In vitro Syntese av Native, Fibrous Long Mellomrom og Segmental Long avstand Kollagen

Summary

Enkel og reproduserbare fremgangsmåter er beskrevet for å lage tre strukturelt forskjellige kollagen forsamlinger fra en felles kommersielt tilgjengelig type I kollagen monomer. Native type, kan fibrøst lang avstand eller segmentell lang avstand kollagen konstrueres ved å variere de vilkår som gjelder 300 nm lang og 1,4 nm diameter monomer byggesten er eksponert.

Abstract

Kollagen fibriller er tilstede i den ekstracellulære matriks av animalsk vev for å gi strukturell stillas og mekanisk styrke. Disse native kollagen fibriller har en karakteristisk banding periodisitet av ~ 67 nm og er dannet i vivo gjennom den hierarkiske montering av type I-kollagen monomerer, som er 300 nm i lengde og 1,4 nm i diameter. In vitro, ved å variere de vilkår som gjelder monomer byggesteinene er utsatt, kan unike strukturer som varierer i lengde skalerer opp til 50 mikron bygges, herunder ikke bare innfødte typen fibriller, men også fibrøst lang avstand og segmental lang avstand kollagen. Heri, presenterer vi prosedyrer for å danne de tre forskjellige kollagen strukturer fra en felles kommersielt tilgjengelig kollagen monomer. Bruke protokoller som vi og andre har publisert i det siste for å gjøre disse tre typene vanligvis føre til blandinger av strukturer. Spesielt var unbanded fibriller vanligvis found når du gjør innfødt kollagen, og innfødte fibriller var ofte til stede når du gjør fibrøst lang avstand kollagen. Disse nye fremgangsmåtene har den fordelen av å produsere den ønskede kollagen fibrill attraksjon nesten utelukkende. Dannelsen av de ønskede strukturer er bekreftet ved hjelp av en avbildning atommikroskop.

Introduction

Kollagen er en klasse av strukturelle proteiner som har en trippel helisk struktur dannet fra tre polypeptidkjeder. Disse trippel spiralformede monomerer videre sammen i en hierarkisk måte å danne gradvis større strukturer. Det er minst 28 genetisk forskjellige kollagen typer som er identifisert ^1. Kombinert, kollagener utgjør 30% av det totale protein som finnes i dyr, med type I den dominerende form står for opptil 90% av alle de kollagen proteiner ^2. Type I kollagen er funnet som fibrillous strukturer i hud, leddbånd, sener og bein. Atommikroskop (AFM) og elektronmikroskop (EM) bilder av type I innfødte kollagenfibre typisk viser striper med en karakteristisk periode ~ 67 nm (ofte referert til som D-banding) ^3-5.

Type I kollagen monomer er en trippel helisk heterotrimer bestående av to identiske α1 (I) kjeder og en α2 (I) kjeden, hver mer enn entusen aminosyrer lange. Det er lang og tynn med dimensjoner på 300 nm i lengde og 1,4 nm i diameter. Type I kollagen monomer kan lett oppnås ved å bryte ned naturlig dannet høyere orden strukturer ^6. Vi ⁷ og mange andre ^8-10 har vist at disse oppløselige monomer byggesteinene kan deretter brukes til å rekonstruere D-båndede fibriller in vitro (Figur 1).

I tillegg til innfødte kollagen fibriller, har to andre høyere ordens kollagen strukturer blitt funnet å danne in vitro ved hjelp av samme monomer byggeblokk. De to strukturene er fibrøs lang avstand (FLS) og segmental lang avstand (SLS) kollagen (Figur 1). FLS kollagen er en fibrillous konstruksjon som innfødt kollagen, men er preget av en større banding periodisitet enn innfødte kollagen ^11. In vitro, danner FLS kollagen når kollagen monomer er kombinert med α1-glykoprotein in vivo også, selv om sjelden ^13. SLS kollagen er beskrevet som krystallitter fordi monomerene er innrettet i register som i en krystallgitteret ^14. SLS kollagen danner når kollagen monomer kombineres med adenosintrifosfat (ATP) ^15. Naturlig forekommende SLS kollagen er blitt observert i dyrkningsmediet av fibroblaster, men ikke i utvunnet vevsprøver, sannsynligvis på grunn av sin lille størrelse og mangel på skjelnes topografiske trekk ^16.

Målet med dette manuskriptet er å presentere detaljerte prosedyrer for å innfødte kollagen fibriller så vel FLS og SLS kollagen som selv den mest uerfarne forsker kan reprodusere. Hjelp av kommersielt tilgjengelige avanserte start materialer, har vi forsøkt å gjøre protokollene så enkelt som mulig og fortsatt jobbe dem har pålitelig. Vi har også detalj hvordan du bruker en AFM å karakterisere de forskjellige kollagen strukturs som er gjort. Dette arbeidet vil være fordelaktig for forskere som ønsker å studere ett eller flere av disse høyere ordens kollagen strukturer og / eller bruke dem som forløpere i andre programmer, men i dag mangler av kompetanse eller rett og slett ikke ønsker å jobbe med vevsprøver.

Protocol

MERK: Vannet brukes i alle protokoller har en resistivitet> 18 MΩ.cm.

1. Native kollagen fibriller

1. Kombiner 6 ul vann, 20 ul av 200 mM Na ₂ HPO ₄ justeres til pH 7 med HCl og 10 pl 400 mM KCl i en mikrosentrifuge rør og bland.
2. Tilsett 4 pl kollagen monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCl) til mikrosentrifuge røret og bland. Oppløsningen skal være klar og fargeløs.
3. Plasser mikrosentrifuge røret som inneholder reaksjonsblandingen i en varme-blokk som har blitt forvarmet til 37 ° C og la stå i 3-4 timer. På dette punktet, bør løsningen være litt overskyet og inneholder hovedsakelig innfødte kollagen fibriller.

2. Fibrøs Long mellomrom Kollagen

1. Dialyser 1 ml kollagen monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCl) med 12-14 kDa MWCO membran mot 400 ml vann, endrer vannet fire ganger over en periode på 24 timer ved romtemperatur. Den dialyserte collagno monomer som ikke brukes umiddelbart kan lagres ved 4 ° C for fremtidig bruk.
2. Kombiner 20 ul vann, 20 pl av 3 mg / ml α1-glykoprotein i vann og 20 pl av dialyserte kollagen monomer i en mikrosentrifuge tube. Oppløsningen skal være klar og fargeløs.
3. Forlate mikrosentrifuge røret som inneholder reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 30 min. På dette punktet, bør løsningen være overskyet og inneholder hovedsakelig FLS kollagen fibriller.

3. Segmental Long mellomrom Kollagen

1. Kombiner 67 ul vann, 60 ul av 100 mM glycin-HCl-buffer ved pH 3,3 og 40 pl av 10 mg / ml ATP i vann i en mikrosentrifuge rør og bland.
2. Legg 33 pl av kollagen monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCl) til mikrosentrifuge røret og bland. Oppløsningen skal være klar og fargeløs.
3. Forlate mikrosentrifuge røret som inneholder reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 2 timer. På dette punktet, vil løsningen fortsatt vises klart, men børinneholde det meste SLS kollagen.

4. AFM Karakterisering

1. Kløve overflaten av et stykke av glimmer tilknyttet en AFM substrat ved å dekke overflaten med en glimmer stykke tape og deretter peeling det bort. Kontroller båndet etterpå for å bekrefte at en hel sjikt av glimmer ble spaltet for å redusere uregelmessigheter på overflaten og sikre at den gamle prøven fjernes hvis glimmeret blir gjenbrukt.
2. Påfør 20fil kollagen fibrill løsningen til ferskt kløyvde glimmer substrat. Permisjon for 5 min.
3. Forsiktig skyll oppløsning av kollagen fibrill med vann. Det er ikke tilrådelig å anvende vann direkte på sentrum av glimmer substratet men på kanten og å tillate det å strømme over prøven.
4. Tørke overflaten under en forsiktig strøm av nitrogengass. Det er tilrådelig å lede strømmen ved kanten og ikke på midten av glimmer substratet.
5. Under et optisk mikroskop ved 200 × forstørrelse,de innfødte og FLS kollagen prøver bør vise klumper av fibriller. SLS kollagen vil ikke være synlig.
6. De unike egenskapene til de tre forskjellige kollagen strukturer er observerbare av AFM. Vanligvis vi bilde innfødte kollagen fibriller med en AFM i periodisk kontakt modus med silisium AFM prober, mens FLS og SLS kollagen fibriller vi vanligvis bilde med AFM i kontakt modus ved hjelp silisiumnitrid AFM prober. Vi gjør dette på grunn av tid og kostnadsvurderinger. Silicon AFM prober er vanligvis skarpere enn silisiumnitrid AFM prober, som gjør dem spesielt nyttig for imaging smalere striper struktur av innfødte kollagen fibriller. Men silisium AFM prober er mye mer utsatt for forurensning av kollagen prøver enn silisiumnitrid AFM prober og må skiftes ofte. Derfor forbeholder vi oss bruk av silisium AFM prober meste for imaging innfødte kollagen fibriller der oppløsning er en større nødvendighet og vi opererer i intermitterende kontakt modus til Prolong deres levetid nytten.

Vi anbefaler en innledende 100 × 100 mikrometer ² scan som skal vise minst et par kollagen konstruksjoner. Derfra, zoome inn for å skanne størrelser på 10 × 10 mikrometer ² og deretter 2 × 2 mikrometer ² å observere banding periodisitet av innfødte og FLS kollagen, eller de finere funksjonene i en SLS kollagen. Det er også en god idé å sjekke minst to andre regioner på kollagen prøven for å bekrefte at de første skanner er representative.

Representative Results

Native kollagen

Reaksjonsblandingen av ~ 0,3 mg / ml kollagen monomer i 100 mM fosfat og 100 mM KCl ved pH 7 igjen på 37 ° C i 3-4 timer vil gi en løsning som inneholder innfødte attraksjon kollagen fibriller med klart ~ 67 nm D-banding, uten unbanded fibriller.

Under en optisk mikroskop ved 200 x forstørrelse kan klumper av flere fibriller finnes normalt sett på glimmer substratet spesielt når sett av differensial interferens kontrast (DIC) mikroskopi (figur 2). I en typisk prøve, en tilfeldig 100 × 100 mikrometer ² scan av AFM vil vanligvis viser minst et par fibriller som er 5-50 mikrometer lange (figur 3A-C). Individ, kan separerte kollagen fibriller lett identifiseres på dette stadiet. Med en 512 × 512 piksler ² image scan, zoome inn en 10 × 10 mikrometer ² skannestørrelse viser at alle fibriller strappes (Tall 3d-f 2 skannestørrelse (Tall 3g-i).

Banding periodisitet kan bestemmes ved ganske enkelt å måle og beregne et gjennomsnitt den langsgående avstanden mellom flere topper eller bunner. Alternativt, hvis AFM programvaren tillater, et endimensjonalt Fourier transform langs en ​​langsgående tverrsnitt kan også benyttes. Fig. 4 viser en AFM høyde bilde av en fibrill og en tilsvarende langsgående tverrsnitt.

FLS kollagen

Reaksjonsblandingen av 1 mg / ml μ1-syre glykoprotein og ~ 1 mg / ml kollagen monomer i vann igjen ved romtemperatur i 30 min vil gi en oppløsning av FLS kollagen fibriller.

Klumper av fibriller, som ligner det som er observert i tilfelle av naturlig kollagen, kan lett sees på glimmer metallet under et optisk mikroskop ved 200 x magnification. I en typisk prøve, vil en tilfeldig 100 × 100 mikrometer ² scan av AFM vanligvis viser minst et par fibriller. Med en 512 × 512 pixel ² bilde skannestørrelsen kan banding periodisitet måles ved å zoome inn en 10 x 10 mikrometer ² skanning (Figur 5a) eller mer nøyaktig med en 2 x 2 um ² skanning (figur 5b). Figur 5c viser et langsgående tverrsnitt av en FLS fibrill.

SLS kollagen

Reaksjonsblandingen på 2 mg / ml ATP og ~ 0,5 mg / ml av kollagen monomer i 100 mM glycin-HCl-buffer ved pH 3,3 hensatt ved romtemperatur i 2 timer vil gi en oppløsning av SLS kollagen.

Vanligvis vil SLS krystallitter ikke være synlig under en optisk mikroskop. En AFM er nødvendig for å bekrefte tilstedeværelse av SLS krystallitter. I en typisk prøve, vil en tilfeldig 100 × 100 mikrometer ² scan av AFM vanligvis viser mangeprikker. Zoome inn en 10 x 10 mikrometer ² skanningen vil vanligvis vise flere SLS krystallitter (figur 6a). Og en 2 × 2 mikrometer ² scan (figur 6b) viser finere strukturen i en SLS crystallite.

Figur 1. De tre strukturelt forskjellige former for kollagen fibriller som kan dannes in vitro fra kollagen monomer. AFM images depicting kollagen monomer og de ​​tre høyere etter kollagen strukturer alle på samme størrelse skala (2 x 2 mikrometer ^2).

Figur 2. Digital image på ~ 200 × forstørrelse av optisk DIC mikroskopi av innfødte kollagen fibriller på glimmer (a) urørt og (b) thresholded og skjerpet to markere fibriller.

Figur 3. AFM bilder av innfødte kollagen fibriller på glimmer. Intermitterende kontakt mode AFM amplitude bilder skal vises.

Figur 4. (A) 0,5 x 1 um ² avbrutt kontakt modus AFM høyde bilde (vertikal skala = 100 nm) og (b) langsgående tverrsnitt av en innfødt kollagen fibrill.

Figur 5. AFM bilder av FLS kollagen fibriller på glimmer. (A) 10 x 10 mikrometer ² kontakt Modus AFM nedbøyning bilde, (b) 2 x 2 mikrometer ² kontakt Modus AFM nedbøyning bilde og (c) langsgåendetverrsnitt av en FLS kollagen fibrill.

Figur 6. AFM bilder av SLS kollagen på glimmer. Intermitterende kontakt mode AFM amplitude bilder skal vises.

Discussion

Renset kollagen monomer er stabil ved lav pH og temperatur og dannelse av innfødte kollagen fibriller hovedsak innebærer å heve pH og temperatur i kollagen monomer løsning. Prosedyrer for rekonstituering av banded kollagen fibriller fra monomerer har eksistert i mer enn 50 år. Prosedyren som vårt laboratorium som brukes i våre første studier med kollagen for 15 år siden ⁷ ble basert på prosedyrer oppsummert av Chapman og medarbeidere i 1986 ^10. Forholdene for kollagen fibrill formasjonen i denne tidligere arbeidet var 0,18 mg / ml kollagen monomer i Na ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ (I = 0,2, pH 7,4) buffer ved 34 ° C. Ulempen med denne og andre prosedyrer som vi har prøvd er at det er alltid unbanded fibriller dannet sammen de ønskede banded fibriller. Våre nye forholdene er ~ 0,3 mg / ml av kollagen monomer i 100 mM fosfat og 100 mM KCl ved pH 7 igjen på 37 ° C i 3-4 timer. ProceDure beskrevet forskjellig i alle aspekter fra tidligere prosedyre for å lage innfødte kollagen fibriller. Men mest merkbart har vi doblet ionestyrken ved å heve buffer konsentrasjon og tilsette 100 mM KCl. Økningen i ionestyrke resulterer i mer konsekvent dannelsen av utelukkende banded kollagen fibriller.

I vår erfaring, var de eneste ganger at denne prosedyren ikke har produsert innfødte typen kollagen når kollagen monomer løsningen var forbi produsentens anbefalte dato for bruk. Når dette skjer, er det observert varierer fra færre fibriller som alle unbanded til mange fibriller fortsatt observert, men hovedsakelig unbanded. Vær oppmerksom på at utløpt kollagen monomer kan ofte bli brukt til å lage innfødte kollagen, men når det mislykkes, bør nye kollagen monomer definitivt kjøpes.

FLS ble først identifisert av Highberger et al. ¹⁷ i kollagen preparater kreditert Orekhovich et al. ^18. Videre studier ledet Highberger og Schmitt å konkludere med at det var α1-glykoprotein som fremmer dannelsen av FLS ^12. Vi var i stand til å replikere senere Framgangsmåten FLS kollagen ved å kombinere kommersielt tilgjengelige kollagen monomer og α1-syre glykoprotein ved lav pH og langsomt la pH å stige med dialyzing blandingen mot vann i 24 timer ^11. Presenterer vi en modifikasjon av den prosedyren ved dialyzing kollagen monomer mot vann først og bare å kombinere den med α1-syre glykoprotein i vann for å danne FLS kollagen. Vilkårene for FLS kollagen montering beskrevet her er mye mindre tidkrevende. Kollagen monomer trenger fortsatt å være pre-dialysert mot vann, men det kan gjøres i bulk, og deretter lagres ved 4 ° C stabilt inntil det brukes. Denne nye prosedyren gir FLS hovedsakelig banded kollagen fibriller.

Fra vår erfaring, α1-syre glycoprotein med en lavere kombinert protein og vanninnhold, og ved slutning høyere sukkerinnhold, er avgjørende for vellykket lage FLS fibriller. Vi vanligvis sjekke med produsenten om at α1-syre glykoprotein mye vi bruker har en kombinert% protein og vanninnhold på 82 eller mindre. Og som med framgangsmåten for native kollagensyntesen, kollagen monomer som er for gamle kan også resultere i svikt å produsere FLS kollagen. I tillegg, er renheten av vannet som brukes til dialyse kritisk i denne prosedyren. For eksempel, dialyse av kollagen monomer mot selv ~ 8 MΩ.cm snarere enn> 18 MΩ.cm vann resulterer i en kollagen-løsning som ikke vil danne FLS kollagen.

Av de tre kollagen fibril typer, er den enkleste å lage SLS kollagen. Den tidligste utarbeidelse av SLS ble beskrevet av Schmitt og medarbeidere ^15. Vi publiserte en tilpasning av den prosedyren for 12 år siden for å gjøre SLS kollagen hjelp av kommersielt tilgjengelige collagen ^14. Prosedyren simpelthen innebar kombinere 2 mg / ml ATP og 0,5 mg / ml av kollagen monomer i 0,05% (v / v) eddiksyre ved pH 3,5, og forlater blandingen ved romtemperatur over natten.

Etter vår erfaring er den kritiske aspektet av SLS montering som må kontrolleres pH i reaksjonsløsningen. SLS samlet i mer grunnleggende forhold (~ pH 3.6 til 3.9) resultater i aggregerte klumper av krystallitter. Mer sure forhold (~ pH 2.9 til 3.2) resulterer i tynnere, mer atskilt krystallitter enn de samlet under ideelle forhold med pH 3.3 til 3.5. Reaksjons pH-verdier utenfor dette området (<2,8 og> 4) ikke gir noen SLS kollagen. I det siste, justert vi pH av reaksjonsblandingen ved tilsetning av eddiksyre. For å forenkle prosedyren ytterligere, i dette manuskriptet introduserte vi en glycin-HCl-buffer for å kontrollere pH.

De tre forskjellige kollagen strukturer dannet fra protokollene beskrevet ovenfor har tegnetrealistisk funksjoner som bare kan fanges av virkemidler som kan nanometer oppløsning. Innfødte og FLS kollagen er preget av banding periodicities av ~ 67 nm og ~ 270 nm. Den lengste dimensjon SLS kollagen er bare ~ 360 nm. Vi har beskrevet spesielt hvordan vi bruker en AFM å karakterisere de tre ulike kollagen strukturer. Men eventuelle AFM opererer i kontakt eller periodisk kontakt modus med alle AFM-probe med <10 nm radius også kunne image disse kollagen strukturer. I tillegg kan elektronmikroskopi være og har vært brukt for å karakterisere disse kollagen strukturene ^19.

Den store fordelen med disse prosedyrene er at de produserer hovedsakelig den ønskede kollagen konstruere. Den eneste andre formen av kollagen som er funnet i disse reaksjonene er utgangsmaterialet monomer, som er ofte synlig i bakgrunnen av AFM bildene. I tilfelle av innfødte og FLS kollagen, kan de lett skilles fra det meste av uricted monomer ved gjentatt sentrifugering og vasking av det resulterende innfødte eller FLS kollagen pellet med vann.

Vi har presentert enkle og pålitelige rutiner for å lage innfødte, FLS og SLS kollagen ved hjelp av avanserte, kommersielt tilgjengelige utgangsmaterialer. Kollagen monomer brukes i alle disse prosedyrene er kommersielt tilgjengelig i en renset form. α1-glykoprotein og ATP er også begge tilgjengelig kommersielt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl)	Inamed Advanced Biomatrix	5409 5005-B	Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1)
ATP	Research Biochemicals International	A-141	Lot FBJ-1194A
α1-acid glycoprotein from bovine plasma	Sigma-Aldrich	G3643	Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content)
a1-acid glycoprotein from human plasma	Sigma-Aldrich	G9885	Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content)
mica	Ted Pella	53
Pointprobe - Silicon SPM-Sensor	Nanoworld	NHC	Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode
Veeco Nanoprobe Tips	Veeco (now Bruker AFM probes)	NP-S	Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode