E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.
Memeli hücrelerinde gen ekspresyonu Fonksiyonel inaktivasyonu çeşitli yollar 1,2 ilgilendiren bir protein katkı çalışma için çok önemlidir. Kurucu zaman devirme 3-5 uzun bir süre için hücreler tarafından iyi tolere edilmez Bununla birlikte, gen ekspresyonunun şartlı devirme durumlarda gerekir. Burada ACF kromatin remodeling faktör altbirimden koşullu knockdown izin hücre hatlarının hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu hücre hatları adenovirüs E4orf4 proteini tarafından 6 hücre ölümü indüksiyonu için ACF katkısının belirlenmesi kolaylaştırmak. ACF kromatin yeniden faktörü ACF1 ve SNF2h alt birimleri için kısa firkete RNA kodlayan diziler aynı zamanda neomisin direnç geni için bir geni içeren bir plazmid içinde bir doksisiklin-indüklenebilir promotör yanında klonlandı. Neomisin dirençli hücre klonları izole edilmiş ve G418 varlığında seçilmiştir. Sonuçta elde edilen hücre hatları ile uyarıldığındadoksisiklin tedavi, ve bir kez ACF1 SNF2h ya da ekspresyon düzeyleri azalmıştır, hücre bir plazmid kodlama E4orf4 veya boş vektör ile transfekte edildi. ShRNA yapıların belirli etkisini teyit etmek için, ACF1 veya SNF2h protein seviyeleri sessiz mutasyon dahil edilmesi ile shRNA karşı dirençli hale getirildi ifade eden bir plasmidin ACF1 veya SNF2h ile kotransfeksiyonu ile WT düzeylerine geri alındı. Çeşitli örneklerde hücre ölümünü teşvik etmek için E4orf4 yeteneği transfekte edilmiş bir hücre popülasyonunda apoptoz morfolojiye sahip çekirdeklerin görünüm frekans 7-9 ölçüldüğü bir DAPI tahlil ile belirlenmiştir.
Yapıcı devirme hücre öldürücü olabilir burada açıklanan protokol durumlarda bunların protein partnerleri tarafından hücre ölümü indüksiyonu için çeşitli proteinlerin işlevsel katkı belirlenmesi için kullanılabilir.
Belirli gen ekspresyon Nakavt düzenleyici yolaklar bir protein katkısı soruşturma için önemli bir yaklaşımdır. Elzem genlerin ifade bünye knockdown olumsuz hücre çoğalmasını etkiler bu yana, yaptıkları çalışmada geçici siRNA'lar giriş veya sabit koşullu devirme sistemleri uygulama ya gerektirebilir. Burada tarif shRNAs bir ilaca bağlı ifade etme yeteneğine sahip kararlı hücre çizgileri üretimi, bir çok hücre hatları etkili olmayabilir geçici Transfeksiyonlar üzerinde bir avantaj sa…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Alman-İsrail İşbirliği Projesi (DIP) çerçevesinde Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından İsrail Bilim Vakfı (Hibe 399/11), tarafından ve Araştırma Rappaport Aile Enstitüsü tarafından (kısmen) desteklenmiştir Tıp Bilimleri.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
Pen Strep | Gibco | 15140 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
G418 | Sigma | A1720 | |
blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
doxycycline | Sigma | D9891 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |