ACF chromatin remodeling E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु के कारक का योगदान मापा गया था. प्रोटोकॉल सेल क्लोनों में डॉक्सीसाइक्लिन उपचार ACF सब यूनिटों Acf1 और SNF2h सशर्त पछाड़ना लाती का चयन भी शामिल है, और DAPI परख का उपयोग inducible सेल लाइनों में E4orf4 प्रेरित कोशिका मृत्यु को मापने.
स्तनधारी कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के कार्यात्मक निष्क्रियता विभिन्न रास्ते 1,2 के लिए ब्याज की एक प्रोटीन के योगदान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, जीन अभिव्यक्ति की सशर्त पछाड़ना मामलों में आवश्यक है जब विधान पछाड़ना कोशिकाओं द्वारा 3-5 समय की एक लंबी अवधि के लिए बर्दाश्त नहीं किया है. यहाँ हम सेल लाइनों ACF chromatin remodeling कारक के सब यूनिटों की सशर्त पछाड़ना की अनुमति की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. ये सेल लाइनों adenovirus E4orf4 6 प्रोटीन कोशिका मृत्यु का प्रेरण ACF के योगदान के निर्धारण की सुविधा. ACF chromatin remodeling कारक के Acf1 और SNF2h सब यूनिटों के लिए छोटे बाल के लिये कांटा RNAs एन्कोडिंग दृश्यों प्लाज्मिड भी Neomycin प्रतिरोध जीन के लिए एक जीन युक्त में एक प्रमोटर डॉक्सीसाइक्लिन-inducible अगले क्लोन किया गया. Neomycin प्रतिरोधी सेल क्लोनों G418 और पृथक की उपस्थिति में चयन किया गया था. परिणामस्वरूप सेल लाइनों से प्रेरित थेडॉक्सीसाइक्लिन उपचार Acf1 एक बार या SNF2h अभिव्यक्ति का स्तर कम हो गई थी, कोशिकाओं एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग E4orf4 या एक खाली वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट रहे थे. ShRNA constructs का विशेष प्रभाव की पुष्टि है, Acf1 या SNF2h प्रोटीन का स्तर cotransfection द्वारा एक प्लाज्मिड व्यक्त Acf1 या SNF2h जो shRNA मूक म्यूटेशनों की शुरूआत करने के लिए प्रतिरोधी द्वारा गाया गया था के साथ WT स्तर के लिए बहाल कर दिया गया. E4orf4 की क्षमता विभिन्न नमूनों में कोशिका मृत्यु को उत्पन्न एक DAPI परख, जिसमें ट्रांसफ़ेक्ट सेल आबादी में apoptotic morphologies के साथ नाभिक की उपस्थिति की आवृत्ति 7-9 मापा गया था द्वारा निर्धारित किया गया था.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न प्रोटीन के कार्यात्मक योगदान के मामलों में अपने भागीदारों द्वारा प्रोटीन कोशिका मृत्यु के शामिल होने के लिए दृढ़ संकल्प के लिए उपयोग किया जा सकता है जब विधान पछाड़ना सेल घातक हो सकता है.
विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की पछाड़ना विनियामक रास्ते के लिए एक प्रोटीन के योगदान की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है. आवश्यक जीन की अभिव्यक्ति के विधान पछाड़ना नकारात्मक सेल प्रसार को प्रभावि?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम (भाग में) इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 11/399), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) परियोजना जर्मन – इजरायल सहयोग (डुबकी) के ढांचे के भीतर, और Rappaport परिवार में अनुसंधान के लिए संस्थान द्वारा समर्थित किया गया मेडिकल साइंसेज.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
Pen Strep | Gibco | 15140 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
G418 | Sigma | A1720 | |
blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
doxycycline | Sigma | D9891 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |