In vitro-syntes av Native, Fibrös Lång avstånd och segment Lång avstånd Kollagen

Summary

Enkla och reproducerbara förfaranden beskrivs för att göra tre strukturellt distinkta kollagen församlingar från en gemensam kommersiellt tillgänglig typ I kollagen-monomer. Native typ kan fibrösa långa avstånd eller segmentell lång avstånd kollagen konstrueras genom att variera de förhållanden som de 300 nm lång och 1,4 nm i diameter monomer byggsten är utsatt för.

Abstract

Kollagenfibriller är närvarande i den extracellulära matrisen av djurvävnad för att tillhandahålla strukturell byggnadsställningar och mekanisk hållfasthet. Dessa nativa kollagenfibriller har en karakteristisk banding periodicitet ~ 67 nm och är bildade in vivo genom den hierarkiska montering av typ I-kollagen monomerer, som är 300 nm i längd och 1,4 nm i diameter. In vitro, genom att variera de förhållanden som monomer byggstenar utsätts, kan unika strukturer varierar i längdskalor upp till 50 mikrometer byggas, bland annat inte bara naturliga typ fibriller, men också fibrös lång avstånd och segmentell långa avstånd kollagen. Häri presenterar vi rutiner för att bilda tre olika kollagen strukturer från en gemensam kommersiellt tillgänglig kollagen monomer. Via de protokoll som vi och andra har publicerat tidigare för att göra dessa tre typer normalt leda till blandningar av strukturer. I synnerhet var unbanded fibriller vanligt found när du gör nativt kollagen och infödda fibriller var ofta närvarande när du gör fibrösa lång avstånd kollagen. Dessa nya förfaranden har fördelen att producera den önskade kollagen fibrill typ nästan uteslutande. Bildningen av de önskade strukturerna verifieras genom avbildning med ett atomkraftsmikroskop.

Introduction

Kollagen är en klass av strukturella proteiner som har en trippel spiralformad struktur bildad av tre polypeptidkedjor. Dessa trippelhelix monomerer samlas ytterligare i en hierarkisk sätt för att bilda gradvis större strukturer. Det finns minst 28 genetiskt olika kollagen typer som har identifierats ^1. Tillsammans kollagener utgör 30% av det totala protein som finns i djur, med typ I den vanligaste formen står för upp till 90% av alla kollagenproteiner ^2. Typ I-kollagen återfinns som fibrillous strukturer i hud, ligament, senor och ben. Atomkraftsmikroskop (AFM) och elektronmikroskop (EM) bilder av typ I nativa kollagenfibrer typiskt visar bandning med en karakteristisk tid på ~ 67 nm (ofta kallad D-banding) ^3-5.

Typ I kollagen-monomer är en trippelhelix heterotrimer bestående av två identiska α1 (I)-kedjor och en α2 (I)-kedjan, var mer än entusen aminosyror långa. Det är lång och tunn med måtten 300 nm i längd och 1,4 nm i diameter. Typ I kollagen-monomer kan lätt erhållas genom att bryta ner naturligt bildade högre ordningens strukturer ^6. Vi ⁷ och många andra ^8-10 har visat att dessa lösliga monomer byggstenar kan sedan användas för att rekonstruera D-bandade fibriller in vitro (Figur 1).

Förutom nativa kollagenfibriller, har två andra högre ordningens kollagen strukturer befunnits bildas in vitro med användning av samma block monomeren byggnad. De två strukturerna är fibrösa långa avstånd (FLS) och segmentell lång avstånd (SLS) kollagen (figur 1). FLS kollagen är en fibrillous konstruktion som nativt kollagen, men kännetecknas av en större banding periodicitet än nativt kollagen ^11. In vitro bildar FLS kollagen när kollagen monomeren kombineras med α1-syraglykoprotein in vivo också, men sällan ^13. SLS kollagen beskrivs som kristalliter eftersom monomererna är inriktade i registret som i ett kristallgitter ^14. SLS kollagen bildas när kollagen monomeren kombineras med adenosintrifosfat (ATP) ^15. Naturligt förekommande SLS kollagen har observerats i odlingsmediet av fibroblaster men inte i extraherade vävnadsprover, sannolikt på grund av sin ringa storlek och brist på urskiljbara topografiska särdrag ^16.

