Summary
En flerstrenget tilgang til at undersøge funktionelle ændringer i hippocampus kredsløb er forklaret. Elektrofysiologiske teknikker er beskrevet sammen med skaden protokol, adfærdsmæssige test og regional dissektionsmetoden. Kombinationen af disse teknikker kan anvendes på lignende måde for andre områder af hjernen og videnskabelige emner.
Abstract
Traumatisk hjerneskade (TBI) hjemsøger mere end 1,7 millioner mennesker i USA hvert år, og selv mild TBI kan føre til vedvarende neurologiske nedskrivninger 1. To udbredte og invaliderende symptomer opleves af TBI overlevende, hukommelse underskud og en reduktion i krampetærsklen, menes at være medieret af TBI-induceret hippocampus dysfunktion 2,3. For at demonstrere, hvordan ændret hippocampus kredsløbsfunktion skader adfærd efter TBI hos mus, vi beskæftiger lateral væske slagtøj skade, et almindeligt anvendt dyremodel for TBI, der genskaber mange funktioner af human TBI herunder neuronal celletab, gliosis, og ioniske forstyrrelse 4 - 6.
Her har vi demonstrere en kombinatorisk metode til at undersøge TBI-induceret hippocampus dysfunktion. Vores tilgang indbefatter adskillige ex vivo fysiologiske teknikker sammen med dyrs adfærd og biokemiske analyser, med henblik på at analyserepost-TBI ændringer i hippocampus. Vi begynder med den eksperimentelle skade paradigme sammen med adfærdsmæssige analyse for at vurdere kognitive handicap efter TBI. Næste, vi har tre forskellige ex vivo optagelse teknikker: ekstracellulære område potentiel optagelse, visualiseret hel-celle patch-fastspænding og spænding følsomt farvestof optagelse. Endelig viser vi en fremgangsmåde til regionalt dissekering subregioner af hippocampus, der kan være nyttig til detaljeret analyse af neurokemiske og metaboliske ændringer efter TBI.
Disse fremgangsmåder er blevet anvendt til at undersøge ændringer i hippocampus kredsløb efter TBI og til at probe de modstående ændringer i netværket kredsløbsfunktion, der forekommer i den tandede gyrus og CA1 subregioner af hippocampus (se figur 1). Evnen til at analysere de post-TBI ændringer i hver subregion er nødvendigt for at forstå de underliggende mekanismer, der bidrager til TBI-induceret adfærdsmæssige og kognitive deficits.
Den multi-facetteret system, skitseret her giver efterforskerne at skubbe forbi karakterisering af fænomenologi induceret af en sygdomstilstand (i dette tilfælde TBI) og bestemme de mekanismer, der er ansvarlige for den observerede patologi forbundet med TBI.
Protocol
1. Lateral Fluid Percussion Skade
- Bedøve musen under anvendelse af en blanding af ketamin og xylazin givet intraperitonealt. Derefter forberede musens hoved til incision ved hjælp af en jod krat.
- Udføre en kraniektomi over den højre parietale område ved anvendelse af 3 mm (udvendig diameter) trepan.
- Sikker Luer-loc nålenavet (indvendig diameter 3 mm) over kraniektomi hjælp cyanoarylate og dental acrylic.
- 24 timer senere, bedøve musen med isofluran via inhalation.
- Når først den normale vejrtrækning genoptages, men før musen bliver følsom over for stimulering, afgiver 20 msek puls af saltvand i kraniet via fluid percussion skade enhed.
- Umiddelbart efter skade fjerne hubben, reanaesthetize musen med isofluran, og sutur hovedbunden lukket.
Sham-opererede kontroller vil modtage en identisk procedure med trin 1,5 udeladt.
2. Behavioral Analysis - Konditioneret Fear RespOnse
- Håndter mus på to på hinanden følgende dage før konditioneret frygt reaktion (CFR) uddannelse.
- Placer mus i konditioneringskammeret i 3 minutter, før der gives 1,5 mA gulv chok for 2 sek. Ingen mus i kammeret i yderligere 30 sek.
- Efter forsinkelsesperiode (sædvanligvis 24 timer), tilbage musen til konditioneringskammeret i 5 minutter. Vurdere frysning ved 5 sek intervaller.
Analyse består i at sammenligne den relative mængde af tid frysning i to populationer, i vores tilfælde hjerneskadet mus og sham-opererede kontroller. Lavere indefrysning satser (sammenlignet med kontrol) angiver manglende evne til at bevare tilknytningen mellem baggrund og gulv chok, en indikation af hukommelsessvækkelse og kognitiv dysfunktion.
3. Fremstilling Akutte hippocampusskiver
* Bemærk: bedøvelse ved hjælp af en Bell Jar kun kan gennemføres for terminalprocedurer (såsom hjernen dissektion beskrevet heri).
- 7 dage efterskade, til 1 L af kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) og 250 ml saccharose skæring opløsning.
- Brug is liberalt at sikre, at alle instrumenter og løsninger, der anvendes under hjernen skive forberedelse er iskold.
- Bedøve mus ved hjælp af isofluran. Hurtigt og forsigtigt fjerne hjerne fra mus og plads i saccharose.
- Trim hjerne og sted på skærefladen på en dråbe superlim foran en agar blok.
- Skær 350 um tyk koronal skiver, bør du være i stand til at få 4 eller 5 skiver med det intakte hippocampus kredsløb.
- Inkuber skiver i mindst 1 time ved 37 ° C.
4. Ekstracellulær Feltspænding Optagelse
- Træk borosilikatglas elektroder til 2-5 MΩs hjælp lodret aftrækker.
- Placer skive i kammeret, og indsæt elektrode på elektrode holder.
- Lavere stimulerende elektrode i skive i en axonal tarmkanalen såsom perforant sti eller Schaffer soeskende. Nedre elektrodei position mens overvågning output spor for at sikre, at elektroder er på det samme z-niveau (dybde). Når en maksimal reaktion opnås, holder stimulation nuværende niveau konstant, elektroder er på det samme z-niveau.
- Den resulterende spor består af tre komponenter: den præsynaptiske fiber volley, inden ekstracellulære postsynaptisk potentiale (fEPSP), og den postsynaptiske population spike. Bestanddelene kan overlappe hinanden tidsmæssigt i nogle præparater, hvilket gør analysen mere vanskelig. Hvis der er tvivl mellem, om responser er præsynaptisk eller postsynaptisk, kan APV og CNQX sættes til badet for at blokere excitatorisk transmission, og alle resterende signaler vil være af præsynaptisk oprindelse.
- Stimulation protokoller varierer at producere tre forskellige eksperiment typer: input / output kurver, parrede puls optagelser og langsigtede plasticitet eksperimenter.
Analyse består typisk af målinger sammenligner hældning fEPSP tværs i begge hjerneskadet mus og shamBetjent kontroller, kontrol for input styrken ved at måle fiber volley.
5. Visualiseret Patch-clamp recording
- Fremstille skiver, elektroder og rig at registrere som tidligere beskrevet ovenfor op til trin 4.2.
- Kun overveje celler dybere end 80 um i vævet som celler tættere overfladen vil være død og / eller har reduceret tilslutningsmuligheder. Nærme sig en celle med positivt tryk på elektroden for at sikre, at den ikke bliver tilstoppet, da det bevæger sig ned gennem vævet. Når elektroden rører let cellen anvender negativt tryk for at skabe en "gigaseal« mellem elektroden og plasmamembranen.
- Anvende korte byger af negativt tryk med henblik på at bryde Plama membran under elektroden og opnå helcelle-konfiguration.
- Eliminer kapacitans transienter med forstærker og kompensere for seriemodstand. Kompensere for seriemodstanden af cellen er afgørende for at sikre enccurate målinger.
- To former for encellede optagelser kan udføres: strømtang (måling membran spænding) og spænding klemme (måling af strøm, der går gennem ion-kanaler i membranen).
Mulige typer analyser er talrige, men i vores tilfælde overvejende består af biofysisk analyse kvantificering af hastigheden og størrelsen af spontane synaptiske strømme i begge hjerneskadet mus og sham-opererede kontroller.
6. Spænding Sensitive Dye Imaging (VSD)
- Forbered skiver og rig at registrere som tidligere beskrevet ovenfor op til trin 4,2.
- Forbered farvestof lager ved blanding af 1 mg di-3-ANEPPDHQ i 50 pi ethanol, dispensere 2 pi alikvoter i folie indpakkede rør, opbevares ved -20 ° C. Gøre arbejdet farvestofopløsning dagligt, ved fortynding 1:200 i aCSF.
- Inkuber skive på aCSF fugtet filtrerpapir og pletter med 90 ul af farvestof i 16 min; skyl med aCSF og sted i grænsefladen optagelse kammer.
- Juster lys stimulation intensitet indtil reaktion er centreret i midten af kameraets rækkevidde. Billeder er typisk erhverves med en hastighed på 500-1000 frames per sekund.
- Trigger lukker for lys stimulation 200 ms før elektrisk stimulation at muliggøre den første hurtig fotoblegning at stabilisere sig. Alternative erhvervelse forsøg mellem elektrisk stimuleret og ikke-stimuleret elektrisk, så det senere subtraktion af ikke-stimulerede baggrund. Optag hvilende lysintensitet (fluorescensaflæsning med lukkeren lukket) før åbning lukker. Hver VSD forsøg vil være en x pixels med y pixels med tiden "film" af fluorescens målinger. Record 10-12 VSD forsøg i hver testbetingelse.
- Alle målinger udføres på intra-pixel pre-elektriske-stimulus normaliseret fluorescens forandring, dF / F, der beregnes som følger:
Fratræk den hvilende lysintensiteten fra VSD rå erhvervede retssag. For hver pixel i hvert forsøg normaliseres ifølge den før-elektrisk-stimulus middelværdi for atretssag, og fratrække enhed. Gør dette for begge de elektrisk stimulerede og ikke-elektrisk stimuleret forsøg. Opret en gennemsnitlig "baggrundsfluorescens" trial fra de ikke-elektrisk stimuleret forsøg, og trække denne baggrund forsøg fra de elektrisk stimulerede forsøg. Yderligere analyse udføres typisk på gennemsnittet af 10 til 12 sådanne forsøg, som også sædvanligvis filtreres i rum og tid for at forbedre signal-støjforholdet.
7. Regionale dissektioner for Biokemiske analyser
- Fjern hjerne fra mus som tidligere beskrevet.
- Forbered udsnit med vævshakker.
- Lay sektion fladt, microdissect område CA1 og GD.
- Umiddelbart nedsænkes i lysepuffer indeholdende proteasehæmmer. Fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
8. Repræsentative resultater
Vores eksperimenter begynder typisk med adfærdsmæssige data til at bekræfte forventeed kognitive mangler, der findes i hjerneskadet mus. Vi beskæftiger kontekstuelle konditioneret frygt reaktion test, da det er et hippocampalt afhængig adfærd, der er pålidelig og kræver kun en træningssession og én testsession. Dataene afbildet i figur 2 repræsenterer adfærdsmæssige tests for at måle anterograd hukommelse, men kan prøven også anvendes til at måle retrograd hukommelse, hvis træningen udføres før skaden.
Field excitatoriske postsynaptiske potentialer (fEPSPs) måles for at bestemme netto-synaptisk virkning af en stor population af celler (figur 3A). Vi almindeligvis beskæftiger tre forskellige typer af stimulering mønstre, der hver giver sine egne resultater og konklusioner. Dels ved at øge stimulation intensitet gennem en række trin, skaber man en input / output kurve (figur 3B / C).
Dernæst ved at levere to stimulationer af samme intensitet separated med en kort forsinkelse (normalt 50 msek) vi undersøge potentielle ændringer i synaptisk vesikel release sandsynlighed;. Desuden har vi ofte udfører langsigtet potensering (LTP) eksperimenter. Efter etablering af en baseline svar, kort højfrekvent stimulation (normalt 100Hz) på samme intensitet er leveret, hvilket forårsager en intracellulær kaskade, der fører til en forstærket synaptisk respons, når normal stimulation genoptages.
Elektrisk aktivitet fra helcelle-patch-fastspændt celler kan optages i to tilstande. I spænding clamp mode, styrer eksperimentatoren membranen spændingen af patch-fastspændte celle i forhold til badet, via computersoftware forbundet med forstærkeren. I dette tilfælde strømme medierer postsynaptiske hændelser registreres, med oplysninger om præsynaptiske frigivelse frekvens, antallet af postsynaptiske aktiverede receptorer og vesikulær neurotransmitter koncentration (figur 4A). I strømtang tilstand eksperimentatorenmanipulerer injiceret strøm og måler spændingen respons. Dette kan være nyttigt til at bestemme karakteristika for aktionspotentialet, såsom virkningspotentiale tærskel og i halv bredde. Disse karakteristika giver mulighed for den funktionelle klassificering af neuroner som excitatorisk eller inhibitorisk baseret på deres aktionspotentialet neuroner (figur 4B). For at kontrollere den cellulære identitet anbefaler vi fylde celler med Lucifer Yellow efter optagelsen og visuelt bekræfte identiteten af tilstedeværelsen eller fraværet af dendritiske Torner. (Figur 4C, D).
Et eksempel på resultaterne fra et forsøg med spænding følsomt farvestof at måle ændringer i membranens spænding er afbildet i figur 5. I dette tilfælde har en stimulerende elektrode er anbragt i Schaffer sikkerhed pathway og den resulterende neuronaktivitet i området CA1 analyseres. Spænding følsomt farvestof rapporterer ikke absolutte værdier af membran spænding, men snarere than ændre i spænding fra en hidtidige tilstand uden stimulation. Dog kan analyser sammenligner to betingelser (f.eks hjerneskadede vs skinopererede) anvendes til at bestemme de Spatiotemporal parametre af fysiologiske ændringer, der ikke kan måles med fEPSPs eller helcelle-patch-clamp optagelser.
Figur 1. Hippocampale kredsløbsdiagram. Et vandret snit gennem hippocampus. De store linjer gennem hele hippocampus er vist med gult. Axonerne fra neuroner i den entorinale bark projekt via perforant pathway i den tandede gyrus danner synapser med dendritter af gyrus dentatus granulerede celler. Granule celle axoner projekt via mosbegroet fiber vej til CA3 hvor de danner synapser med dendritter af CA3 neuroner. Axoner af CA3 neuroner projekt via Schaffer sikkerhed pathway fast på dendrites af CA1 pyramidale celler. Axoner af CA1 pyramidale celler rage ud af hippocampus gennem subiculum. Bemærk: Også afbildet er CA3 pyramideformede celler axon sikkerhedsstillelse rager til den kontralaterale hippocampus via fimbria. (CA1: Cornu Ammonis 1, CA2: Cornu Ammonis 2, CA3: Cornu Ammonis 3, GD: dentate gyrus, stiplet linje angiver cellen kroppen lag, solide linje angiver strukturelle grænser.)
Figur 2. Repræsentative Adfærdsmæssige Data A:. Behavioral data skildrer forskellen i indefrysning satserne mellem hjerneskadet mus (FPI) og sham-opererede kontroller (sham) i konditioneret frygt reaktion paradigme. Træning fandt sted på 6. dagen efter skaden, med testperioden forekommende 24 timer senere. (** Betegner p <0,01.)
Figur 3. Repræsentative Ekstracellulære Optagelse Data A:. Et eksempel på et felt excitatorisk postsynaptisk potentiale (fEPSP) optagelse i område CA1. Den første nedadgående udbøjning er stimulus artefakt, efterfulgt af den præsynaptiske fiber flugter og endelig fEPSP. B: Input / output-kurver viser et fald i netto synaptisk effektivitet i CA1 efter væske slagtøj skade (FPI). C: Input / output kurver skildrer en stigning i netto synaptisk effektivitet i tandede hjernevinding (DG) efter FPI. (* Betegner p <.05.) Klik her for at se større figur .
Figur 4. Repræsentative helcelle-patch-clamp Data A:. Et eksempel spontanexcitatorisk postsynaptisk strøm (sEPSC) fra en CA1 pyramidal cell. B: Eksempler på aktionspotentialet tog fra en CA1 pyramidal celle (øverste spor) og en hurtig spiking CA1 interneuron (nederste spor). C: Eksempel på en Lucifer Yellow fyldt CA1 hæmmende interneuron. Bemærk den manglende dendritiske spidser (øvre panel). D: Eksempel på Lucifer Yellow fyldte CA1 pyramidal neuron. Bemærk tilstedeværelsen af dendritiske Torner (øvre panel). Klik her for at se større figur .
Figur 5. Repræsentative Voltage Følsomme Dye Imaging Data A:. Mouse coronal hippocampalt snit vises for at vise anatomi. (DG: dentate gyrus, CA1: Cornu Ammonis 1) B: gul til rød pixels repræsenterer excitatoriske aktivitet i området CA1 14 msek efter afferent Schaffer sikkerhedsstillelse stimulation. Rød inddicates mere depolarisering mens gul indikerer en lavere, men stadig signifikant depolarisering. C: Blå pixels der repræsenterer steder med inhibitorisk aktivitet i område CA1 56 msek efter samme afferent Schaffer sikkerhedsstillelse stimulation vist i B. Mørkere blå indikerer mere hyperpolarisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hver teknik skitseret ovenfor bidrager til større forståelse af den underliggende mekanisme årsag til den konstaterede adfærdsmæssige underskud. Ved at kombinere det unikke oplysninger indhentet ved hver metode, vi er i stand til at undersøge de biologiske mekanismer med mere præcision.
Måling fEPSPs er nyttigt til kvantificering af netto-synaptisk virkning af store, rumligt definerede regioner af neuroner. Det kan også give oplysninger om potentialet i en gruppe af celler til at gennemgå synaptisk plasticitet, en neurale korrelat for indlæring og hukommelse. Det er et nyttigt første punkt i elektrofysiologisk analyse, som det er teknisk ligetil og giver oplysninger om bredere foranstaltninger af kredsløbsfunktion.
I modsætning til fEPSPs, giver helcelle-patch-clamp-optagelse detaljerede oplysninger om de elektrofysiologiske parametre for en enkelt celle. Det er en meget forskelligartet teknik som mange forskellige parametre og types af synaptiske input kan måles afhængigt af optageforholdene (farmakologiske midler i pipetten eller bad, holde spænding, optagetilstand, osv.). Fx kan hel-celle patch-clamp-optagelse anvendes til at differentiere de relative bidrag af excitatorisk og inhibitorisk synaptisk transmission til en observeret forskel i netto-synaptisk virkning som beskrevet af fEPSPs.
Spænding følsomme farvestof imaging eksperimenter forøge viden, som de mere traditionelle elektrofysiologiske teknikker beskrevet ovenfor ved at give oplysninger om de Spatiotemporal dynamik kredsløb ændringer. Den Spatiotemporal profil af enhver ændring kan anvendes til at generere hypoteser om de potentielle celletyper der kan være involveret i at generere kredsløb dysfunktion, som derefter kan analyseres ved hjælp af mere målrettede strategier, som helcelle-patch-fastspænding.
I vores tilfælde har vi og andre tidligere demonstreret subregiom specifikke ændringer i netto synaptisk effekt 7-9, hvilket førte til at karakterisere den manglende evne til at generere LTP i CA1 efter TBI 10. Yderligere undersøgelser ansat en blanding af molekylærbiologiske teknikker og elektrofysiologi at undersøge mekanismen bag den observerede ubalance af excitatorisk / hæmmende synaptisk transmission 11. Vigtigt, disse undersøgelser anvendte adfærd ikke blot at påvise en kognitiv svækkelse efter TBI, men også at validere effektiviteten af et diætetisk behandlingsstrategi afledt af resultaterne fra anvendelse af vores kombinatorisk tilgang.
Intet om dette mangefacetterede system begrænser dets anvendelse til området for TBI eller sin region af interesse for hippocampus. Faktisk kombinationen af dette sæt af værktøjer vil sandsynligvis føre til biomechanistic beskrivelser af observerede forskelle i adfærd i en række neurologiske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Elliot Bourgeois for hans teknisk bistand. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health tilskud R01HD059288 og R01NS069629.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | AXOPATCH 200B | Patch-clamp rig |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | Patch-clamp rig | |
| MP-225 micromanipulator | Sutter | MP-225 | Patch-clamp rig |
| DMLFSA microscope | Leica | Patch-clamp rig | |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Multipurpose (field) rig |
| Digidata 1440 digitizer | Molecular Devices | Multipurpos (field) rig | |
| MPC-200 micromanipulator | Sutter | MPC-200 | Multipurpose (field) rig |
| BX51WI microscope | Olympus | BX51WI | Multipurpose (field) rig |
| Axoclamp 900A amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 900A | VSD rig |
| Digidata 1322 digitizer | Molecular Devices | VSD rig | |
| Redshirt CCD-SMQ camera | Redshirt | NCS01 | VSD rig |
| VT 1200S Vibratome | Leica | 14048142066 | |
| P-30 Electrode puller | Sutter | P-30/P | |
| cOmplete protease inhibitor | Roche | 11697498001 |
References
- Faul, M., Xu, L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , (2010).
- McAllister, T. W.
- Pierce, J. E., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. Enduring cognitive, neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats. NSC. 87, 359-369 (1998).
- Dixon, C. E., et al. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).
- McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
- Carbonell, W. S., Grady, M. S. Regional and temporal characterization of neuronal, glial, and axonal response after traumatic brain injury in the mouse. Acta Neuropathol. 98, 396-406 (1999).
- Toth, Z., Hollrigel, G. S., Gorcs, T., Soltesz, I. Instantaneous perturbation of dentate interneuronal networks by a pressure wave-transient delivered to the neocortex. J. Neurosci. 17, 8106-8117 (1997).
- D'Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R., Janigro, D. Selective loss of hippocampal long-term potentiation, but not depression, following fluid percussion injury. Brain Res. 786, 64-79 (1998).
- Witgen, B. M. Regional hippocampal alteration associated with cognitive deficit following experimental brain injury: A systems, network and cellular evaluation. Neuroscience. 133, 1-15 (2005).
- Schwarzbach, E., Bonislawski, D. P., Xiong, G., Cohen, A. S. Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury. Hippocampus. 16, 541-550 (2006).
- Cole, J. T. Dietary branched chain amino acids ameliorate injury-induced cognitive impairment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 366-371 (2010).
