Kvantitativ Locomotion Studie av fritt Simning Mikroorganismer Använda laserdiffraktion

Summary

Mikroskopiska organismer som den frisimmande nematod

Abstract

Mark och vatten mikroskopiska organismer lever och beter sig i en komplex tredimensionell miljö. De flesta studier av mikroskopiska organismer beteende, i motsats, har genomfört med hjälp mikroskop-baserade metoder som begränsar rörelse och beteende till en smal, nästan tvådimensionellt fokus område. ¹ Vi presenterar en ny analytisk metod som ger realtid analys av fritt simning C. elegans i en kyvett utan beroende mikroskop-baserad utrustning. Denna strategi består av att spåra den tidsmässiga periodicitet diffraktionsmönster genereras genom att rikta laserljus genom kyvetten. Vi mäter oscillationsfrekvenser för fritt simning nematoder.

Analys av fjärrområdet diffraktion mönster avslöjar ledtrådar om vågformer av nematoderna. Diffraktion är processen ljus böjning runt ett objekt. I detta fall ljus diffrakteras av organismerna. De ljusvågor störa och kan bilda annonsiffraction mönster. En fjärrområdet eller Fraunhofer är diffraktionsmönster bildas om skärmen till objekt avstånd är mycket större än brytande objektet. I detta fall, kan diffraktionsmönstret beräknas (modellerade) med användning av en Fourier-transform. ²

C. elegans är fritt levande jordlevande nematoder som navigerar i tre dimensioner. De flyttar båda på en fast matris som jord eller agar i en sinusformad motoriskt mönster som kallas krypa och vätska i ett annat mönster som kallas simning. ³ Rollerna spelas av sensorisk information från mechanosensory, chemosensory och thermosensory celler som styr plastiska förändringar i motoriskt mönster och switchar i mönster endast börjat belysas. ⁴ Vi beskriver en optisk metod för att mäta nematod förflyttning i tre dimensioner som inte kräver ett mikroskop och gör det möjligt för oss att börja utforska komplexiteten i nematod förflyttning under olika conditions.

Protocol

1. C. elegans Förberedelse för Video Analysis

1. Flytta 10-20 gravida vuxna nematoder till färska NGM agar-fyllda petriskålar med en tunn, platt plocka platinatråd. De Petriskålarna fyllda med NGM agar innehåller en liten rund fläck av E. coli (en tillväxt begränsad stam, OP50, ger de bästa resultaten) för nematoder att äta. Låt nematoderna att lägga ägg under 3-5 timmar och sedan ta bort de vuxna, vilket skulle innebära en liten, utvecklingsmässigt-synkroniserad kultur 50-150 nematoder. Låt nematoderna växa till tidig vuxen ålder genom inkubering av Petri-skålar vid 20 ° C under 4-5 dagar. Dessa odlingsmetoder baseras på etablerade förfaranden (Stiernagle 2006). ⁵
2. På dagen för videoanalys, spola en tallrik unga vuxna nematoder med 1 ml avjoniserat, destillerat vatten, vilket samlar 50-150 maskar från den synkroniserade kulturen. En buffertlösning som M9 eller PBS kan också användas. Använd en mikrocentrifug att snurra wOrms till botten av röret, eller låta dem sedimentera genom gravitation i ca 15 min. Avlägsna huvuddelen av vattnet från röret och ersätta det med 1 ml avjoniserat, destillerat vatten för att tvätta eventuella vidhäftande bakterier från nematoderna.
3. Överför nematoder i vatten eller buffert till en kvartskyvett med en mikropipett. Det är viktigt att arbeta med ett litet antal, ca 5-10 nematoder totalt på en gång eller ännu färre, så att en nematod i taget sannolikt att belysas med lasern. Om antalet nematoder på odlingsplattorna är alltför stor, späd maskar i vatten eller buffert tills en önskad densitet är uppnådd. Det är också möjligt att plocka enskilda nematoder till en droppe vatten eller buffert på en färsk agarplatta att tvätta dem och överföra enskilda maskar till kyvetten. I vår studie har vi använt 1 mm, 2 mm och 5 mm storlek kyvett att undersöka effekterna av fysiska begränsningar simning beteende.

2. Optisk inställning för Video analysis

1. Utför installationen enligt figur 1 med en 543 nm (grön) Helium-Neon (HeNe) laser, två front-yta aluminium speglar, en kyvetthållare, en filmduk, samt en höghastighetskamera (Casio High Speed ​​Exilim) kan att filma på ~ 240 fps. De två speglarna används för att styra laserstrålen genom kyvetten. Olika storlekar av kyvetter kan användas beroende på naturen av studien. Som ett exempel använde vi kyvetter som är 5 mm tjock för att visa effekterna av rumsliga begränsningar för simning frekvenser. Laserstrålen ska uppfylla kraven för översampling,. Dvs bör organismen hindra inte mer än en tredjedel av laserstrålen. För C. elegans, bör laserstrålen vara ca 2 mm i diameter när det interagerar med en nematod. Laserstrålen bör inte vara större än 5 mm i diameter, eftersom diffraktionsmönstret blir svår att lokalisera. Avståndet från den brytande organismen till skärmen bör vara mycket större änsjälva organismen.
2. Placera parafilm över toppen av kyvetten och invertera den att blanda nematoderna i vattenmassan. Placera kyvetten i en kyvett hållaren så att maskar är initialt nära toppen av kyvetten. Använda speglarna, styra laserstrålen genom centrum av kyvetten. Eftersom nematoderna är tätare än vatten, kommer de att falla långsamt till botten av kyvetten, medan på samma gång simning i vattenpelaren.
3. På filmduken, färg plats som motsvarar den utsända laserstrålen svart för att reducera spridningen som den utsända strålen möter filmduk (figur 2). Alternativt sätta en öppning i projektionsskärmen att tillåta den överförda strålen att passera genom skärmen. Eliminera eller minska spridning från den utsända strålen kommer att hålla CCD rad kameran från mättas på grund av den utsända strålen.
4. För att fånga ett mått på storleken av diffraktionsmönstret, dra en linjeca 5 cm på projektionsskärmen bredvid den utsända laserstrålen plats utan att störa det brutna ljuset bilden.
5. Starta inspelningen med kameran medan rummet lyser så att 5 cm linjen är på samma bilder som diffraktion bilder. Stäng av rabatt ljuset. Spela in diffraktion bilder på skärmen med kameran som maskar passerar genom laserstrålen.

3. Video Data Preparation

1. Installera programmet videoanalys (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) på datorn. Importera videon till videoanalys program
2. Ställ ursprunget att sammanfalla med den sända laserfläcken. Ställ in skalan med 5 cm linjen på filmduken.
3. Spåra vinkelförskjutning diffraktionsbild bildas av varje nematod med användning av programvaran videoanalys (figur 3)
4. För att hitta AngulaR förskjutning genom att ta arctan (y / x), kopiera och klistra in data i ett kalkylblad (Excel) och tillsätt 180 grader eller π för alla negativa vinklar för att producera en kontinuerlig kurva (Figure. 4).

4. Real Time Data Acquisition för Instant Observation av Simning frekvenser

1. Med samma inställning som för videoanalys, placera en fotodiod (DET10A från Thorlabs) med en liten yta (~ 1 mm ²⁾ från centrum i diffraktionsmönstret rätt framför filmduken.
2. Anslut fotodiod till digitalt oscilloskop (PicoScope från Pico Technology) som ansluts till datorn via USB-porten. Beakta tröska mönster på datorskärmen.
3. Spara förvärvade datamängder i ASCII-format eller textformat.

5. Dataanalys

1. Importera data som förvärvats med hjälp av video eller fotodioden i ett dataanalys program som kan montering vågformer med chi-minimering. Programmet som används här är Ursprung ( http://www.originlab.com/ ). Montera en sinuskurva för att bestämma stryk frekvens (fig 4 och 5).
2. Genomsnittlig simning frekvenser från olika prover och bestämma variansen. För denna studie användes data analyserades statistiskt med användning av en enda faktor ANOVA följt av Bonferronis multipla jämförelser testet. Ett p-värde av <0,05 ansågs statistiskt signifikant.

6. Modell diffraktionsmönster med Mathematica som ett exempel

Obs: diffraktionsmönster kan modelleras med hjälp av många olika beräkningsmodeller verktyg. Detta förfarande skiljer sig för olika beräkningsmodeller verktyg som MatLab, Excel, ursprung etc.

1. Skapa Bild: Ta bilder av nematoder på ett objektglas med hjälp av en traditionell mikroskop.
2. Binarize bild: Importera masken bilden "Worm" into Mathematica genom att dra bilden till Mathematica. Konvertera bilden till en svartvit bild (binarize). Detta kan uppnås med "Binarize"-kommandot i Mathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [Worm]. Bilden kan sedan betraktas som en svart och vit bild.
   Alternativt kan du använda den "EdgeDetect 'kommandot för att skapa en BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], där de två efterföljande siffrorna styr grovleken på de resulterande kanterna.
3. Konvertera bilden till en matris av nollor och ettor: Detta kan uppnås med "imageData"-kommandot i Mathematica: Matrix = imageData [BlackandWhiteImage].
4. Fouriertransform matris: Använd "Fourier"-kommandot i Mathematica till Fouriertransformen matrisen med de angivna FourierParameters: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
5. Square modul av matris för att erhålla diffraktion matris och förbättra bildens kontrast: Square den absolutavärde av matrisen och visa den resulterande bilden, vilket är diffraktionsmönstret som motsvarar den ursprungliga bilden. Dessutom kan du använda "Log" funktionen att skala bildens kontrast: ImageContrast = Bild [Logga [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
6. Ändra storlek på bilden för enkel visning: Beskär den centrala diffraktionsmönstret och ändra storlek som önskas: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
7. Jämför modellerade diffraktionsmönster med diffraktionsmönster erhållna från fritt simning maskar. (Fig. 6)

Representative Results

Som ett exempel, studerade vi C elegans i en kvartskyvett 1 cm breda, 5 mm tjocka och 4 cm lång kyvett. Provtagning en enda mask med videoanalys är den genomsnittliga simning frekvensen erhålls från videoanalys i en 5 mm tjock kyvett ca 2,5 Hz (Figur 4). Likaså provtagning en enda mask med realtid datainsamling metod får vi en simning frekvens av cirka 2,7 Hz (Figur 5), med hjälp av digitalt oscilloskop (PicoScope). Denna procedur kan upprepas för många maskar. En detaljerad studie av fritt simmande maskar visade en genomsnittlig simning frekvens av 2,37 Hz i en 5 mm kyvett. ⁶ Som väntat är simning frekvensen högre än för en krypande mask (~ 0,8 Hz). ³ Med den här diffraktion metoden, genomsnittliga simning frekvenser ett C. elegans, som är begränsad till ett objektglas, har visat sig matcha tidigare publicerade värdet på 2 Hz. ^1,7

ve_content "> Följande procedurer 3.) och sedan 6.) möjliggör modellering av simning diffraktionsmönster med hjälp av mask bilder som erhållits med en konventionell mikroskop. De modellerade diffraktionsmönster används för att simulera en simtur cykel av C. elegans ( Figur 6). En framgångsrik modell består av fysiskt genomförbara varandra simma mönster som matchar de simning frekvenserna. Masken ska vara i samma form i slutet av en simtur cykel som det var i början av en simtur cykel.

Figur 1. En grön HeNe-laser användes för att skapa en dynamisk diffraktionsmönster med levande C. elegans. Denna diffraktionsmönster filmades på 240 fps.

Figur 2. Dral vinge en svart prick ökar absorptionen av den utsända strålen. Mättnad av kameran på grund av spritt ljus reduceras och diffraktionsmönstret blir synlig.

Figur 3. Skärmdump av videoanalys programvara (Logger Pro) med en mask diffraktionsmönster som spåras. Klicka här för att se större bild .

Figur 4. Videodata motsvarande simma cykeln av en nematod i en 5 mm kyvett. Den kurvanpassning avslöjar en simning frekvens av ~ 2,5 Hz.

"/>
Figur 5. Realtidsdata motsvarande simma cykeln av en nematod i en 5 mm kyvett. Den kurvanpassning avslöjar en simning frekvens av ~ 2,7 Hz.

Figur 6. Den översta raden representerar de faktiska diffraktionsmönster och matchas till modellerade diffraktionsmönster i den nedre raden. De modellerade diffraktionsmönster framställdes med användning av maskar på ett objektglas (mittenraden).

Discussion

Vi har utvecklat en ny metod för att i realtid mäta rörelse och enkla motoriskt beteende i mikroskopiska organismer som nematoder som inte kräver användning av mikroskop. ⁸ Denna metodik också skulle kunna användas för att studera ett stort antal mikroskopiska organismer som protister. Denna metod begränsas endast av våglängden av ljus som används. Organismen bör inte vara mindre än våglängden hos ljuset. Förutom kostnads-besparingar och överföra den nödvändiga utrustningen är en viktig fördel med detta tillvägagångssätt möjligheten att mäta beteende i realtid och i tre dimensioner, utan de smala begränsningar bildplan under ett mikroskop. Det är också möjligt med denna teknik för att undersöka påverkan av gravitationella krafter eller många andra villkor för beteende som inte kan studeras med hjälp mikroskop-baserade metoder. ⁹ Vi kan alltså få en bättre förståelse för mikroorganism naturligt motoriskt beteviors frigörs från ramarna för dropparna objektglas eller specialiserade mikroflödessystem kammare (Park et al, 2008). ¹⁰

Bristen på fasinformation i ett diffraktionsmönster tillåter inte för direkt inhämtning av bilden motsvarar den brytande objektet eftersom fjärrområdet diffraktionsmönstret är proportionell mot kvadraten av det absoluta värdet av Fouriertransformen. Vi är därför beräkna diffraktionsmönster från masken bilder så att de kan matchas med diffraktion mönster fritt simning nematoder (Figur 6).

Denna metod har gett resultat för verkligt fritt simning C. elegans och kan tillämpas på alla mikroskopiska arter som manövrar i en optiskt transparent miljö som vatten eller många olika joniska lösningar. Konventionella mikroskop tillåter endast studier med en brännvidd djup i storleksordningen mikrometer. ¹¹ Detta beror på den begränsadeskärpedjup vid fokusering ljus:

där f-talet N har en ömsesidig relation med cirkel av förvirring (c) så att en kort brännvidd är associerad med en stor c.. ^12,13 Medan denna diffraktion metod är verkligen inte en ersättning för konventionell mikroskopi, är det möjligt att leverera kvantitativa resultat snabbt så att arter även kan manipuleras i realtid till en låg kostnad. Diffraktionsmönstren kan erhållas med någon laserpekare. Diffraktionsmönstren kan filmas med en reducerad tidsupplösning med en vanlig digitalkamera. Medan användaren kanske inte har ett mikroskop eller en fotodiod lättillgänglig, kan viktiga delar av detta experiment som mäter stryk frekvenser och utvärdera diffraktionsmönster vara klar i extremt låg kostnad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
543 nm HeNe Laser	Melles Griot	LGX1	Any laser in the visible range with less than 5 mW can be used.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera	Casio
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/