Summary
Enkle og reproducerbare procedurer er beskrevet til fremstilling af tre strukturelt forskellige collagen samlinger fra en fælles kommercielt tilgængelig type I collagen monomer. Native type, kan fibrøst lange mellemrum eller segmenterede lang afstand collagen konstrueres ved at variere de betingelser, som de 300 nm lang og 1,4 nm diameter monomer byggesten er blotlagt.
Abstract
Collagenfibriler er til stede i den ekstracellulære matrix i dyrevæv at tilvejebringe strukturel stilladser og mekanisk styrke. Disse native collagenfibriler har en karakteristisk banding periodicitet ~ 67 nm og er dannet in vivo ved hierarkisk samling af type I collagen monomerer, som er 300 nm i længde og 1,4 nm i diameter. In vitro, ved at variere de betingelser, som monomerbyggeblokke er udsat, kan unikke strukturer spænder i længdeskalaer op til 50 mikrometer konstrueres, herunder ikke blot native typen fibriller, men også fiberholdigt lang afstand og segmentær lang afstand collagen. Heri, præsenteres fremgangsmåder til dannelse af de tre forskellige collagen strukturer fra en fælles kommercielt tilgængeligt collagen monomer. Anvendelse af de protokoller, som vi og andre har offentliggjort i fortiden at gøre disse tre typer fører typisk til blandinger af strukturer. Især var unbanded fibriller almindeligt found når du foretager native collagen, og indfødte fibriller var ofte til stede, når de foretager fibrøst lang afstand collagen. Disse nye fremgangsmåder har den fordel at producere det ønskede collagen fibril typen næsten udelukkende. Dannelse af de ønskede strukturer bekræftes ved billeddannelse under anvendelse af et atomic force mikroskop.
Introduction
Collagen er en klasse af strukturelle proteiner, der har en tredobbelt spiralformet struktur dannet af tre polypeptidkæder. Disse tredobbelte heliske monomerer yderligere samles i en hierarkisk måde til dannelse af progressivt større strukturer. Der er mindst 28 genetisk forskellige kollagentyper, der er identificeret 1. Kombineret, kollagener udgør 30% af det totale protein, der findes i dyr, med type I den fremherskende form tegner sig for op til 90% af alle de collagenproteiner 2. Type I collagen findes som fibrillous strukturer i hud, ledbånd, sener og knogler. Atomic force mikroskop (AFM) og elektronmikroskop (EM) billeder af type I native collagenfibre typisk er banding med en karakteristisk periode på ~ 67 nm (ofte omtalt som D-banding) 3-5.
Type I collagen monomer er en tredobbelt spiralformet heterotrimer bestående af to identiske α1 (I)-kæder og en α2 (I)-kæden, hver mere end entusind aminosyrer langt. Det er lang og tynd med dimensioner på 300 nm i længde og 1,4 nm i diameter. Type I collagen monomer kan let opnås ved at nedbryde naturligt dannes strukturer af højere orden 6. Vi 7 og mange andre 8-10 har vist, at disse opløselige monomerbyggeblokke derefter kan anvendes til at rekonstruere D-banded fibriller in vitro (figur 1).
Ud over native collagenfibriler har to andre højere ordens collagen strukturer vist sig at danne in vitro under anvendelse af samme monomer byggesten. De to strukturer er fibrøse lang afstand (FLS) og segmenterede lang afstand (SLS) collagen (figur 1). FLS collagen er en fibrillous konstruktion som nativt collagen, men er kendetegnet ved en større banding periodicitet end nativ collagen 11. In vitro FLS collagen dannes, når collagen monomer kombineres med α1-syreglycoprotein
Målet med dette manuskript er at præsentere detaljerede procedurer for at gøre indfødte collagenfibriller samt FLS og SLS kollagen, at selv den mest uerfarne forsker kan gengive. Anvendelse af kommercielt tilgængelige avancerede udgangsmaterialer, har vi forsøgt at gøre protokollerne så enkle som muligt og stadig har dem arbejde pålideligt. Vi har også detalje, hvordan man bruger en AFM til at karakterisere de forskellige kollagen strukturs, der er lavet. Dette arbejde vil være til gavn for forskere, der ønsker at studere et eller flere af disse højere orden kollagen strukturer og / eller bruge dem som forstadier i andre programmer, men på nuværende tidspunkt mangler den ekspertise eller simpelthen ikke ønsker at arbejde med vævsprøver.
Protocol
BEMÆRK: vand, der anvendes i alle de protokoller har en resistivitet> 18 MΩ.cm.
1. Native kollagenfibriller
- Kombiner 6 pi vand, 20 pi 200 mM Na 2 HPO 4 justeret til pH 7 med HCI og 10 gl 400 mM KCl i et mikrofugerør og blandes.
- Tilsættes 4 pi af kollagen monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCI) til mikrofugerør og blandes. Opløsningen skal være klar og farveløs.
- Anbring mikrocentrifugerør indeholdende reaktionsblandingen i en varmeblok, der er blevet opvarmet til 37 ° C og henstår i 3-4 timer. På dette tidspunkt skal opløsningen være lidt overskyet og indeholder hovedsageligt indfødte kollagenfibriller.
2. Fibrøse Lang afstand Collagen
- Dialyseres 1 ml collagen monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCI) under anvendelse af 12-14 kDa MWCO membran mod 400 ml vand, ændre vand fire gange over en periode på 24 timer ved stuetemperatur. Den dialyserede collagen monomer, der ikke anvendes med det samme kan opbevares ved 4 ° C til fremtidig brug.
- Kombiner 20 pi vand, 20 pi 3 mg / ml α1-syre-glycoprotein i vand og 20 ul dialyseret collagen monomer i et mikrofugerør. Opløsningen skal være klar og farveløs.
- Forlade mikrocentrifugerør indeholdende reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 30 minutter. På dette tidspunkt skal opløsningen være uklar og indeholder overvejende FLS kollagenfibriller.
3. Segmentær Lang afstand Collagen
- Kombiner 67 pi vand, 60 pi 100 mM glycin-HCl-puffer ved pH 3,3 og 40 pi 10 mg / ml ATP i vand i et mikrofugerør og blandes.
- Tilsættes 33 ul kollagen monomer (~ 3 mg / ml i 0,01 N HCI) til mikrofugerør og blandes. Opløsningen skal være klar og farveløs.
- Forlade mikrocentrifugerør indeholdende reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 2 timer. På dette tidspunkt, vil løsningen stadig fremstår klart, men børmest indeholder SLS collagen.
4. AFM karakteriserinq
- Spalter overfladen af et stykke af glimmer fastgjort til en AFM substrat ved at dække glimmer overflade med et stykke tape og derefter at trække den væk. Tjek båndet bagefter at bekræfte, at et helt lag af glimmer blev spaltet for at reducere uregelmæssigheder på overfladen, og sikrer, at den gamle prøve fjernes, hvis glimmer bliver genanvendt.
- Anvendes 20 pi af collagen fibril løsning på frisk spaltet glimmer substrat. Lad i 5 min.
- Forsigtigt skylle opløsning af kollagen fibril med vand. Det er tilrådeligt ikke at anvende vand direkte på midten af glimmer substrat, men ved kanten, og således at den kan strømme over prøven.
- Tørre overfladen under en let strøm af nitrogengas. Det er tilrådeligt at rette strømmen ved kanten og ikke i midten af glimmer substratet.
- Under et optisk mikroskop ved 200 ganges forstørrelse,de indfødte og FLS kollagen prøver skal vise klumper af fibriller. SLS kollagen vil ikke være synlig.
- De unikke egenskaber ved de tre forskellige kollagen strukturer kan observeres ved AFM. Generelt har vi billedet native collagenfibriller med en AFM i periodisk kontakt tilstand ved hjælp silicium AFM prober, mens FLS og SLS collagenfibriller vi typisk billede med en AFM i kontakt tilstand ved hjælp siliciumnitrid AFM prober. Vi gør dette på grund af tids-og omkostningsmæssige overvejelser. Silicium AFM prober er normalt skarpere end siliciumnitrid AFM prober, som gør dem særligt anvendelige til billeddannelse af smallere bånd strukturen af native kollagenfibriller. Imidlertid silicium AFM prober er meget mere sårbare over for kollagen prøver end siliciumnitrid AFM prober og skal udskiftes ofte. Derfor forbeholder vi os brugen af silicium AFM prober meste for billeddannelse native collagenfibriler hvor opløsning er en større nødvendighed, og vi arbejder i periodisk kontakt mode til Prolong deres levetid nytte.
