Summary
E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.
Abstract
포유류의 세포에서 유전자 발현의 기능 불 활성화는 다양한 경로의 1,2의 관심 단백질의 기여에 관한 연구하는데 매우 중요합니다. 제정 최저 시간이 3-5 오랜 기간 동안 세포 용납되지 않은 경우 그러나, 유전자 표현의 조건 최저는 경우에 필요합니다. 여기 ACF 염색질 리모델링 요소의 subunits의 조건 최저를 허용 세포 라인의 준비를위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 세포 라인은 아데노 바이러스 E4orf4 단백질 6 셀 죽음의 유도에 ACF의 노력의 결정을 용이하게합니다. ACF 염색질 리모델링 인자의 Acf1 및 SNF2h subunits에 대한 짧은 머리 핀의 자형 RNAs를 인코딩 순서는 또한 neomycin 내성 유전자에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드의 doxycycline-inducible업자 옆에 복제되었습니다. Neomycin 방지 세포 클론은 G418과 절연의 존재에 선정되었다. 그 결과 세포 라인에 의해 유도 된doxycycline 치료는 한 번 Acf1 또는 SNF2h 표현 수준이 감소되었다 세포는 플라스미드 인코딩 E4orf4하거나 빈 벡터와 transfected했다. shRNA 구조의 특정 효과를 확인하려면 Acf1 또는 SNF2h 단백질 수준은 침묵 변이의 도입에 의해 shRNA에 저항력이 렌더링 된 플라스미드 표현 Acf1 또는 SNF2h과 cotransfection에 의해 WT 수준으로 복원되었습니다. 다양한 샘플에서 세포 죽음을 유도하는 E4orf4의 능력은 transfected 세포 인구의 apoptotic morphologies과 핵의 모양의 빈도가 7-9 측정 된에 DAPI 분석에 의해 산출 된 것입니다.
제정 최저 셀은 치명적 될 때 여기에 설명 된 프로토콜은 경우에 자신의 단백질 파트너가 세포 죽음을 유도하는 여러 단백질의 기능 공헌 결정에 활용 될 수있다.
Protocol
1. Inducible 셀 라인의 생성
- 하나는 원하는 세포 라인의 준비에 사용 된 모든 세포를 죽이는 약물 G418의 최소 농도를 찾을 필요가 실험하기 전에. 이러한 목적을 위해, 실험 기간 동안 사용하고 G418의 증가 농도 (ML 당 0-1,000 μg)을 추가합니다 매체에 confluency 70%에 여러 개의 중복 된 플레이트에 플레이트 선택한 셀을. 효율적으로 세포를 죽이는 최소한의 G418 농도를 결정하는 매일 셀을 모니터링 할 수 있습니다. 세포 죽음이 3-7일에서 관찰된다.
- 이 shRNA을 표현 플라스미드는 연구에 따라 유전자의 어느 정도 표현으로 줄일 수있는 과도 transfection의 assays에 의해 확인하는 것이 좋습니다 세포 라인의 생성하기 전에. 이것은 효율적으로 transfected 수있는 모든 세포주에서 수행 할 수 있습니다.
- DMEM 매체 (10 % Tet 싸이를 포함하는 8 ML의 10cm 접시 당 6 5x10 주변 세포의 밀도 플레이트 T-렉스-293은 세포줄기 승인 FBS, 2mM L-글루타민, ML 페니실린 100 단위 및 ML 스트렙토 마이신 당 0.1 밀리그램, ML blasticidin 당 5 μg). 37 박 번호판을 길러 ° C, 5 % CO 2.
- 다음 날, transfection하기 전에 8 ML 신선한 매체로 매체를 변경합니다.
- 테트라 사이클린-inducible의 H1 프로모터뿐만 아니라, GFP를 융합하고 제정 PGK업자에 의해 구동 neomycin - 저항 유전자에 의해 구동 pSuperior.neo + GFP 플라스미드 (그림 1) 인코딩 Acf1 또는 SNF2h shRNA 10 μg을 사용하여 셀을 Transfect. NaCl 150 MM 500 μl에 DNA를 추가합니다. μg의 DNA 당 2 μl 150 MM NaCl 500 μl의 다른 나누어지는에 jetPIE 시약을 추가합니다. DNA에 jetPIE 솔루션을 추가하고 vortexing하여 잘 섞는다. 실온에서 15 분에 품다. 부드럽게 70-80% 합류 셀을 포함하는 10cm 플레이트에 DNA 단지를 피펫. 보육에 번호판을 반환합니다.
- 다음 날로 (선택적 매체 DMEM 매체를 매체를 대체) ML G418 당 추가 500 μg을 포함하는 위의 설명.
- 다음 두 주 전지를 모니터링하고 식민지가 나타과 현미경없이 시각화 할 수있을 때까지 모든 3~4일 유사한 새로운 매체 선택 매체를 교체하십시오.
- 식민지의 분리에 앞서, 선택적 매체 24 잘 접시를 준비합니다.
- 눈으로 식민지를 식별하고, 색 마커를 사용하여 플레이트의 하단에 자신의 위치를 표시합니다. 식민지 잘 분리되는 현미경으로 확인합니다.
- 멸균 후드에서 부드럽게 따뜻한 PBS로 씻어 잘 남아있는 모든 액체를 대기음, 접시에서 매체를 대기음. 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 판에 하나 식민지로 0.25 %의 3 μl를 추가합니다. 세포 분리하고 24 잘 판에있는 우물 중 하나에 사용자를 추가 할 때까지 반복적으로 트립신을 피펫. 접시에 여러 가지 다른 식민지에 대해이 단계를 반복합니다.
- 37 세포를 성장 ° C, 5 % CO 2 그들은 잘 작성까지. 다음에서 파생 된 세포를 분리세 우물, 별도의 12 잘 플레이트의 각, 그리고 하루 아침에 길러으로 원래 식민지의 각.
- 다음 날 두 번 증류수 (ML 당 1-5 MG)에 준비 재고 솔루션에서 ML doxycycline 당 1 μg을 포함하는 매체와 하나 판에서 매체를 교체하십시오. doxycycline없는 매체가 제어 판에서 매체를 교체하십시오. 37 72 시간에 세포를 배양 ° C, 5 % CO 2.
- 단백질 추출물과 Acf1 또는 SNF2h의 최저의 효율성을 결정하는 서양 얼룩 분석의 준비 각 세포 클론 잘 치료 대우를 하나 하나에서 수확 세포. 로드 제어 역할뿐만 아니라 알파 - Tubulin에 항체와 같은 Acf1 또는 SNF2h에 항체를 사용합니다. 잘 세 번째에있는 세포를 사용하여 doxycycline의 추가는 연구에 따라 단백질의 수준에서 적어도 50 % 감소를 주도하고있는 선택한 셀 클론의 확장을 위해, 치료 떠났다. 자세한 사용 90% FBS, 10 % DMSO에서 이러한 세포의 aliquots을 멈춰 봐.
- 10cm 플레이트의 선택적 중간에 플레이트 세포. 반 접시에 ML 당 1 μg에 doxycycline을 추가하고 37 품다 ° C, 48-72 시간 (그림 4 참조) 5 % CO 2.
- 48-72 시간 후, 세포의 각 그룹에서 세포를 trypsinize을 계산하고, 동일한 매체에서 6cm 판 당 판 1.5x10 6 셀이나 doxycycline없이. 37 ° C, 5 % CO 2 박에서 세포를 배양. 계획이 전혀 섹션 2.1에서 플레이트의 각 그룹은 각 지점에 대한 DAPI 분석을위한 두 중복뿐만 아니라 각 샘플의 서양 얼룩 분석 한 플레이트 (그림 4 참조)를 포함한 열두 6cm 판에 대한 세포를 제공는 않습니다.
- 벡터의 4 μg과 함께, 1 빈 플라스미드의 μg 또는 플라스미드 인코딩 E4orf4의 동일한 수량 : 다음 날 plasmids 다음과 같은 조합 6cm 판에서 셀을 transfectAcf1-GFP 또는 SNF2h-GFP를 표현하는 것은 침묵 돌연변이, 또는 해당 빈 벡터와 1 μg 플라스미드 표현 GFP (그림 4) 3 μg의 도입에 의한 세포 클론의 shRNA에 강한 렌더링. transfection 믹스를 준비 위에서 설명한대로 jetPIE 시약 (5 μg의 DNA 당 10 μl)를 사용합니다. 각 샘플의 경우, 세 접시에 transfection 믹스를 준비합니다.
- 상온에서 jetPIE 시약과 DNA의 15 분 부화 후, 부드럽게 세 6cm 판에 각 transfection 믹스에서 DNA 단지의 동등한 양을 피펫 37 ° C, 5 % CO 2 박에 품다.
3. Transfected 셀에서 DAPI 분석
- 다음 날, Acf1 또는 SNF2h을 효율적으로 쓰러되었는지와 E4orf4이 서로 다른 샘플에서 동일하게 표현 된 것을 확인하기 위해 서양 얼룩 분석을 위해 샘플 당 하나의 접시에서 단백질을 추출합니다.
- DAPI를위한 플레이트에서 미디어를 대기음검정, PBS로 부드럽게 접시를 씻고 세포를 충당하기 위해 PBS에 준비 4 % paraformaldehyde 1 ML를 추가합니다. 이 화학 물질로 세포의 paraformaldehyde 솔루션 및 치료의 준비는 화학 후드에서 수행되어야한다. 흔들림없이 실내 온도에서 15 분에 품다.
- paraformaldehyde를 대기음 5 분마다 동안 실온에서 흔들, PBS로 세 번 씻어. 적어도 1 시간에 -20 ° C에서 -20 ° C 및 배양으로 유지 80 % 에탄올을 추가합니다. 플레이트는 그들이 에탄올 증발과 건조를 방지하기 위해 잘 봉인 된 동안에는 몇 일 동안 -20 ° C에서 에탄올에서 유지 될 수 있습니다.
- 에탄올을 기음과 PBS로 두 번 세포를 씻어 한 번 PBS-BT (PBS는 0.5 % BSA와 0.05 % 십대 초반-20를 포함)와 함께 5 분마다 동안 실온에서 흔들.
- 실온에서 흔들면서 비 특정 항체 바인딩을 방지하기 위해 20 분에 10 % 염소 혈청을 포함하는 1 ML PBS-BT 버퍼에있는 셀을 차단합니다. 그런 t을 씻어PBS-BT에 두 번 그는 세포, 5 분마다 씻으십시오.
- 실온에서 흔들면서 1 시간에 대해 1 ML PBS-BT에서 주 항체와 세포를 (우리의 경우 E4orf4 특정 항체) 품다. 그런 다음 PBS-BT에 두 번 씻어 한 번 PBS에 0.1 % BSA, 5 분마다 세탁을 포함.
- 어둠 속에서 실온에서 흔들면서 40 분에 해당하는 보조 휘황 - 라벨 항체와 DAPI의 ML 최종 농도 당 0.5 μg을 포함하는 PBS-0.1 % BSA의 1 ML에있는 세포를 배양. 그런 다음, 5 분을 위해 PBS로 씻어 흡인하여 잘 건조하고 완전한 건조를 달성 할 밤새에 추가 시간 동안 거꾸로 접시를 유지. 그런 다음 Fluoromount-G 솔루션을 사용하여 셀에 커버 슬라이드를 장착합니다. 4에 접시를 유지 ° C를 어둠 속에서 apoptotic 핵을 계산 할 준비가 될 때까지.
- 편견 방식으로 수행 할 수 있도록 다양한 샘플에 apoptotic 핵을 계산, 새로운 번호로 여러 판을 식별 할 동료에게 물어보십시오.
- U 아래의 세포를 시각화400 배로 확대 (공기) 또는 630X (침지 기름)의 확대에 pright 형광 현미경. 각 샘플로 표현하는 다양한 단백질에 물들와 transfected 세포 인구에서 DAPI의 얼룩으로 시각화 압축 또는 분할 핵의 수를 계산 아르 transfected 세포를 식별합니다. 여러 필드를 모니터링하고 최소한 200 transfected 세포의 총 계산합니다.
- transfected 세포 인구에서 apoptotic 형태로 핵의 비율을 계산합니다. 중복과 실험을 반복, 2 ~ 3 배는 여러 샘플 사이의 변경 사항의 통계적 유의미성을 계산합니다.
4. 대표 결과
유전자 표현의 조건 최저는 성공하는 취득 식민지의 효율성과 관련된 유전자에 따라 변수이다. 우리 손에, 우리는 SNF2h에 대한 Acf1 18 6 아웃에 대한 검사를 12 아웃 7 성공적으로 식민지를 획득하였습니다. 그림 2는 쉬선택한 셀 클론 (그림 2A)뿐만 아니라 하나의 식민지 (그림 2B)의 대표 판을 ows. 그림 3 72 시간에 doxycycline의 유무에서 재배 다양한 클론 세포에서 추출한 단백질로 만든 대표적인 얼룩을 보여줍니다. 얼룩은로드 제어로 제공 SNF2h과 알파 - Tubulin에 항체 물들되었습니다. 클론의 두 (4 번과 5) doxycycline 유도시 SNF2h 수준에서 강력한 감소를 보여 주었다. 그것은 언급되어야 비록 pSuperior.neo 세포 라인 네오 GFP 융합 단백질을 인코딩의 생성에 사용되는 플라스미드 + GFP (그림 1), 안정적인 세포 라인에있는 녹색 형광가 매우 낮은 경우 및 기타 GFP 융합 단백질의 표현 이러한 세포에 transiently 도입 쉽게 배경 녹색 형광 위에 감지 될 수 있습니다.
실험의 개략도는 MEA에 세포 클론에서 수행확인 Acf1 또는 E4orf4 유발 세포 죽음에 SNF2h의 최저의 효과는 그림에 표시됩니다. 4. doxycycline 치료에 의해 유전자 표현의 최저에 필요한 시간은 수준 감소되어야 단백질의 안정성에 따라 다를 수 있습니다. Acf1 및 SNF2h를 들어, 72 시간 치료는 단백질 수준에서 효율적으로 분해가 필요했다.
그림 5는 E4orf4와 GFP를 표현하고 압축 또는 분할 형태로 DAPI-스테인드 핵의 모양으로 나타나신 세포 죽음을 진행하고 세포의 예를 보여줍니다. 그림 6은 doxycycline 유발 Acf1 최저는으로 이어 것을 보여주는 대표적인 실험의 결과를 보여줍니다 E4orf4 - 자극 세포 사망 (그림 6A)에 향상시킬 수 있습니다. 이 증가 E4orf4 수준 (그림 6B)의 증가에서 발생하지 않았다. 또한, doxycycline 유발 세포에 Acf1의 복원 수준으로 E4orf4 독성의 증가를 감소 uninduced 세포 (그림 6)에서 관찰.
1 그림. 플라스미드 pSuperior.neo + GFP의지도.지도는 shRNA의 발현과 네오 GFP 융합 단백질의 PGK업자 운전 식을 운전 테트라 사이클린-inducible의 H1업자를 보여줍니다. 지도는 OligoEngine pSuperior 설명서에서 적응되었습니다.
그림 2. 접시의 neomycin 방지 식민지의 식별. 이미지는 식민지 (A)를 포함하고 단일 식민지의 (B) 표시됩니다. 식민지는 neomycin를 포함하는 선택적 매체에 배양하여 14 일 동안 세포를 취득했다.
그림 3. neomycin의 존재에서 선택한 여러 식민지의 선택 식민지의 최저 효율의 시험. 셀 중복 우물에 도금되었습니다. 각 샘플 잘 하나 doxycycline (+)에 의해 유도 된 하나는 잘 치료 남은 (-). 단백질은 72 시간 게시물 유도를 추출하여 SDS-PAGE에 chromatographed했다. 서양 얼룩은 SNF2h과 알파 - Tubulin (로드 관리 역할)에 대한 항체를 연속 물들과 유도 및 제어 셀에 SNF2h 수준을 보여줍니다되었습니다.
4 그림. 전형적인 최저 - DAPI 분석 실험을 계획. 실험의 연속 단계 Acf1 또는 SNF2h의 최저, Acf1 또는 SNF2h 표현을 복원하거나 EMP를 소개 transfection를 달성하기 doxycycline 치료를 포함하여 표시됩니다타이 벡터가와 세포로 E4orf4 또는 해당 빈 벡터를 소개하고, 결과를 분석합니다. Doxycycline - 처리 플레이트는 빨간색으로 표시됩니다 (Dox) 및 제어 플레이트는 파란색으로 표시됩니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 그림 4에 설명 된 다양한 트리트먼트를 받았습니다 DAPI 분석하여 E4orf4 유발 세포 죽음을 감지. 세포는 고정와 transfected 세포의 핵을 시각화하는 E4orf4 특정 항체와 DAPI 물들했다. 특정 그림은 샘플이 포함 E4orf4 및 제어 GFP 단백질에서 촬영되었다. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) 병합 이미지. 흰색 화살표 마르크 GFP 및 apoptotic morphologies과 핵을 포함하는 E4orf4 - transfected 세포. 빨간색 화살표apoptotic 핵으로 계산되지 않습니다 불규칙한 모양과 핵을 표시합니다. 단지 구분이 별표 마크 mitotic의 핵 또는 핵.
6 그림. Acf1 최저는 E4orf4 유발 세포 죽음을 향상시킵니다. (A) 테트라 사이클린-inducible 프로모터에서 Acf1-shRNA을 표현 T-렉스-293-파생 세포주에서 세포가 doxycycline (+ Dox) 또는 왼쪽 치료 (-Dox)로 유도했다. 3 일 후 세포가 plasmids은 침묵의 도입에 의해 shRNA에 저항력이 렌더링 된 빈 벡터 또는 GFP 태그 표현 플라스미드 Acf1, 함께 E4orf4 (+ E4orf4) 또는 빈 벡터 (-E4orf4)를 표현과 transfected되었습니다 변이. 세포는 이십사시간 E4orf4에 항체가있는 transfection과 스테인드 후에 DAPI로 수정되었습니다. 세포 죽음을 유도는 위에 설명 된 DAPI 분석 및 비율 O에 의해 측정 된압축 또는 분할 핵으로 F transfected 세포가 결정되었습니다. 쓰리와 대표 실험 표시되어 복제 및 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (B) 병렬 플레이트의 세포는 서양 얼룩 분석에 수확되었다. 얼룩은 E4orf4, GFP 및 Acf1에 항체 물들되었습니다. 내생 Acf1 및 Acf1-GFP는 두 별도의 패널에 표시됩니다.
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Discussion
특정 유전자 표현의 최저는 규제 경로로 단백질의 기여의 조사에 중요한 접근 방식이다. 필수 유전자의 표현의 제정 최저 부정적인 세포 증식에 영향을 미치는 때문에, 그들의 연구는 과도 siRNAs의 도입이나 안정적인 조건 최저 시스템의 응용 프로그램 중 하나를 필요로 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 shRNAs의 약물 유발 표현을 수용 할 수있는 안정적인 세포 라인의 생성, 많은 세포 라인에 효율적으로되지 않을 수 있습니다 과도 transfections 이상의 이점을 제공하며, 반복 준비를 필요로 바이러스의 사용에 때때로 추가 단기 용어 선택합니다. 한 번 생성 된 세포 라인, 추가 준비가 필요하지 않습니다. 또한, 우리 손에, shRNA 구조의 과도 transfections은 선택된 셀 라인에 shRNA 식의 유도에 비해 훨씬 효율적인 유전자 발현를 쓰러 뜨린에 있었다. 이 추천입니다에드 그러나 약물 유발 최저 효율적 남아 각 실험에서 확인할 수 있습니다. 유전자 표현의 조건 최저위한 안정적인 세포 라인의 사용 가능성 단점은 사람들이 잠재적 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 선택 과정에서 추가 변경을 획득 할 수 있다는 것입니다. 그러나,이 문제를 극복하기 위해, 하나는 두 개의 평행 한 세포 라인에서 실험을 수행하거나 shRNA 방지 WT 단백질을 표현 플라스미드 도입하여 최저의 효과를 반대로 할 수 있습니다. WT 단백질이 shRNA의 효과를 제거한다면, clonal 효과를 배제 할 수 있습니다.
클래식, caspase-의존 apoptosis는 caspase 활성화, annexin-V의 착색, 터널 착색, FACS 등 (10)에 의해 하위 G1 세포 인구의 검출의 검출 등 다양한 방법에 의해 assayed 할 수 있습니다. 그러나 E4orf4는 많은 세포 라인과 여러 가지 방법에 비 클래식, caspase 독립적 인 세포 죽음을 유도apoptosis 검색에 대한 세포 사망 6,7,11,12의 독특한 모드 감지를위한 적용되지 않습니다. 그것은 이전에 E4orf4 유발 세포 죽음과 관련된 가장 일반적인 morphologies이 막 blebbing, 핵 응축 또는 조각하고, 세포 손상이 13 포함 보여왔다. 따라서 우리는 일반적으로 핵 응축 및 조각, 또는 셀 손실을 시금하여 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정합니다.
DAPI 분석을 이용하면, 하나가 다음 사항에 특별한주의를 지불해야합니다 : 시험의 최적의 객관성을 유지하기 위해 1), 그것은 매우 때문에 검정이 "맹인 패션"에 수행 될 것을 권장합니다 그 수를 계산하는 사람 apoptotic morphologies과 핵을 포함하는 세포의 샘플의 정체성 인식되지 않습니다. 2) 그것은 unev와 mitotic의 핵 또는 핵과 혼동하지 말아야 핵 apoptotic morphologies을 식별 할 엄격한 기준을 유지하는 것이 좋습니다실내 morphologies (그림 5 참조). 추가 셀 사망 assays는 또한 clonogenic 세포 생존 assays 8과 같은 실험의 읽기 아웃으로 고용 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 - 이스라엘 프로젝트 협력 (DIP)의 틀 내에서 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 이스라엘 과학 재단 (기금 11분의 399), 의해에서 연구 Rappaport 가족 연구소 (일부) 지원이 의료 과학.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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