Målet med detta manuskript är att presentera detaljerade förfaranden för att göra infödda kollagenfibriller samt FLS och SLS kollagen som även den mest oerfarne forskaren kan återge. Använda kommersiellt tillgängliga avancerade utgångsmaterial har vi försökt att göra protokollen så enkelt som möjligt och ändå få dem fungera tillförlitligt. Vi detalj också hur man använder en AFM att karakterisera de olika kollagen strukturs som görs. Detta arbete kommer att vara till nytta för forskare som vill studera en eller flera av dessa högre strukturer ordning kollagen och / eller använda dem som prekursorer i andra program, men för närvarande brist på kompetens eller helt enkelt inte vill arbeta med vävnadsprover.

Protocol

OBS: Det vatten som används i alla protokollen har en resistivitet> 18 MΩ.cm.

1. Native kollagenfibriller

1. Kombinera 6 il vatten, 20 pl 200 mM Na ₂ HPO ₄ justerades till pH 7 med HCl och 10 pl av 400 mM KCl i ett mikrofugrör och blanda.
2. Tillsätt 4 | il av kollagen-monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCl) till mikrofugrör och blanda. Lösningen ska vara klar och färglös.
3. Placera mikrofugrör med reaktionsblandningen i ett värmeblock som har förvärmts till 37 ° C och låt under 3 till 4 timmar. Vid denna punkt bör lösningen vara en del moln och innehåller huvudsakligen infödda kollagenfibriller.

2. Fibrer Långa avstånd Kollagen

1. Dialysera 1 ml kollagen-monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCl) med användning av 12-14 kDa MWCO-membran mot 400 ml vatten, byta vatten fyra gånger under en period av 24 h vid rumstemperatur. Den dialyserade collagsv monomer som inte används direkt kan lagras vid 4 ° C för framtida användning.
2. Kombinera 20 yl vatten, 20 pl 3 mg / ml α1-surt glykoprotein i vatten och 20 ul av dialyserat kollagen monomer i ett mikrofugrör. Lösningen ska vara klar och färglös.
3. Låt mikrofugrör med reaktionsblandningen vid rumstemperatur under 30 minuter. Vid denna punkt bör lösningen vara grumlig och innehåller övervägande FLS kollagenfibriller.

3. Segmental Lång avstånd Kollagen

1. Kombinera 67 yl vatten, 60 pl 100 mM glycin-HCl-buffert vid pH 3,3 och 40 pl av 10 mg / ml ATP i vatten i ett mikrofugrör och blanda.
2. Lägg 33 pl av kollagen-monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCl) till mikrofugrör och blanda. Lösningen ska vara klar och färglös.
3. Låt mikrofugrör med reaktionsblandningen vid rumstemperatur under 2 timmar. Vid denna punkt kommer lösningen att visas fortfarande klar, men börinnehåller mestadels SLS kollagen.

4. AFM Karakterisering

1. Klyver ytan av ett stycke av glimmer fäst till en AFM substrat genom att täcka ytan glimmer med en bit tejp och därefter skalar bort. Kontrollera bandet efteråt för att bekräfta att ett helt skikt av glimmer klövs för att minska oregelbundenheter på ytan och se till att den gamla prov avlägsnas om glimmer återanvänds.
2. Applicera 20 | il av kollagen fibrill lösningen till nyligen kluvna glimmer substrat. Låt stå 5 minuter.
3. Försiktigt skölja bort lösningen av kollagen fibriller med vatten. Det är inte tillrådligt att tillämpa vattnet direkt på mitten av glimmer substrat men vid kanten och att tillåta den att strömma över provet.
4. Torka ytan under en försiktig ström av kvävgas. Det är tillrådligt att rikta strålen vid kanten och inte i mitten av glimmer substratet.
5. Under ett optiskt mikroskop vid 200 gångers förstoring,de infödda och FLS kollagen prover bör visa klumpar fibriller. SLS kollagen kommer inte att vara synlig.
6. De unika egenskaperna hos de tre olika kollagen strukturer kan observeras av AFM. Generellt vi bild infödda kollagenfibriller med en AFM i intermittent kontakt läge med kisel AFM sonder, medan FLS och SLS koUagenfibriller vi vanligtvis bild med en AFM i kontakt läge med kiselnitrid AFM sonder. Vi gör detta på grund av tid och överväganden kostnad. Silicon AFM prober är vanligen skarpare än kiselnitrid AFM prober, som gör dem speciellt användbara för avbildning av den smalare banding strukturen av nativa kollagenfibriller. Emellertid, kisel AFM sonder är mycket mer benägna till kontaminering av kollagen prover än kiselnitrid AFM prober och behöver bytas ofta. Därför förbehåller vi oss att använda kisel AFM sonder mest för avbildning infödda kollagenfibriller där upplösningen är större nödvändighet och vi arbetar i intermittent kontakt läget prolong sin livstid användbarhet.

Vi rekommenderar en initial 100 × 100 nm ² scan som ska visa åtminstone några kollagenkonstruktioner. Därifrån, zooma in för att skanna storlekar på 10 × 10 pm ² och sedan 2 × 2 um ² att observera ränder periodicitet inhemska och FLS kollagen, eller funktionerna finare i en SLS kollagen. Det är också en god idé att kontrollera minst två andra regioner på kollagen provet för att verifiera att de ursprungliga skanningar är representativa.

Representative Results

Nativt kollagen

Reaktionsblandningen av ~ 0,3 mg / ml kollagen monomer i 100 mM fosfat och 100 mM KCl vid pH 7 stå vid 37 ° C under 3-4 timmar kommer att ge en lösning innehållande nativa fibriller typ kollagen med tydlig ~ 67 nm D-banding, utan unbanded fibriller.

Enligt ett optiskt mikroskop vid 200 gångers förstoring, kan klumpar av flera fibriller kan normalt ses på glimmer substratet särskilt när ses av differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi (Figur 2). I en typisk prov en slumpmässig 100 × 100 nm ² skanning av AFM vanligtvis visa åtminstone några fibriller som är 5-50 mikrometer lång (figur 3a-c). Individ, kan separerade kollagenfibriller lätt identifieras i det här skedet. Med en 512 × 512 pixel ² bild skanning, zoomar in i en 10 x 10 um ² skanningsstorlek visar att alla fibriller bandad (figur 3d-f 2 skanningsstorlek (figur 3g-i).

Banding periodicitet kan bestämmas genom att helt enkelt mäta och genomsnittet av de längsgående avståndet mellan flera toppar eller dalar. Alternativt, om AFM programvara kan, en endimensionell Fourier-transform utmed en längsgående tvärsnitt kan också användas. Figur 4 visar en AFM höjd bild av en fibrill och en motsvarande längsgående tvärsnitt.

FLS kollagen

Reaktionsblandningen på 1 mg / ml μ1-glykoprotein och ~ 1 mg / ml kollagen monomer i vatten lämnades vid rumstemperatur under 30 minuter kommer att ge en lösning av FLS kollagenfibriller.

Klumpar av fibriller, liknande vad som observeras i fallet med nativt kollagen, kan lätt ses på glimmer substratet under ett optiskt mikroskop vid 200 x magnification. I en typisk prov kommer en slumpmässig 100 × 100 nm ² skanning av AFM brukar visa åtminstone några fibriller. Med en 512 × 512 pixel ² bild skanningsstorlek kan banding periodiciteten mätas genom att zooma in i en 10 x 10 um ² scan (figur 5a) eller mer exakt med en 2 × 2 um ² skanning (figur 5b). Figur 5c visar en längsgående tvärsektion av en FLS fibrill.

SLS kollagen

Reaktionsblandningen av 2 mg / ml ATP och ~ 0,5 mg / ml kollagen monomer i 100 mM glycin-HCl-buffert vid pH 3,3 lämnades vid rumstemperatur under 2 timmar kommer att ge en lösning av SLS kollagen.

Typiskt kommer SLS kristalliter inte synlig under ett optiskt mikroskop. En AFM behövs för att bekräfta närvaron av SLS kristalliter. I en typisk prov kommer en slumpmässig 100 × 100 nm ² skanning av AFM brukar visa mångaprickar. Zooma in en 10 x 10 um ² scan vanligtvis visar flera SLS kristalliter (Figur 6a). Och en 2 × 2 um ² skanning (figur 6b) visar finare strukturen för en SLS kristallitstorlek.

