Figur 5.

3. Behandling av diabetiske mus med HDAd-Ngn3 og-BTC

3.1 Induksjon av diabetes hos mus og injeksjon av HDAd vektorer

1. Fremstilling av STZ: Forbered 0,1 M citratbuffer, og justere pH til 4.3 til 4.5. Filtrere dette gjennom et 0,22 mm sprøyte filter. Bruke sterilt vann fortynnes til 0,01 M Na Citrate pH 4.2 til 4.5. Oppløs passende mengde STZ (Sigma) i denne løsning for å oppnå en endelig konsentrasjon av 12,5 mg / ml. Ved denne konsentrasjonen er det ingen utfelling. Holde denne STZ løsning ved 4 ° C til bruk. Bring temperaturen til injeksjonsbruk oppløsningen til romtemperatur umiddelbart før injeksjon. Den STZ løsning should være forberedt fersk hver dag og injiseres innen 5-10 min for å bli oppløst.
2. Injisere dette STZ løsningen intraperitonealt (10 ul / g for å oppnå en dose på 125 ug / g kroppsvekt), om kvelden mellom 5-7 pm (før lysene er deaktivert i musen anlegget og musene begynner å spise aktivt), på to påfølgende dager ^9.

3,2 Overvåking mus glukose og injeksjon av HDAd vektorer.

1. Rask mus for 6 timer og måle kroppsvekt og blodsukker ukentlig inntil mus har hyperglykemi (≥ 250mg/dl). Bruk en One Touch glukosemåler for blod samles inn av halen klipp. Når blod glukose er ≥ 250 mg / dl, kontroller blodsukker igjen i 48 timer etter en 6 timers rask å sikre vedvarende hyperglykemi og blodsukker er innenfor målområdet for behandling: 250-500 mg / dl.
2. Unn mus med vedvarende hyperglykemi av en enkelt intravenøs injeksjon av HDAd vektorer via halevenen. Den totale vektor dose er 6x10 ¹¹ VPfor alle behandlingsgruppene (i 0,25 ml): 5x10 ¹¹ vp Ngn3 en x10 ¹¹ vp BTC for kombinasjon gruppe, 5x10 ¹¹ vp Ngn3 + 1x10 ¹¹ VP for Ngn3 gruppe, og 1x10 ¹¹ vp BTC + 5x10 ¹¹ vp tom vektor for BTC-gruppen og 6x10 ¹¹ vp tom vektor for kontrollgruppen.
3. Halevenen injeksjon. Sett mus inn Tailveiner restrainer (TV-150, Braintree Scientific Inc.), og bruke varmt vann for å utvide halevenen, rengjør halen med 70% alkohol. Hold halen under injeksjonsstedet mellom tommel og pekefinger for hånd, bruk en annen hånd for injeksjon. Før injeksjon sørge for at det ikke er noen bobler i sprøyten (med 30 ^1/2 G nål og 1 ml sprøyte). Sett nålen og injiser vektoren sakte. Hvis nålen er i venen, kan en flash av blod ses i sentrum av nålen og dessuten er det ingen motstand under injeksjon. Etter å ha fjernet nålen, hold injeksjonsstedet med gasbind for å stoppe blødningen før retur mus to bur.
   Hvis nålen ikke er i venen er det en betydelig motstand mot injeksjon og litt underhudsfett Wheal oppstår. På denne tiden fjerne nålen og prøve igjen på et annet nettsted.

3.3 Analyse av effekter av HDAd-Ngn3 + HDAd-BTC behandling.

1. Monitor 6 hr fastende glukose og kroppsvekt ukentlig etter vektor behandling.
2. Samle blod fra saphenous blodåre eller halevenen i beinet hver 2 uker til analysen insulin (mus Insulin ELISA kit, Mercodia) og leverenzymer (ASAT og ALAT Infinity Reagenser, Thermo Scientific) ved hjelp av kommersielle kits.
   1. Plassere musen i en uncapped 50 ml Falcon rør med hull laget i den lukkede ende.
   2. Musen hode er ved den lukkede ende av røret, og bena og halen ved den åpne side av røret. Å samle blod fra venstre ben, forlenge venstre ben utsiden av røret og forsiktig klemme huden på låret mellom tommelen og pekefingeren immobilize beinet.
   3. Bruken barbermaskin å fjerne hår fra leggen / leggen området, for å utsette saphena venen, som er tilstede på den laterale side av leggen. Rengjør barbert hud med 70% alkohol og la det tørke.
   4. Punktering saphenous venen med en 25 gauge nål, Samle blodet med Microvette CB300 tube (Sarstedt) og sette rørene på isen.
   5. Trykk på stikkstedet med gasbind for å stoppe blødningen før retur musene til merdene.
   6. Sentrifuger rørene ved 3000 xg i 5 min, ta supernatanten og oppbevar ved -20 ° C for videre analyse.

3,4 Utfør glukosetoleransetest (GTT) ved 6 uker etter behandling.

1. Oppløst D-glukose (Sigma) i destillert vann for å lage 15% glukose (15 g / 100 ml) og sterilt filter, glukose.
2. Rask mus for 6 hr. Bruk varmt pad for å varme mus og samle blodet (0 min tidspunkt). Deretter injisere 1,5 g / kg av D-glukose ip (10 ul / g av 15% glukose).
3. Collect blod ved 15, 30, 60, 120 min.
4. Mål glukose og insulin i alle disse prøvene.

3,5 Tissue analyse for å vurdere uttrykket av vektorene og vurdere induksjon av holmen neogenesis.

I alle disse trinnene kontrollene som kreves for å pålitelig tolke resultatene er: (1) Tom vektor behandlet diabetiske mus (2) ikke-diabetikere mus og (3) ikke-diabetisk bukspyttkjertel fungerer som en positiv kontroll for uttrykket av holmen bestemte hormoner og transkripsjonsfaktorer.

1. Innhøsting lever og bukspyttkjertel ved 3 og 6 uker etter behandling. Fordel i 2 deler, den første for snap frysing i flytende nitrogen og lagres ved -80 ° C for RNA-og protein utvinning, og den andre til å fikse med 10% formalin over natten for immunhistokjemisk analyse.
2. Pakk RNA av en standard protokoll og analysere uttrykk for holmen bestemte hormoner og transcriptional faktorer, sammen med Ngn3 og BTC til bekrefm vektor uttrykk, i leveren av Qrt-PCR med bestemte ^{9 primere, 10.}
3. Pakk insulin og C-peptid fra leveren ved syre-etanol ekstraksjonsmetoden og kvantifisere ved et kommersielt ELISA-sett (ultra følsom Insulin analysen, Mercodia, C-peptid ELISA kit, Wako).
4. Utfør farging for holme bestemte hormoner (insulin, glukagon, PP, SST) sammen med holmen spesifikke transkripsjonsfaktorer i parafin innebygde ^{9 seksjoner, 10.} Uttrykk for Ngn3 og BTC kan også fås ved farging.

4. Representant Resultater

Vi klonet Ngn3 og BTC cDNA i pΔ28 vektorer drevet av allestedsnærværende promoter eIF2a (BOS) og genererte HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC. Som vist i figur 2, redusert i forhold HV kontaminering signifikant (antyde mer vektor forsterkning og mindre helper forsterkning) ved passasje 3. Derfor brukte vi P3 for påfølgende vektor produksjon. Etter den førsteCsCl diskontinuerlig gradient og ultrasentrifugering, samlet vi den laveste vektor band og deretter samlet opaliserende bandet tilsvarer HDAd vektor i andre ultrasentrifugering (Figur 3). Det rensede HDAd vektor hadde mindre enn 1% av HV kontaminering (Figur 4A) av qPCR og hadde ingen hjelper kontaminering synlig på sørlige blotting (figur 4B), som indikerer tilstrekkelig kvalitet for vektor infusjon i mus. Videre analyser inkludert transgene uttrykk ved infeksjon av 116 celler. MRNA uttrykket nivåer av Ngn3 og BTC var høyere i vektor infiserte celler med over 10 000-ganger sammenlignet med de i ikke-infiserte celler (figur 5).

HDAd-Ngn3 og-BTC ble deretter gitt til STZ-induserte diabetiske mus via halevenen injeksjon med tom vektor injisert og HDAd-BTC injisert diabetiske mus som fungerer som negativ kontroll. Hyperglykemi ble reversert og glukose-stimulert insulinsekresjonble gjenopprettet i mus behandlet med både HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC men ikke hos mus behandlet med enkelt gen vektor eller kontroll tom vektor (figur 6). Den HDAd-Ngn3-BTC behandling indusert holme neogenesis og dette ble kvantifisert ved å analysere total insulin og C-peptid innhold (figur 6E) med ikke-diabetikere, diabetiske tomme vektor behandlede mus fungerer som kontroller. Nærvær av C-peptid og insulin i ekvimolare Nøkkeltall bekrefter at insulin blir oppdaget i leveren er faktisk blir syntetisert i leveren. RT-qPCR bekreftet at leveren av HDAd-Ngn3-BTC behandlede mus uttrykt alle holme-spesifikke hormoner og transkripsjonsfaktorer ^9. Immunhistokjemi viste insulin positive celler i leveren hos mus som ble behandlet med HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC, men ikke insulin positive celler ble observert i mus behandlet med kontroll vektor (figur 7). Vi har også bekreftet at det var ingen gjenværende holmer i bukspyttkjertelen av Ngn3-BTC treated mus sammenlignet med de mange holmer i ikke-diabetiske bukspyttkjertelen. Vektor (Ngn3 og BTC) sammen med holme bestemt avstamning transkripsjonsfaktor (PDX-1 og Nkx6.1) uttrykk ble også vurdert ved farging av leveren (figur 7).

Figur 1. Flytskjema av genterapi av diabetiske mus bruker helper-avhengige virus system. Først Ngn3 og BTC, i en kassett drevet av en allestedsnærværende BOS promoter, er klonet inn HDAd transport (pΔ28) vektorer. HDAd er produsert av flere trinn, blant transfeksjon, serielle passasjer av forsterkning, og en stor skala infeksjon etterfulgt av vektor rensing. Etter karakterisere kvaliteten, er HDAds injisert intravenøst ​​i STZ-induserte diabetiske mus via halevenen. Effekten av behandlingen blir vurdert ved å måle glukose, kroppsvekt, GTT og ved analyse av genekspresjoni leveren.

Figur 2. Fastsettelse HDAd vektor forsterkning. DNA er hentet fra passasjen P0 til P4 hjelp DNA-ekstraksjon kits (Qiagen). DNA er fortynnet 1000 ganger og 5 ul DNA brukes for sanntid PCR (qPCR). Helper og vektor-spesifikke primere er brukt. Standardkurver genereres av seriefortynninger (10 ^-5 til 1 ng / ml) av HDAd shuttle vektor plasmid og HV plasmid (toppaneler). Bruke standardkurver og Ct-verdier for vektoren og hjelperen virus kopitall beregnes og forholdet HDAd / HV er plottet som en prosentandel av den totale virus (hjelper + HDAd). Derfor er relativ vektor forsterkning beregnet som: [vektor kopitall / (vektor + helper virus kopitall)]. I eksemplet (bunnpanelet) HDAd vektor forsterkning plateaued på P4, mens den relative HDAd / HV er økende på P3. Derfor P3 er valgt for det etterfølgende trinn.

Figur 3. Representative HDAd vektor band etter usammenhengende CsCl tetthet ultrasentrifugering. HDAd vektor er renset fra en 3L spinner kultur over sekvensiell CsCl tetthetsgradient. (A) Etter første tetthetsgradient ultrasentrifugering, er en enkelt opaliserende vektor bandet synlig (pil) under ugjennomsiktig celleavfall (CD). Den opaliserende band (pil) samles for den andre tetthetsgradient sentrifugering. (B) Etter den andre tetthetsgradient ultrasentrifugering blir opaliserende bandet (pil) samles inn for dialyse.

Figur 4. Analyse av helper virus forurensning. DNA ekstraheres fra 50 ul renset virus og helper forurensning er enssessed som i figur 2. Figuren viser helper forurensning av HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC er mindre enn 1%.

Figur 5. Analyse av strukturen HDAd vektor. Blot utført som beskrevet tidligere (Oka K, et al.). Felt 1: DNA fra helper virus, felt 2: DNA fra P3; Lane 3: DNA fra P4; Lane 4: renset vectopr. Åpne piler indikerer hjelper virus avledet band og de fylte piler indikerer ITR band som stammer fra HDAd vektor.

Figur 6. Expression nivå Ngn3 eller BTC i 116 celler infisert med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC vektor. 116 celler i et 12 brønners plater er smittet med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC eller tom vektor ved 1000 vp / celle i 2 dager. CeLLS er høstet og total RNA er hentet ved hjelp av Trizol reagens. QRT-PCR utføres med Ngn3-eller BTC-spesifikke primere. Den relative Ngn3 eller BTC mRNA uttrykk økte med over 10.000 ganger i celler infisert med HDAd-Ngn3 eller HDAd-BTC. Figuren er gjengitt fra Dev.Cell 2009 Mar; 16 (3): 358-73; Yechoor et. al., med tillatelse fra Elsevier.

Figur 7. Gene overføring av HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC inn STZ-induserte diabetiske mus fører til reversering av diabetes og induksjon av holme neogenesis i leveren. (A) Plasma glukose og (B) kroppsvekt av STZ-induserte diabetiske mus behandlet med HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC. (C) Plasma glukose og insulin under en IP-GTT ved 6 uker etter behandling. (D) Representative insulin farging i leveren 12 uker etter behandling. * P <0,05 (vs tom vektor gruppe). Figuren er gjengitt fra Dev. Cell 2009 Mar; 16 (3): 358-73; Yechoor et al, med tillatelse fra Elsevier..

navn	forward primer	reversere primer
helper	GACCATCAATCTTGACGACC	ATGTCGCTTTCCAGAACCC
vektor	TTGGGCGTAACCGAGTAAG	ACTTCCTACCCATAAGCTCC
Ngn3	AAGAGCGAGTTGGCACTCAG	TCTGAGTCAGTGCCCAGATG
BTC	GCACAGGTACCACCCCTAGA	TGAACACCACCATGACCACT

Tabell 1. Primer sekvenser.

Discussion

HDAds har blitt utviklet for å overvinne svakhetene ved tidlig generasjon annonser og å utnytte for genterapi søknad. Men tekniske utfordringer gjenstår. For eksempel krever HDAd HV for HDAd emballasje og vektor forsterkning er ikke så effektiv som tidlig generasjon annonser. HV er en første generasjons Ad og eventuell forurensning av HV kompromiss effektiviteten av HDAd. Derfor, svært effektiv transfeksjon og optimale betingelser for hver seriell passasje er kritiske. En annen kritisk parameter for vektor produksjon er hvilken passasje (P1-P4) skal brukes til etterfølgende passasje 5 som er direkte brukt som inokulum for suspensjon celler. Vår erfaring er de beste resultatene oppnås ved å bruke passasjen der HDAd vektor andelen øker dramatisk i følgende passasje (P3 i figur 2). Utbyttet av HDAd vektorer avhenger transgene kassetter. Under vektor produksjon, er begge transgener uttrykkes fordi både gener er underallestedsnærværende promoter. Ngn3 er en transkripsjonsfaktor og BTC er en vekstfaktor som tyder på at HDAd vektor uttrykker transkripsjonsfaktor som kan påvirke celle avstamning hemmer vektor forsterkning mens det uttrykker veksthormon hjelper i vektor replikering og emballasje.

Med diabetes forutsatt epidemiske proporsjoner, nye tilnærminger for å gjenopprette b-cellemasse nødvendig. I denne rapporten beskriver vi metoder for å utnytte fordelene ved HDAd vektorer å foreta genoverføring av holme avstamning-definerende transkripsjonsfaktor, Ngn3 sammen med holmen vekstfaktor, til betacellulin indusere holme neogenesis i periportal regioner av leveren. Å vurdere effekten av dette, er det viktig å velge mus med stabil hyperglykemi og sørge for at nødvendige kontroller er alltid inkludert. For dette genoverføring eksperimenter, behandlet den tomme vektoren diabetiske mus bør alltid benyttes. I tillegg bruker HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC individuelt behandlet diabetiker mice tjener til å teste den enkeltes bidrag i disse to genene i holme neogenesis. Som våre data demonstrerer at Ngn3 alene er tilstrekkelig til å indusere holme neogenesis, men tillegg av vekstfaktor, BTC, tjener til å forsterke responsen fører til robuste induksjon av holme neogenesis. Det er også viktig å teste at vektoren uttrykket faktisk oppnådd i målvevet, leveren og også å vise at insulin analysert i plasma av behandlede mus ikke kommer fra gjenværende holmer i bukspyttkjertelen, ved å demonstrere fravær av bukspyttkjertelen holmer i diabetiske mus.

Oppsummert ligger fordelen av HDAd-vektor system for genoverføring i sitt høye kloning kapasitet, effektiv transduksjon og langvarig genekspresjon i leveren med minimum kronisk toksisitet samt sin natur ikke-integrasjon av vektor genom i verten kromosom. Den primære begrensningene er de kompliserte trinn involvert i sin generasjon og densin vivo søknaden primært begrenset til leveren med de mest populære Ad serotype 5. Holme neogenesis kan bli overtalt til fullt gjenopprette plasma insulin og glukose toleranse i diabetiske mus ved å fremkalle holme neogenesis i leveren ved genoverføring av holme avstamning-definerende transkripsjonsfaktor, Ngn3 sammen med holmen vekstfaktor, betacellulin. I denne rapporten viser vi den optimale protokollen til å generere høy kvalitet HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC, og demonstrere teknikker for å indusere og vurdere holme neogenesis i leveren hos diabetikere mus å reversere hyperglykemi.

Fotnote: De virale vektorer og cellelinjer som er beskrevet her, er tilgjengelige fra Vector Produksjon Kjerne Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731 ). Noen kommersielle kits er også tilgjengelig for å generere HDAd virus (f.eks Microbix biosystems Inc.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ProFectionR Mammalian Transfection kit	Promega	E1200
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Qiagen	69504
PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROX	Quanta Biosciences	95055-500
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750-25G
MEM powder	Invitrogen	61100087
Penicillin Streptomycin	Sigma	15140122
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
L-glutamine	Invitrogen	25030-081
Hygromycin B	Sigma	H0654-1G
MEM EAGLE JOKLIK	Sigma	M0518-10L
Rnase	Roche	10109169001
DNase I, grade II	Roche	10104159001
Streptozocin	Sigma	s0130
Glass spinner flasks	Corning	4500-3L
Glass spinner flasks	Corning	4500-250
Slide A-lyzer casset	PIERCE CH	PI66380
Tube optiseal poly allomer, 11.2 ml	Beckman Coulter	362181
Cesium chloride 1 kg	JT4042-2	VWR
Beckman LE-80K	Beckman Coulter	Optimal LE-80K ultracentrifuge
Filter	VWR	28143-338
centrifuge tube 500 ml	Corning	431123
tailveiner restrainer	Braintree scientific , INC	tv-150
Insulin, Mouse ELISA	Mercodia	10-1247-01
microvette CB300	Sarstedt	16.443.100
D-glucose	Sigma	G8270
Mouse C-peptide ELISA Kit	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	#631-07231
guinea pig anti-insulin antibody	Abcam	ab7842
goat anti-Pdx1 antibody	gift from Dr. Christopher Wright
mouse anti Ngn3 antibody	Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania	AB2013
mouse anti Nkx6.1 antibody	Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania	F64A6B4
anti- betacellulin antibody	Cell Sciences	PAAQ1
ALT (SGPT) Color Reagent SET.	Teco Diagnostics	A526 - 120
AST/(SGOT), Color Endpoint Reagent Set	Teco Diagnostics	A561-120
Table 2. Specific Reagents and Equipment.