Vi anbefaler en indledende 100 × 100 um 2 scanning, som skal vise mindst et par kollagenkonstruktioner. Derfra, zoom ind til at scanne størrelser på 10 × 10 um 2 og derefter 2 × 2 um 2 for at observere banding periodicitet af nativt og FLS collagen, eller de finere elementer i en SLS collagen. Det er også en god ide at tjekke mindst to andre regioner på collagen stikprøver for at efterprøve, at de indledende scanninger er repræsentative.
Representative Results
Native collagen
Reaktionsblandingen af ~ 0,3 mg / ml collagen monomer i 100 mM phosphat og 100 mM KCI ved pH 7 henstod ved 37 ° C i 3-4 timer vil give en opløsning indeholdende native Type collagenfibriller med klar ~ 67 nm D-banding, uden unbanded fibriller.
Under et optisk mikroskop ved 200 ganges forstørrelse, kan klumper af flere fibriller der normalt ses på glimmer substratet især når de ses ved differentiel interferens kontrast (DIC) mikroskopi (fig. 2). I en typisk prøve, × en tilfældig 100 100 um 2 scanning ved AFM vil normalt vise mindst et par fibriller, der er 5-50 mikron lang (3a-c). Individuel, kan adskilte collagenfibriler let identificeres på nuværende tidspunkt. Med en 512 × 512 pixel 2 image scanning, viser zoome ind i en 10 × 10 um 2 scanningsformat at alle fibriller er stribede (figur 3d-f 2 scanningsformat (figur 3g-i).
Banding hyppighed kan bestemmes ved blot at måle og midling den langsgående afstand mellem flere toppe eller dale. Alternativt, hvis AFM softwaren tillader, en endimensional Fourier transformation langs et langsgående tværsnit kan også anvendes. Figur 4 viser en AFM højde billede af en fibril, og et tilsvarende længdesnit.
FLS collagen
Reaktionsblandingen af 1 mg / ml μ1-syre glycoprotein og ~ 1 mg / ml collagen monomer i vand henstod ved stuetemperatur i 30 minutter vil give en opløsning af FLS kollagenfibriller.
Klumper af fibriller, der minder om det, der observeres for nativt collagen, kan let ses på glimmer substratet under et optisk mikroskop ved 200 × magnification. I en typisk prøve, vil en tilfældig 100 × 100 um 2 scan af AFM normalt vise mindst et par fibriller. Med en 512 x 512 pixel 2 image scanningsstørrelse kan banding hyppighed måles ved at zoome ind i en 10 x 10 um to scan (fig. 5a) eller mere præcist med en 2 × 2 um to scan (fig. 5b). Figur 5c viser et langsgående tværsnit af en FLS fibril.
SLS collagen
Reaktionsblandingen på 2 mg / ml ATP og ~ 0,5 mg / ml collagen monomer i 100 mM glycin-HCl puffer ved pH 3,3 ved stuetemperatur i 2 timer vil give en opløsning af SLS collagen.
Typisk vil SLS krystallitter ikke være synlige under et optisk mikroskop. En AFM er forpligtet til at bekræfte tilstedeværelsen af SLS krystallitter. I en typisk prøve, vil en tilfældig 100 × 100 um 2 scan af AFM normalt vise mangeprikker. Zoomer til en 10 x 10 um to scan vil normalt vise flere SLS krystallitter (figur 6a). Og en 2 × 2 um to scan (fig. 6b) viser finere struktur af et SLS krystallit.
Fig. 1. De tre strukturelt forskellige former for collagenfibriler, der kan dannes in vitro fra collagen monomer. AFM billeder viser collagen monomer og de tre højere orden collagen strukturer alle på samme størrelse skala (2 × 2 um 2).
Figur 2. Digital billede ved ~ 200 x forstørrelse ved optisk DIC mikroskopi af native collagenfibriler på mica (a) uberørt og (b) tærskelværdisammenlignet og skærpet to fremhæve fibriller.
Figur 3. AFM billeder af native collagenfibriler på mica. Periodisk kontakt tilstand AFM amplitude billeder skal vises.
Figur 4. (A) 0,5 × 1 um to intermitterende kontakt tilstand AFM højde billede (vertikal skala = 100 nm) og (b) langsgående tværsnit af en nativ collagen fibril.
Figur 5. AFM billeder af FLS collagenfibriller på glimmer. (A) 10 × 10 um to kontakt-mode AFM udbøjning image, (b) 2 × 2 um to kontakt-mode AFM deformation billede og (c) længdesnittværsnit af en FLS collagen fibril.
Figur 6. AFM billeder af SLS collagen på mica. Periodisk kontakt tilstand AFM amplitude billeder skal vises.
Discussion
Renset collagen monomer er stabil ved lav pH-værdi og temperatur og dannelse af native collagenfibriler involverer i det væsentlige at hæve pH og temperatur af collagen monomeropløsning. Procedurer for rekonstituering af stribede collagenfibriler fra monomerer har eksisteret i mere end 50 år. Den procedure, at vores laboratorium, der anvendes i vores første forsøg med kollagen for 15 år siden 7 blev baseret på procedurer, sammenfattet af Chapman og medarbejdere i 1986 10. Betingelserne for kollagen fibrildannelse i, at tidligere arbejde var 0,18 mg / ml collagen monomer i Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) buffer ved 34 ° C. Ulempen ved denne og andre procedurer, som vi har forsøgt, er, at der altid er unbanded fibriller dannet sammen med de ønskede stribede fibriller. Vores nye betingelser ~ 0,3 mg / ml collagen monomer i 100 mM phosphat og 100 mM KCI ved pH 7 henstod ved 37 ° C i 3-4 timer. Proceduren beskrevet heri adskiller sig i alle aspekter fra den tidligere procedure for at gøre indfødte kollagenfibriller. Men mest mærkbart, har vi fordoblet ionstyrke ved at hæve bufferens koncentration og tilsætning af 100 mM KCI. Stigningen i ionstyrke resulterer i mere ensartet dannelse af udelukkende banded collagenfibriler.
Det er vores erfaring, var de eneste gange, at denne procedure ikke har produceret native type, collagen, når collagen monomeropløsningen var forbi producentens anbefalede dato for anvendelse. Når dette sker, er, hvad der observeres i området fra mindre fibriller, der alle unbanded til mange fibriller stadig observeret, men overvejende unbanded. Bemærk, at udløbet collagen monomer ofte stadig kan med held anvendes til at lave native collagen, men når det ikke lykkes, bør nye kollagen monomer absolut købes.
FLS blev først identificeret af Highberger et al. 17 i collagen præparater krediteres Orekhovich et al. 18. Yderligere undersøgelser førte Highberger og Schmitt at konkludere, at det var α1-syre-glycoprotein, der fremmer dannelsen af FLS 12. Vi kunne senere replikere proceduren for FLS kollagen ved at kombinere kommercielt tilgængelige collagen monomer og α1-syreglycoprotein ved lavt pH og langsomt tillader pH at stige ved at dialysere blandingen mod vand i 24 timer 11. Vi præsenterer nu en modifikation af denne procedure ved at dialysere collagen monomer mod vand først og simpelthen kombinere det med α1-syre-glycoprotein i vand til dannelse FLS collagen. Betingelserne for FLS collagen montering beskrevet her er langt mindre tidkrævende. Kollagen monomer stadig være præ-dialyseret mod vand, men det kan gøres i bulk og derefter opbevaret ved 4 ° C stabilt indtil det anvendes. Denne nye procedure giver overvejende FLS stribede kollagenfibriller.
Fra vores erfaring, glyco α1-syreprotein med en lavere kombineret protein og vandindhold og ved inferens højere sukkerindhold, er kritisk for en vellykket fremstilling FLS fibriller. Vi typisk tjekke med producenten, at den α1-syre-glycoprotein parti vi bruger har en kombineret% protein og vandindhold på 82 eller mindre. Og som med proceduren for nativt collagensyntese, collagen monomer, der er for gammel kan også resultere i manglende produktion FLS collagen. Desuden er renheden af det vand, der anvendes til dialyse kritisk i denne procedure. For eksempel. Dialyse af kollagen monomer mod selv ~ 8 MΩ.cm stedet> 18 MΩ.cm vand resulterer i en kollagenopløsning, der ikke vil danne FLS collagen
Af de tre collagen fibril typer, er det nemmeste at gøre SLS collagen. Den tidligste Fremstillingen af SLS er beskrevet af Schmitt og kolleger 15. Vi udgav en tilpasning af denne procedure for 12 år siden for at gøre SLS collagen ved hjælp af kommercielt tilgængelige collagen 14. Fremgangsmåden blot indebar kombinere 2 mg / ml ATP og 0,5 mg / ml collagen monomer i 0,05% (v / v) eddikesyre ved pH 3,5, og lade blandingen ved stuetemperatur natten over.
Det er vores erfaring, er det afgørende aspekt af SLS samling, der skal kontrolleres pH af reaktionsopløsningen. SLS samlet i mere grundlæggende betingelser (~ pH 3,6-3,9) resulterer i aggregerede klumper af krystalliter. Flere sure betingelser (~ pH 2,9-3,2) resulterer i tyndere, mere adskilte krystalitter end dem samlet under de ideelle betingelser for pH 3,3-3,5. Reaktions pH-værdier uden for dette område (<2,8 og> 4) ikke giver nogen SLS collagen. Før i tiden justeret vi den pH af reaktionsblandingen ved tilsætning af eddikesyre. At forenkle proceduren yderligere, i dette manuskript introducerede vi en glycin-HCI-buffer for at regulere pH.
De tre forskellige collagen strukturer dannet af protokollerne der er beskrevet ovenfor, har karaktermer inden funktioner, som kun kan skelnes ved instrumenter, som kan nanometer opløsning. Native og FLS collagen er kendetegnet ved banding perioder på ~ 67 nm og ~ 270 nm. Den længste dimension af SLS collagen er blot ~ 360 nm. Vi har beskrevet specifikt, hvordan vi bruger en AFM til at karakterisere de tre forskellige kollagen strukturer. Imidlertid bør ethvert AFM, der har kontakt eller intermitterende kontakt tilstand med en AFM probe, der har <10 nm radius også kunne billedet disse collagen strukturer. Desuden kan elektronmikroskopi være og er blevet anvendt til at karakterisere disse kollagen strukturer 19.
Den største fordel ved disse fremgangsmåder er, at de først og fremmest producerer det ønskede kollagenkonstruktion. Den eneste anden form for kollagen, som findes i disse reaktioner, er udgangsmonomeren, som ofte ses i baggrunden af AFM-billeder. I tilfælde af native og FLS collagen, kan de let separeres fra det meste af unreaCTED monomer ved gentagen centrifugering og vaskning af den resulterende nativt eller FLS collagen pellet med vand.
Vi har præsenteret simple og pålidelige procedurer for at gøre indfødte, FLS og SLS kollagen ved hjælp af avancerede, kommercielt tilgængelige udgangsmaterialer. Collagenet monomer, der anvendes i alle disse procedurer er kommercielt tilgængelig i en oprenset form. α1-syreglycoprotein og ATP er også begge kommercielt tilgængelige.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke alle de mange tidligere bachelor-, kandidat-og ph.d.-studerende, der har bidraget deres tid og kræfter til studiet af kollagen fibrogenese i vores laboratorium. The Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada har løbende ydet støtte til vores collagen undersøgelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
| ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
| α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
| a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
| mica | Ted Pella | 53 | |
| Pointprobe - Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
| Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |
References
- Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. Collagen at a glance. J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).
- Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. Guide to Collagen Characterization for Bio Studies. J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).
- Baselt, D. R., Revel, J. -P., Baldeschwieler, J. D. Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy. Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).
- Petruska, J. A., Hodge, A. J. A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).
- Smith, J. W. Molecular Pattern in Native Collagen. Nature. 219, 157-158 (1968).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions. PNAS. 41, 1-7 (1955).
- Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy. Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).
- Wood, G. C., Keech, M. K. The formation of fibrils from collagen solutions. Biochem. J. 75, 588-597 (1960).
- Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen Fibril formation. J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).
- Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure. Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).
- Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).
- Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study. PNAS. 37, 286-291 (1951).
- Ghadially, F. N. Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , 3rd Edition, Butterworths. London. (1988).
- Paige, M. F., Goh, M. C. Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy. Micron. 74, 355-361 (2001).
- Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. A new particle type in certain connective tissue extracts. PNAS. 39, 459-470 (1953).
- Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis. PNAS. 76, 313-317 (1979).
- Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts. JACS. 72, 3321-3322 (1950).
- Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. O prokollagene kohzi. Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).
- Lin, A. C., Goh, M. C. Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy. Proteins. 49, 378-384 (2002).