Figur 1. De tre strukturellt olika former av kollagenfibriller som kan bildas in vitro från kollagen-monomer. AFM bilder skildrar kollagen monomer och de tre högre ordningens strukturer kollagen alla på samma storlek skala (2 x 2 pm ^2).

Figur 2. Digital bild vid ~ 200 gångers förstoring av optisk DIC mikroskopi av infödda kollagenfibriller på glimmer (a) orörd och (b) tröskel och vässad to markera fibrillerna.

Figur 3. AFM bilder av infödda kollagenfibriller på glimmer. Intermittent kontakt mode AFM amplitud bilder visas.

Figur 4. (A) 0,5 x 1 fim ² intermittent kontakt läge AFM höjd bild (vertikal skala = 100 nm) och (b) längsgående tvärsnitt av en nativt kollagen fibrill.

Figur 5. AFM bilder av FLS kollagenfibriller på glimmer. (A) 10 × 10 um ² kontakt läget AFM böjning bild, (b) 2 × 2 um ² kontakt läget AFM böjning bild och (c) longitudinelltvärsnitt av en FLS kollagen fibrill.

Figur 6. AFM bilder av SLS kollagen på glimmer. Intermittent kontakt mode AFM amplitud bilder visas.

Discussion

Renat kollagen monomeren är stabilt vid lågt pH och temperatur och bildandet av nativa kollagenfibriller huvudsakligen innebär höjning av pH och temperatur av kollagen monomerlösningen. Förfaranden för beredning av bandad kollagenfibriller från monomerer har funnits i mer än 50 år. Det förfarande som vårt laboratorium som används i våra första studier med kollagen 15 år sedan ⁷ byggde på förfaranden sammanfattas av Chapman och medarbetare i 1986 ^10. Villkoren för kollagen fibrillbildning i det tidigare arbetet var 0,18 mg / ml kollagen monomer i Na ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ (I = 0,2, pH 7,4) buffert vid 34 ° C. Nackdelen med denna och andra förfaranden som vi har försökt är att det alltid unbanded fibriller bildas vid sidan av de önskade bandad fibriller. Våra nya förhållanden är ~ 0,3 mg / ml kollagen monomer i 100 mM fosfat och 100 mM KCl vid pH 7 stå vid 37 ° C under 3-4 timmar. De förfarandenrande som beskrivs här skiljer sig i varje aspekt från den tidigare förfarandet för infödda kollagenfibriller. Men mest märkbart, har vi fördubblat jonstyrkan genom att höja buffertkoncentrationen och tillsätta 100 mM KCl. Ökningen i jonstyrka resulterar i mer enhetlig bildning av uteslutande bandad kollagenfibriller.

Enligt vår erfarenhet var de enda gånger att detta förfarande inte har producerats naturligt typ kollagen när kollagen monomerlösning var förbi tillverkarens rekommenderade datum för användning. När detta inträffar, vad observeras varierar från mindre fibriller som alla är unbanded många fibriller fortfarande observerade men huvudsakligen unbanded. Observera att utgånget kollagen monomer fortfarande ofta med framgång kan användas för att göra nativt kollagen, men när det misslyckas, bör nytt kollagen monomer definitivt köpas.

FLS identifierades först av Highberger et al. Krediteras Orekhovic ¹⁷ i kollagen preparatH et al. ^18. Ytterligare studier ledde Highberger och Schmitt att dra slutsatsen att det var α1-glykoprotein som främjar bildandet av FLS ^12. Vi kunde sedan kan replikera förfarandet för FLS kollagen genom att kombinera kommersiellt tillgänglig kollagen monomer och α1-syra glykoprotein vid lågt pH och långsamt låta pH stiga genom dialys blandningen mot vatten under 24 timmar ^11. Vi presenterar nu en modifiering av detta förfarande genom dialys kollagen monomeren mot vatten först och bara kombinera det med α1-syra glykoprotein i vatten för att bilda FLS kollagen. Villkoren för FLS kollagen montering beskrivs här är mycket mindre tidskrävande. Kollagen monomeren behöver fortfarande vara pre-dialyserades mot vatten, men det kan göras i bulk och lagrades sedan vid 4 ° C stabilt tills den används. Detta nya förfarande ger FLS huvudsakligen bandad kollagenfibriller.

Från vår erfarenhet, α1-syra Glycoprotein med en lägre sammanlagd protein och vattenhalt, och genom slutledning högre sockerhalt, är avgörande för att framgångsrikt göra FLS fibriller. Vi kontrollerar vanligen med tillverkaren att den α1-syra glykoprotein mycket vi använder har en kombinerad% protein och vattenhalt 82 eller mindre. Och som med förfarandet för nativt kollagen syntes, kollagen monomer som är för gammal kan också resultera i att man inte producera FLS kollagen. Dessutom, är renheten hos det vatten som används för dialysen kritiska i detta förfarande. Till exempel, dialys av kollagen-monomer även mot ~ 8 MΩ.cm stället> 18 MΩ.cm resulterar vatten i en kollagenlösning som inte kommer att bilda FLS kollagen.

Av de tre kollagen fibril typer är det enklaste att göra SLS kollagen. Den tidigaste beredningen av SLS beskrevs av Schmitt och medarbetare ^15. Vi publicerade en anpassning av detta förfarande 12 år sedan för att göra SLS kollagen med kommersiellt tillgängliga Collagen ^14. Förfarandet innebar att helt enkelt kombinera 2 mg / ml ATP och 0,5 mg / ml kollagen monomer i 0,05% (volym / volym) ättiksyra vid pH 3,5, och lämnar blandningen vid rumstemperatur över natten.

I vår erfarenhet, är den kritiska aspekten av SLS aggregat som måste styras pH hos reaktionslösningen. SLS monteras i mer grundläggande förhållanden (~ pH 3,6-3,9) resulterar i aggregerade klumpar kristalliter. Surare förhållanden (~ pH 2,9-3,2) resulterar i tunnare, mer avskilda kristalliter än de samlade under ideala förhållanden med pH 3,3-3,5. Reaktion pH utanför detta intervall (<2,8 och> 4) inte ger någon SLS kollagen. I det förflutna, inställdes vi pH för reaktionsblandningen genom tillsats av ättiksyra. För att förenkla förfarandet ytterligare, i detta manuskript introducerade vi en glycin-HCl-buffert för att kontrollera pH.

De tre olika kollagen strukturer bildade från protokollen beskrivna ovan har karaktärrealistisk funktioner som bara kan urskiljas genom instrument som kan nanometer upplösning. Infödda och FLS kollagen kännetecknas av band periodicitet av ~ 67 nm och ~ 270 nm. Den längsta dimensionen av SLS kollagen är bara ~ 360 nm. Vi har beskrivit specifikt hur vi använder en AFM att karakterisera tre olika kollagen strukturer. Dock bör alla AFM verkar i kontakt eller intermittent kontakt läge med någon AFM sond med <10 nm radie också kunna bild dessa kollagen strukturer. Dessutom, kan elektronmikroskopi vara och har använts för att karaktärisera dessa kollagen strukturer ^19.

Den stora fördelen med dessa förfaranden är att de producerar huvudsakligen den önskade kollagenkonstruktionen. Den enda andra formen av kollagen som finns i dessa reaktioner är utgångsmonomeren, som ofta syns i bakgrunden av AFM-bilder. I fallet med nativt och FLS kollagen, kan de lätt separeras från det mesta av orealicted monomeren genom upprepad centrifugering och tvättning av den resulterande nativt eller FLS kollagen pelleten med vatten.

Vi har presenterat enkla och tillförlitliga förfaranden för att göra infödda, FLS och SLS kollagen med hjälp av avancerade, kommersiellt tillgängliga utgångsmaterial. Kollagenet monomeren som används i alla dessa förfaranden är kommersiellt tillgänglig i en renad form. α1-glykoprotein och ATP är också båda kommersiellt tillgängliga.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl)	Inamed Advanced Biomatrix	5409 5005-B	Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1)
ATP	Research Biochemicals International	A-141	Lot FBJ-1194A
α1-acid glycoprotein from bovine plasma	Sigma-Aldrich	G3643	Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content)
a1-acid glycoprotein from human plasma	Sigma-Aldrich	G9885	Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content)
mica	Ted Pella	53
Pointprobe - Silicon SPM-Sensor	Nanoworld	NHC	Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode
Veeco Nanoprobe Tips	Veeco (now Bruker AFM probes)	NP-S	Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode