Summary
ACF chromatin remodeling E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु के कारक का योगदान मापा गया था. प्रोटोकॉल सेल क्लोनों में डॉक्सीसाइक्लिन उपचार ACF सब यूनिटों Acf1 और SNF2h सशर्त पछाड़ना लाती का चयन भी शामिल है, और DAPI परख का उपयोग inducible सेल लाइनों में E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु को मापने.
Abstract
स्तनधारी कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के कार्यात्मक निष्क्रियता विभिन्न रास्ते 1,2 के लिए ब्याज की एक प्रोटीन के योगदान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, जीन अभिव्यक्ति की सशर्त पछाड़ना मामलों में आवश्यक है जब विधान पछाड़ना कोशिकाओं द्वारा 3-5 समय की एक लंबी अवधि के लिए बर्दाश्त नहीं किया है. यहाँ हम सेल लाइनों ACF chromatin remodeling कारक के सब यूनिटों की सशर्त पछाड़ना की अनुमति की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. ये सेल लाइनों adenovirus E4orf4 6 प्रोटीन कोशिका मृत्यु का प्रेरण ACF के योगदान के निर्धारण की सुविधा. ACF chromatin remodeling कारक के Acf1 और SNF2h सब यूनिटों के लिए छोटे बाल के लिये कांटा RNAs एन्कोडिंग दृश्यों प्लाज्मिड भी Neomycin प्रतिरोध जीन के लिए एक जीन युक्त में एक प्रमोटर डॉक्सीसाइक्लिन-inducible अगले क्लोन किया गया. Neomycin प्रतिरोधी सेल क्लोनों G418 और पृथक की उपस्थिति में चयन किया गया था. परिणामस्वरूप सेल लाइनों से प्रेरित थेडॉक्सीसाइक्लिन उपचार Acf1 एक बार या SNF2h अभिव्यक्ति का स्तर कम हो गई थी, कोशिकाओं एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग E4orf4 या एक खाली वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट रहे थे. ShRNA constructs का विशेष प्रभाव की पुष्टि है, Acf1 या SNF2h प्रोटीन का स्तर cotransfection द्वारा एक प्लाज्मिड व्यक्त Acf1 या SNF2h जो shRNA मूक म्यूटेशनों की शुरूआत करने के लिए प्रतिरोधी द्वारा गाया गया था के साथ WT स्तर के लिए बहाल कर दिया गया. E4orf4 की क्षमता विभिन्न नमूनों में कोशिका मृत्यु को उत्पन्न एक DAPI परख, जिसमें ट्रांसफ़ेक्ट सेल आबादी में apoptotic morphologies के साथ नाभिक की उपस्थिति की आवृत्ति 7-9 मापा गया था द्वारा निर्धारित किया गया था.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न प्रोटीन के कार्यात्मक योगदान के मामलों में अपने भागीदारों द्वारा प्रोटीन कोशिका मृत्यु के शामिल होने के लिए दृढ़ संकल्प के लिए उपयोग किया जा सकता है जब विधान पछाड़ना सेल घातक हो सकता है.
Protocol
1. Inducible सेल लाइन्स की पीढ़ी
- पहले प्रयोग एक दवा G418 के न्यूनतम एकाग्रता जो सभी वांछित सेल लाइनों की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं को मारता है खोजने की जरूरत है. इस प्रयोजन के लिए, 70% मध्यम है कि प्रयोग के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा और G418 की बढ़ती सांद्रता (मिलीग्राम प्रति 0-1,000 ग्राम) जोड़ने में confluency में कई डुप्लिकेट प्लेटों में पसंद की कोशिकाओं की थाली. मॉनिटर न्यूनतम G418 एकाग्रता है कि कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक मारता निर्धारित दैनिक कोशिकाओं. कोशिका मृत्यु 3-7 दिनों के भीतर मनाया जाता है.
- पिछले सेल लाइनों की पीढ़ी यह क्षणिक अभिकर्मक assays द्वारा सत्यापित करें कि shRNA व्यक्त प्लाज्मिड अध्ययन के तहत जीन की कुछ हद तक अभिव्यक्ति को कम कर सकते हैं के लिए सिफारिश की है. यह किसी भी सेल लाइन है कि कुशलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है में किया जा सकता है.
- DMEM मध्यम (10% Tet sy युक्त 8 मिलीलीटर में प्लेट टी - रेक्स 293 10 सेमी प्रति प्लेट 5x10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओंस्टेम मंजूरी दे दी FBS, एल glutamine 2mm, मिलीलीटर पेनिसिलिन प्रति 100 इकाइयों और मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रति 0.1 मिलीग्राम, मिलीलीटर blasticidin प्रति 5 ग्राम). 37 पर रात भर प्लेटें सेते ° सी, 5% सीओ 2.
- अगले दिन, 8 मिलीलीटर ताजा अभिकर्मक करने से पहले मध्यम मध्यम बदल जाते हैं.
- कोशिकाओं transfect pSuperior.neo + GFP प्लाज्मिड (1 चित्रा) एन्कोडिंग Acf1 या SNF2h shRNA एक H1 टेट्रासाइक्लिन-inducible प्रमोटर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Neomycin प्रतिरोध जीन GFP से इनकार और एक विधान PGK प्रमोटर द्वारा संचालित द्वारा संचालित की 10 ग्राम का उपयोग कर. 150 NaCl मिमी की 500 μl डीएनए जोड़ें. 150 मिमी NaCl के 500 μl के ग्राम डीएनए प्रति 2 μl में एक और अशेष भाजक jetPIE अभिकर्मक जोड़ें. जोड़ें डीएनए को jetPIE समाधान और vortexing द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. धीरे 10 सेमी 70-80% सहधारा कोशिकाओं युक्त प्लेटों पर डीएनए परिसरों विंदुक. इनक्यूबेटर में प्लेटें लौटें.
- अगले दिन एक चयनात्मक मध्यम के साथ की जगह मध्यम (DMEM मध्यममिलीलीटर G418 प्रति एक अतिरिक्त 500 ग्राम युक्त ऊपर वर्णित).
- अगले दो सप्ताह के कोशिकाओं पर नज़र रखते हैं और एक समान ताजा मध्यम के साथ हर 3-4 दिनों तक चयनात्मक माध्यम की जगह कालोनियों दिखाई देते हैं और एक माइक्रोस्कोप के बिना कल्पना की जा सकती है.
- कालोनियों के अलगाव से पहले, चयनात्मक मध्यम के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें तैयार.
- आंख से कालोनियों को पहचानें, और एक रंग मार्कर का उपयोग करते हुए प्लेट के नीचे में अपने स्थान को चिह्नित. खुर्दबीन है कि कालोनियों अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं के तहत सत्यापित करें.
- बाँझ हुड में, थाली से मध्यम aspirate,, धीरे गर्म पीबीएस के साथ कुल्ला और अच्छी तरह से सभी शेष तरल aspirate. Trypsin / EDTA प्लेट पर एक कॉलोनी 0.25% की 3 μl जोड़ें. बार बार trypsin विंदुक जब तक कोशिकाओं को अलग कर एक 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं के लिए उन्हें जोड़ने. थाली पर कई अन्य कालोनियों के लिए इस दोहराएँ.
- 37 में कोशिकाओं को विकसित ° सी, 5% 2 सीओ, जब तक वे अच्छी तरह से भरने के लिए. तब से निकाली गई कोशिकाओं को विभाजितप्रत्येक तीन कुओं, एक अलग 12-अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक, और रातोंरात सेते हैं में मूल कालोनियों की.
- अगले दिन, एक थाली में एक स्टॉक डबल आसुत जल (1-5 मिलीग्राम प्रति मिलीग्राम) में तैयार समाधान से मिलीलीटर डॉक्सीसाइक्लिन प्रति 1 ग्राम युक्त मध्यम से मध्यम की जगह. डॉक्सीसाइक्लिन बिना मध्यम के साथ एक नियंत्रण की थाली में मध्यम बदलें. 37 में 72 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते ° सी, 5% सीओ 2.
- एक इलाज और एक प्रोटीन के अर्क और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की क्षमता का निर्धारण Acf1 या SNF2h पछाड़ना की तैयारी के लिए प्रत्येक कोशिका क्लोन के इलाज अच्छी तरह से हार्वेस्ट कोशिकाओं. से Acf1 या SNF2h के लिए एंटीबॉडी रूप में अल्फा ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल, एक लोडिंग पर नियंत्रण के रूप में सेवारत है. 3 में कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रयोग करें, इलाज चयनित सेल क्लोनों में डॉक्सीसाइक्लिन अलावा अध्ययन के तहत प्रोटीन के स्तर में कम से कम 50% की कमी करने के लिए नेतृत्व के विस्तार के लिए छोड़ दिया है. 90% FBS, आगे उपयोग के लिए 10% DMSO में इन कोशिकाओं की aliquots रुक.
- प्लेट 10 सेमी प्लेटों में चयनात्मक मध्यम में कोशिकाओं. 1 मिलीग्राम प्रति ग्राम पर डॉक्सीसाइक्लिन 1/2 प्लेटों को जोड़ें और 37 पर सेते हैं डिग्री सेल्सियस, 48-72 घंटा (4 चित्र देखें) के लिए 5% सीओ 2.
- 48-72 घंटे के बाद, कोशिकाओं में से प्रत्येक समूह से कोशिकाओं trypsinize, उन्हें गिनती, और थाली 1.5x10 ही माध्यम में 6 सेमी प्रति प्लेट 6 सेल, डॉक्सीसाइक्लिन के साथ या बिना. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ रातोंरात 2 कोशिकाओं सेते हैं. योजना इतना है कि 2.1 अनुभाग से प्लेटों के प्रत्येक समूह बारह प्रत्येक बिंदु के लिए DAPI परख के लिए दो डुप्लिकेट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए एक प्लेट (4 चित्र देखें) सहित 6 सेमी प्लेटें, के लिए कोशिकाओं को प्रदान करेगा.
- एक खाली प्लाज्मिड के 1 ग्राम या प्लाज्मिड एन्कोडिंग E4orf4 की एक समान मात्रा में, एक साथ एक वेक्टर के 4 ग्राम के साथ: plasmids के निम्नलिखित संयोजन के साथ अगले दिन 6 सेमी प्लेटों में कोशिकाओं transfectAcf1 GFP या SNF2h - GFP व्यक्त मूक परिवर्तन, या इसी खाली वेक्टर और 1 ग्राम प्लाज्मिड व्यक्त GFP (4 चित्रा) की 3 ग्राम के लागू होने से सेल क्लोनों में shRNA प्रतिरोधी गाया. अभिकर्मक मिश्रण तैयार करने के लिए jetPIE अभिकर्मक के रूप में ऊपर वर्णित (5 ग्राम डीएनए प्रति 10 μl) का प्रयोग करें. प्रत्येक नमूने के लिए, तीन प्लेटों के लिए एक अभिकर्मक मिश्रण तैयार करते हैं.
- डीएनए के कमरे के तापमान पर jetPIE अभिकर्मक के साथ एक 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, धीरे से तीन 6 सेमी प्लेटों पर प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण से डीएनए परिसरों के बराबर मात्रा और विंदुक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ रातोंरात 2 पर सेते हैं.
3. ट्रांसफ़ेक्ट सेल में DAPI परख
- अगले दिन, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए नमूना प्रति एक थाली से प्रोटीन निकालने के निर्धारित करने के लिए कि Acf1 SNF2h या कुशलता से किया गया है नीचे गिरा दिया और कहा कि E4orf4 विभिन्न नमूनों में समान रूप से व्यक्त की गई थी.
- DAPI के लिए इरादा प्लेटों से मध्यम Aspirateपरख, प्लेटें धीरे पीबीएस के साथ धोने 4% paraformaldehyde पीबीएस में तैयार करने के लिए कोशिकाओं को कवर के 1 मिलीलीटर जोड़ें. Paraformaldehyde समाधान और इस रसायन के साथ कोशिकाओं के उपचार की तैयारी एक रासायनिक हुड में बाहर किया जाना चाहिए. हिल के बिना कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- Paraformaldehyde Aspirate और पीबीएस के साथ तीन बार धो, हर बार 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कमाल. 80% -20 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते में कम से कम 1 घंटे के लिए रखा इथेनॉल जोड़ें. प्लेटों -20 डिग्री सेल्सियस में इथेनॉल के तहत कई दिनों के लिए लंबे समय के रूप में वे अच्छी तरह से सील कर रहे हैं इथेनॉल वाष्पीकरण और सुखाने को रोकने के रूप में रखा जा सकता है.
- इथेनॉल Aspirate और कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धो और एक बार पीबीएस बीटी (पीबीएस युक्त 0.5% BSA और 0.05% के बीच-20) के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए हर बार कमाल.
- गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बंधनकारी रोकने के लिए, 1 मिलीलीटर पीबीएस बीटी 20 मिनट के लिए 10% बकरी सीरम युक्त बफर में कोशिकाओं ब्लॉक जबकि कमरे के तापमान पर कमाल. तो टी धो लोपीबीएस बीटी में वह दो बार कोशिकाओं, 5 मिनट प्रत्येक धोने.
- 1 मिलीलीटर पीबीएस बीटी में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं (हमारे मामले में एक एंटीबॉडी विशिष्ट E4orf4) 1 घंटा के लिए, जबकि कमरे के तापमान पर कमाल सेते हैं. तो पीबीएस - बीटी में दो बार धोने और एक बार पीबीएस में 0.1% BSA, 5 मिनट प्रत्येक धोने युक्त.
- PBS 0.1% BSA के 40 मिनट के लिए उपयुक्त माध्यमिक fluorescently लेबल एंटीबॉडी और प्रति मिलीलीटर DAPI के अंतिम एकाग्रता 0.5 ग्राम युक्त जबकि अंधेरे में कमरे के तापमान पर कमाल 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं सेते हैं. फिर 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धोने, आकांक्षा से अच्छी तरह सूखी और प्लेटें पूरा सुखाने को प्राप्त करने के लिए रात भर के लिए एक अतिरिक्त घंटे के लिए उल्टा रखने. तब कोशिकाओं पर कवर स्लाइड, Fluoromount-G समाधान का उपयोग कर माउंट. 4 में प्लेटें रखें सी ° अंधेरे में जब तक apoptotic नाभिक गिनती करने के लिए तैयार है.
- एक सहयोगी से पूछो नए संख्या द्वारा विभिन्न प्लेट की पहचान है, तो विभिन्न नमूनों में apoptotic नाभिक गिनती एक निष्पक्ष तरीके से किया जा सकता है.
- एक यू के तहत कोशिकाओं कल्पना400x (हवा में) या 630X (विसर्जन तेल में) के एक बढ़ाई pright फ्लोरोसेंट खुर्दबीन. जो विभिन्न प्रत्येक नमूने में व्यक्त प्रोटीन के लिए दाग रहे हैं, और गाढ़ा या खंडित ट्रांसफ़ेक्ट सेल आबादी के भीतर DAPI धुंधला हो जाना द्वारा visualized नाभिक की संख्या गिनती ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को पहचानें. कई क्षेत्रों पर नजर रखने और कम से कम 200 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के एक कुल गिनती.
- ट्रांसफ़ेक्ट सेल आबादी के भीतर apoptotic morphology के साथ नाभिक के प्रतिशत की गणना. डुप्लिकेट के साथ प्रयोग, दोहराएँ, 2-3 बार विभिन्न नमूनों के बीच परिवर्तन का सांख्यिकीय महत्व की गणना करने के लिए.
4. प्रतिनिधि परिणाम
कालोनियों प्राप्त करने की दक्षता चर रहा है जो जीन की अभिव्यक्ति में सशर्त पछाड़ना सफल रहा है, शामिल जीन पर निर्भर करता है. हमारे हाथ में है, हम 12 के लिए परीक्षण किया Acf1 और SNF2h के लिए 18 में से 6 के बाहर 7 सफल कालोनियों चित्रा 2 प्राप्त की. शचयनित कक्ष (2A चित्रा) क्लोन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक कॉलोनी (चित्रा 2B) के एक प्रतिनिधि प्लेट ows चित्रा 3 प्रतिनिधि विभिन्न डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति या 72 घंटे के लिए अभाव में हो क्लोन की कोशिकाओं से निकाले प्रोटीन के साथ तैयार धब्बा से पता चलता है. धब्बा SNF2h और अल्फा ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ दाग किया गया था, एक लोडिंग पर नियंत्रण के रूप में सेवारत है. क्लोनों की (संख्या 4 और 5) डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण पर SNF2h स्तर में दो एक मजबूत कमी देखी गई. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि + प्लाज्मिड GFP (1 चित्रा) सेल एक संलयन नव GFP प्रोटीन encodes लाइनों की पीढ़ी के लिए प्रयोग किया जाता है, स्थिर सेल लाइनों में हरी प्रतिदीप्ति बहुत कम था और अन्य GFP संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति pSuperior.neo इन कोशिकाओं में शुरू की transiently आसानी से पृष्ठभूमि हरी प्रतिदीप्ति के ऊपर से पता लगाया जा सकता है.
प्रयोगों की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व सेल क्लोनों में विदेश मंत्रालय के लिए किया जाता हैयकीन है कि Acf1 या E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु पर SNF2h पछाड़ना के प्रभाव छवि में दिखाया गया है. 4. डॉक्सीसाइक्लिन उपचार द्वारा जीन अभिव्यक्ति की पछाड़ना के लिए आवश्यक समय जिसका प्रोटीन का स्तर कम किया जाना चाहिए की स्थिरता पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकती हैं. Acf1 और SNF2h के लिए, एक 72 घंटा उपचार के कुशल पछाड़ना के लिए प्रोटीन के स्तर में आवश्यक था.
चित्रा 5 E4orf4 और GFP व्यक्त और सेल संघनित या खंडित आकारिकी साथ DAPI दाग नाभिक की उपस्थिति के द्वारा प्रकट मौत के दौर से गुजर कोशिकाओं के एक उदाहरण से पता चलता है चित्रा 6 एक प्रतिनिधि प्रदर्शन प्रयोग के परिणामों से पता चलता है कि एक करने के लिए नेतृत्व डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरित Acf1 पछाड़ना है. E4orf4 उत्तेजित कोशिका मृत्यु (6A चित्रा) में वृद्धि हुई है. यह वृद्धि E4orf4 स्तर (चित्रा 6B) में वृद्धि से परिणाम नहीं था. इसके अलावा, स्तर Acf1 डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरित कोशिकाओं को बहाल विषाक्तता E4orf4 में वृद्धि कम हो uninduced कोशिकाओं (6 चित्रा) में मनाया.
चित्रा 1. PSuperior.neo + प्लाज्मिड GFP के मानचित्र. नक्शा टेट्रासाइक्लिन-inducible H1 shRNA अभिव्यक्ति और अभिव्यक्ति एक संलयन नव GFP प्रोटीन की PGK प्रमोटर ड्राइविंग ड्राइविंग प्रमोटर से पता चलता है. नक्शा OligoEngine pSuperior पुस्तिका से अनुकूलित किया गया.
चित्रा 2. एक थाली के Neomycin प्रतिरोधी कालोनियों की पहचान. कालोनियों युक्त (ए) और (बी) एक ही कॉलोनी के दिखाए जाते हैं. कालोनियों संवर्धन द्वारा प्राप्त किया गया एक चयनात्मक Neomycin युक्त मध्यम में 14 दिनों के लिए कोशिकाओं.
चित्रा 3. कई Neomycin की उपस्थिति में चयनित कालोनियों के चयनित कालोनियों में पछाड़ना दक्षता की परीक्षा कक्ष डुप्लिकेट कुओं में चढ़ाया गया. प्रत्येक नमूने की अच्छी तरह से डॉक्सीसाइक्लिन (+) द्वारा प्रेरित किया गया था और एक अच्छी तरह से इलाज छोड़ दिया गया था (-). प्रोटीन 72 घंटा बाद प्रेरण निकाले गए थे और एसडीएस पृष्ठ पर chromatographed. वेस्टर्न ब्लॉट क्रमिक SNF2h और अल्फा ट्यूबिलिन (एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में सेवा) के लिए एंटीबॉडी के साथ सना हुआ था और प्रेरित और नियंत्रण कक्ष में SNF2h स्तर से पता चलता है.
चित्रा 4. योजना एक ठेठ परख पछाड़ना DAPI प्रयोग का प्रयोग लगातार कदम, डॉक्सीसाइक्लिन लिए Acf1 या SNF2h पछाड़ना, एक Acf1 या SNF2h अभिव्यक्ति बहाल करने या एक emp परिचय अभिकर्मक हासिल इलाज सहित दिखाए जाते हैं.ty वेक्टर और E4orf4 या अपनी इसी खाली सदिश कोशिकाओं में शुरू करने के लिए, और परिणामों का विश्लेषण. डॉक्सीसाइक्लिन इलाज प्लेटें लाल रंग में दिखाया जाता है (Dox) और नियंत्रण प्लेटें नीले रंग में चिह्नित कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5. E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु के DAPI परख द्वारा जांच कोशिकाओं जो 4 चित्र में वर्णित विभिन्न उपचार कराना पड़ा और तय E4orf4 विशिष्ट एंटीबॉडी और DAPI साथ दाग थे ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के नाभिक कल्पना. इस विशिष्ट चित्र एक नमूना युक्त E4orf4 और नियंत्रण GFP प्रोटीन से लिया गया था. (ए) GFP. (बी) E4orf4. (सी) DAPI. (डी) विलय छवियों. सफेद तीर निशान GFP और E4orf4 ट्रांसफ़ेक्ट नाभिक apoptotic morphologies साथ युक्त कोशिकाओं. लाल तीरअनियमित आकार जो apoptotic नाभिक के रूप में नहीं गिना जाता है के साथ नाभिक निशान. सितारे निशान mitotic नाभिक या नाभिक कि अभी विभाजित है.
6 चित्रा. पछाड़ना Acf1 E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु को बढ़ाता है (ए) सेल टी - रेक्स 293 व्युत्पन्न प्रमोटर टेट्रासाइक्लिन-inducible से Acf1 shRNA व्यक्त लाइन से कोशिकाएं डॉक्सीसाइक्लिन (Dox +) या अनुपचारित छोड़ दिया (-Dox) के साथ प्रेरित किया गया. तीन दिन बाद, कोशिकाओं plasmids E4orf4 (E4orf4 +) या एक खाली सदिश (-E4orf4) एक खाली वेक्टर या एक व्यक्त प्लाज्मिड GFP टैग Acf1, जो shRNA के लिए प्रतिरोधी चुप की शुरूआत के द्वारा प्रदान की गई थी के साथ साथ व्यक्त करने के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे म्यूटेशनों. कोशिकाओं अभिकर्मक और दाग एंटीबॉडी के साथ E4orf4 के बाद चौबीस घंटे और DAPI साथ तय किया गया. कोशिका मृत्यु का प्रेरण DAPI ऊपर वर्णित परख और प्रतिशत ओ द्वारा मापा गया थासंघनित या खंडित नाभिक के साथ च ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए निर्धारित किया गया था. तीन के साथ एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया replicates, और त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) के समानांतर प्लेटों से कोशिकाओं पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए काटा गया. धब्बा E4orf4, GFP, और Acf1 एंटीबॉडी के साथ सना हुआ था. अंतर्जात Acf1 और Acf1 GFP दो अलग अलग पैनलों में दिखाए जाते हैं.
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Discussion
विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की पछाड़ना विनियामक रास्ते के लिए एक प्रोटीन के योगदान की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है. आवश्यक जीन की अभिव्यक्ति के विधान पछाड़ना नकारात्मक सेल प्रसार को प्रभावित करता है, उनके अध्ययन भी siRNAs के क्षणिक परिचय या स्थिर सशर्त पछाड़ना सिस्टम के आवेदन की आवश्यकता हो सकती है. दवा प्रेरित यहाँ वर्णित shRNAs की अभिव्यक्ति के लिए क्षमता के साथ स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी, क्षणिक transfections जो कई सेल लाइनों में कुशल नहीं हो सकता है पर एक लाभ प्रदान करता है, और दोहराया है कि तैयारी की आवश्यकता होती है वायरस के उपयोग पर और कभी कभी एक अतिरिक्त कम अवधि चयन. सेल लाइनों, एक बार उत्पन्न, अतिरिक्त तैयारी की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, हमारे हाथ में, shRNA constructs के क्षणिक transfections shRNA अभिव्यक्ति की चयनित सेल लाइनों में शामिल के साथ तुलना में कम नीचे जीन अभिव्यक्ति दस्तक में कुशल थे. ऐसा नहीं है की सिफारिशएड लेकिन प्रत्येक प्रयोग में पता लगाने के लिए है कि दवा प्रेरित पछाड़ना कुशल बने रहे. जीन अभिव्यक्ति की सशर्त पछाड़ना के लिए स्थिर सेल लाइनों का उपयोग की एक संभावित नुकसान है कि वे चयन प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त परिवर्तन है कि संभावित प्रयोगों के परिणाम प्रभावित हो सकता प्राप्त हो सकता है. हालांकि, इस समस्या को दूर करने के लिए, एक दो समानांतर सेल लाइनों में प्रयोग ले जा सकता है या प्लाज्मिड के परिचय एक shRNA प्रतिरोधी WT प्रोटीन व्यक्त द्वारा पछाड़ना प्रभाव रिवर्स. यदि WT प्रोटीन shRNA के प्रभाव को समाप्त, तो एक clonal प्रभाव शासन से बाहर किया जा सकता है.
शास्त्रीय, apoptosis कस्पासे निर्भर, कस्पासे सक्रियण, annexin-V धुंधला हो, सुरंग धुंधला हो जाना, FACS, आदि 10 से एक उप G1 सेल की आबादी का पता लगाने का पता लगाने सहित कई तरीके assayed द्वारा किया जा सकता है. हालांकि, E4orf4 कई सेल लाइनों और कई तरीकों में एक गैर शास्त्रीय, सेल कस्पासे स्वतंत्र मौत लातीapoptosis का पता लगाने के लिए सेल 6,7,11,12 मौत की इस अनूठी विधा का पता लगाने के लिए लागू नहीं कर रहे हैं. यह पहले से दिखाया गया है कि सबसे ठेठ morphologies E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु के साथ जुड़े झिल्ली blebbing, परमाणु संक्षेपण या विखंडन, और सेल टुकड़ी 13 शामिल हैं. इसलिए हम आम तौर पर परमाणु संक्षेपण और विखंडन, या सेल नुकसान परख करने की क्रिया द्वारा E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु को मापने.
जब DAPI परख का उपयोग, एक निम्नलिखित बातों को विशेष ध्यान देना चाहिए: 1) परीक्षण के इष्टतम निष्पक्षता बनाए रखने के लिए, यह अत्यधिक की सिफारिश की है इतना है कि परख एक "अंधा फैशन" में प्रदर्शन किया जाएगा कि व्यक्ति जो संख्या की गिनती apoptotic morphologies साथ नाभिक युक्त कोशिकाओं का नमूना पहचान के बारे में पता नहीं होगा. 2) यह करने के लिए कड़े मापदंड बनाए रखने के लिए परमाणु apoptotic morphologies जो mitotic या unev साथ नाभिक नाभिक के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए की पहचान करने के लिए सिफारिश की हैएन morphologies (चित्रा 5 देखें). अतिरिक्त कोशिका मृत्यु assays भी किसी क्लोन से उत्पन्न होने वाला अथवा उससे बना हुआ सेल अस्तित्व assays 8 के रूप में इस तरह के प्रयोग के पढ़ने के लिए बाहर के रूप में नियोजित किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम (भाग में) इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 11/399), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) परियोजना जर्मन - इजरायल सहयोग (डुबकी) के ढांचे के भीतर, और Rappaport परिवार में अनुसंधान के लिए संस्थान द्वारा समर्थित किया गया मेडिकल साइंसेज.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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