Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve doi: 10.3791/4451 Published: January 11, 2013

Summary

Doğrudan intrahippocampal mikroenjeksiyon ile hipokampal bağımlı uzaysal çalışma belleği Modülasyon, eşlik ve takip

Abstract

Glikoz metabolizması gibi 2-deoksiglukoz ve fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme gibi yöntemler temelini oluşturan, yerel sinirsel aktivite için kullanışlı bir belirteçtir. Bununla birlikte, hayvan modellerinde bu gibi yöntemlerin kullanımı anestezi gerektirir ve dolayısıyla her iki beyin durum değiştirir ve davranışsal önlemler önler. Alternatif bir yöntem, uyanık, serbest hayvanlarda glikoz, laktat ve ilgili metabolitlerin beyin hücre dışı sıvı konsantrasyonunun sürekli ölçülmesi almak üzere in vivo mikrodiyaliz olarak kullanılmasıdır. Spesifik beyin bölgelerinin ve / veya akut farmakolojik manipülasyon güvenmek için tasarlanmıştır görevleri ile kombine edildiğinde Bu teknik özellikle yararlıdır, örneğin, bir mekansal çalışan bellek görevi (spontan ardalanması) sırasında hipokampal ölçümler laktat ekstrasellüler glukoz ve yükselişi bir dalış göstermek gelişmiş glikoliz 1,2 ve intrahippocampal insülin uygulamasının düşündüren hafızayı geliştirir ve hipokampal glikol artırır hemYsis 3. Insülin gibi maddeler metabolitleri ölçmek için kullanılan aynı mikrodiyaliz prob ile hipokampus teslim edilebilir. Hipokampal fonksiyonun bir ölçümü olarak spontan arda kullanım görev performansını ve metabolizmasını değiştirmek her ikisi de bütün bunlar stresli motivasyon (örneğin, ayak şoku), kısıtlama, veya ödülleri (örneğin, yiyecek), herhangi bir karıştırmak önlemek için tasarlanmıştır, bu görev, ayrıca bir sağlar tedavinin nonspesifik etkileri kontrolüne izin motor aktivite ölçer. Kombine, bu yöntemler davranışlarını düzenleyen nörokimyasal ve metabolik değişkenler doğrudan ölçüm izin verir.

Protocol

1. Cerrahi Hazırlık

  1. Elleçleme. Hayvanlar (anestezi için örneğin en sık, sıçan ve farelerin, davranış testi ile mikrodiyaliz ve kombinasyon yöntemini büyük ölçüde ihtiyaç duyulan gerekli türe özgü uyarlamalar ile genel bir biri olmasına rağmen,) en az 10 dk / gün en az işlenir ameliyat öncesinde iki gün. Geniş muhtemel taşıma karıştırmak 2,4,5 kaçınarak, test sırasında bir stressiz durumda hayvanların bırakmak için gösterilmiştir. Biz bir örnek tür olarak bu protokol boyunca sıçanlara kullanacaktır. Bu iyi tesisin veteriner ve işçi sağlığı yetkilileri ile istişare içinde, çıplak elleriyle kullanarak elde edilebilir: Elleçleme örneğin lateks veya nitril eldivenleri kürk çekerek neden stres olmadan yapılmalıdır. Bu mümkün değilse, yumuşak pamuklu eldivenler farelerin kürk çekerek önlemek için bariyer eldivenler üzerinde giyilmelidir.
  2. Steril Alan Hazırlama. Önceki cerrahi başlayan surgic içinal alan sıçan vücut ısısını korumak için kullanılan bir ısıtma pedi kapsayan, stereotaksik alet ve alet karşısına yerleştirilmiş bir steril örtü etrafında hazırlanan steril bir alan hazırlanır. Doğru termostat içeren bir dolaşan sıcak su ped hayvan aşırı ısınmasını önlemek için kullanılır.
  3. Anestezi indüksiyonu. Izofluran buharlaştırıcı izofluran optimal düzeyde içeren kontrol ve indüksiyon odasına bağlanır. Bağlantıları bir kapalı döngü onaylamak için kontrol edilir. Hava işleme vakum sistemi faaliyete geçmesi için kontrol edilir. İzofluran buharlaşma açık ve hayvan oksijen karışımı% 5 izofluran kullanarak indüksiyon odasına yerleştirilir:, izofluran% 5% 100 oksijen akışına eklenir ve indüksiyon odasına teslim olduğunu.
  4. Cihazın içine yerleştirme. Hayvanlar earbars ve diş çubuğunu kullanarak stereotaksik aparat güvence altındadır. Doğru earbar yerleştirme hareketsiz bir kafa sonuçları ve earbars boyunca düz yalan kulaklar. Hayvanlarhızla güvenli ve burun bir amaçla tasarlanmış anestezik roket ucu konisi içine yerleştirilir; buharlaşmış izofluran teslim indüksiyon odasından roket ucu konisi giden oksijen akışına izofluran% 2-3 sunmak için ayarlanır roket ucu konisi ve anestezik karışımı geçer.
  5. Anestezi Onay. Bir cerrahi anestezik uçağı ayak ve göz bir hava solumak için zor bir tutam sunarak teyit edilir; ne herhangi bir tepki neden olmalıdır. Bu testler bir cerrahi anestezi uçağın bakım onaylamak için ameliyat boyunca yaklaşık 15 dakika aralıklarla tekrarlanır. Saç steril alana girmeden önce kesi siteden kaldırılır.

2. Cerrahlık

  1. Hayvan ilk tedavi. Oftalmik merhem kurumasını önlemek için her bir gözün uygulanır. 1 ml steril tuzlu su ameliyat sırasında herhangi bir su kaybını önlemek için sc verilir ve vücut steril bir örtü ile kaplıdır. Betadine saç derisine uygulanır ve merkezden sürülürüzerinden bir pamuklu çubuk ile;% 70 etanol benzer sürülür ve iki svapları adımları uygun bir insizyon sağlamak için iki kez daha tekrarlanır. Betadin ve alkol Ciltle temas süresi kesi önce en az 3 dakika olmalıdır. Anestezi ameliyat boyunca korunur ve düzenli olarak kontrol edilir; carprofen 5 g / kg) tek bir sc enjeksiyonu analjezi başlatmak için verilir ve aseptik teknik kullanılır. Analjezi enjeksiyon herhangi bir stres azaltmak için anestezi indüksiyonundan sonra verilir.
  2. İnsizyon ve kafatası hazırlanması. Bir 3-4 cm kesim kafatasının merkezinde sagitally yapılır. Bupivicaine 1:1 oranındaki karışımı: epinefrin daha analjezi sağlamak ve kanamayı en aza indirmek için topikal uygulanır. Kafa derisi cerrahi klipler ve steril pamuklu çubuklar kafatası örten membranlar kaldırmak için kullanılan kullanarak kesi uzak tutulur. Delme için Koordinatlar bir referans noktası olarak bregma kullanılarak ölçülür, steril bir matkap ucu (veya alternatif olarak, bir el koter devi kullanılarak işaretlenmişce), ve sondaj başlamadan önce doğruluk için yeniden doğruladı. Ilgi (örneğin burada hipokampus) belirli beyin bölgeleri için Koordinatlar bir beyin atlası kullanılarak belirlenmiştir. Hipokampal mikrodiyaliz, biz bregma posterior 5.6 mm, +5.0 yanal ve dura 3,0 ventral bir matkap sitesini kullanabilirsiniz.
  3. Sondaj. Üç delik dura ve altta yatan zarlarında travma az veya yok olduğu gibi sadece asgari kuvvet uygulamamaya halledilir sahip, kafatası yoluyla delinir. Bir delik kanül takılması ile ölçülen yer alır; diğer iki kafatası vida yerleştirilmesi için uygun bir şekilde konumlandırılır. Amaç boyutlu vidalar (örneğin 1.17 mm adımlı cıvatalar; Güzel Bilim Araçları) beynin altında etkilemeden bu deliklere yerleştirilir ve sonraki diş çimento uygulama için çapa noktaları olarak kullanılabilir.
  4. Kanül yerleştirme ve kapatma. Kanül delik delinmiş yerinde olmayı yeniden teyit edilir ekleme koordinatları, konumlandırılırve daha sonra yavaş yavaş hedef derinliği için azaltılır. Bir kez doğru konumlandırılmış, kanül diş çimento ile yerine sabitlenir. Gerekirse, tek bir steril cerrahi dikiş yara kapatmak için kullanılır. Bir keski açıklığını korumak için kanül yerleştirilir. Bu protokol bir CMA12 prob ve kılavuz kanül (CMA / mikrodivaliz) kullanın.
  5. Akut ameliyat sonrası bakım. 3 ml steril tuzlu su hidrasyon devam sc verilir, carprofen 5 g / kg 'lık tek bir sc enjeksiyonu) de analjezi başlatmak için verilmiştir. Tam anestezi ile elde edilirler kadar Hayvanlar alet çıkarılır ve bir ısıtılmış iyileşme odaya yerleştirildi, temiz bir kafes içinde, ve takip edilir. Tam kurtarma refleksi ve normal hareket düzeltilmesi restorasyonu tarafından değerlendirilir. Hayvanlar daha sonra evlerine kafes ve düzenli tutma odasına döndürülür.
  6. Kısa vadeli takip bakımı. Cerrahisi geçirmiş hayvanların Kafesleri ameliyat tarihi ile işaretlenmiştir. Hayvanlar, en azından Thr için en az bir kez her gün izleniree gün ameliyat sonrası ve cerrahi ve aşağıdaki iki gün sonra her gün bir carprofen çiğneme tableti (2 mg) verilir. Hayvanlar carprofen tüketmek istemiyorsanız, enjektabl carprofen yeterli analjezi sağlamak için verilebilir. Hayvanın genel sağlık ve kurumsal hayvan bakım yönergelerine ve gerekirse hayvan bakım personeli veya veteriner yardım veya tavsiye arayan yara (enfeksiyon, kızarıklık, vb) devlet hem izleyin. Önemlisi, deneyci uygun elleçleme ve alışma gerekli olduğunu unutmayın: deneyci ele zaman sinirlilik ya da stres belirtisi kalana kadar hayvanlar, kanül manipülasyon dahil olmak üzere, kapsamlı ele alınmalıdır.
  7. Müteakip hayvan bakımı ve tedavisi. Hayvanlar onaylanan protokole ve kendi özel deney grubuna göre uygun test ve ötanazi prosedürleri takip edecektir.

3. Mikrodivaliz (mD)

  1. Perfushazırlık yedik. Yapay hücre dışı sıvı (aECF) 153.5 mM Na, 4.3 mM K, 0.41 mM Mg, 0.71 mM Ca, 139.4 mM Cl, 1.25 mM glukoz, pH 7.4 6 tamponlanmış ile yapılır NOT Doğru akışkan kompozisyonu esastır:. Yanlışlıklar veya kullanmak Bu tür Ringer ya da mikro-diyaliz için PBS gibi diğer fizyolojik sıvılar daha az belirgin olarak hatalı sonuçları 6 neden olur. Özellikle, hipokampal ECF 6 2004 tarihli bir ayrıntılı çalışmada gösterdiği gibi ekstraselüler sıvı (ECF) ve iyonik bileşimi, BOS aynı değildir unutmayın. Test gününde, sığır serum albümin (BSA) 2% ağırlık / ağırlık eklenir ve tamamen çözünmüş olmalıdır; Bu tür aderans tüp insülin gibi peptidlerin kaybını azaltır, hem de sıvı kaybı riski (ultrafiltrasyon) azaltır prob membran. Hazırlandıktan sonra, perfüzat bir .2 mikron filtre içinden filtre edilmelidir.
  2. Insülin gibi bir tedavi sutyen teslim edilecek isefaiz (burada hipokampus) yöresinde, uygun ilaç konsantrasyonu ile hazırlanan aECF bir kısım kullanarak bu tedavi hazırlar. İnsülin için, ters mikrodiyaliz yolu ile teslimat için 400 nM konsantrasyonda (66.7 μU / ul) hipokampal metabolik ve bilişsel fonksiyon 7 etkilediği gösterilmiştir. Insülin çıkan doku konsantrasyonu burada ölçülür ve bilinmeyen kalır unutmayın.
  3. MD probu ve hatları kurma. Taze bir mikrodiyaliz prob ve hat testleri bir gün önce hazırlayın. "Giriş" ve "çıkış" için iki ayrı hat oluşturun. FEP boru iki adet 1 metrelik parçalar bağlamak ve satırlar arasında minimum ölü boşluk olduğundan emin olmak için PE50 boru kullanın. Steril filtreli, deiyonize H 2 0 (2 0 dH) ile doldurulmuş 1 ml Hamilton şırınga etmek girişi hortumu bağlayın ve ardından prob iliştirin.
  4. Mikrodivaliz döner. Ölçüm yaparken ücretsiz hayvan hareketleri için izin vermek için, ben bir sıvı döndürme bağlamaknflow ve çıkış hatları, ek FEP hortumu kullanıyorsanız, pompa yakındır. Örnek toplama zamanlaması (aşağıda) dikkate alınarak dikkate bu döner ve borunun iç hacmi almayı unutmayın.
  5. MD pompası kurma. MD pompa açın ve 2 0 probu üzerinde çıkış borusu çıkmadan dH görene kadar 1.5 ul / dak çalıştırın. Pompa kapalı iken Ardından, çıkış borusu ve bir örnek toplama tüpü arasındaki diğer hattı bağlayın. Tüpünden 5 ml çalıştırın ve geceleme steril dH 2 0 içeren bir flakon probu yerleştirmek; prob ucu hep ıslak kalmasını sağlar.
  6. Ön-tarama testi konu. Testten önce 24 saat, sıçan başının ikinci sahte stileyi kaldırmak ve 10 dakika süreyle bir MD sonda (değil örnekleme için, sadece bu amaç için kullanılır) ekleyin. Sonra kukla stileyi değiştirin ve kafesine geri fare koymak. Bu prosedür 8 test günü ve bizim ellerde reaktif gliozis herhangi bir etkisi en aza indirmek için tasarlanmış, bu iyi resul verents diğer teknikler verileri eşleştirmek ve hipokampal aktivasyon 2,5,7,9 yansıtmak için görünür, diğerleri de iyi bir yaklaşım olduğunu ölçümü, öncesinde 24 saat boyunca yerde prob bırakır da benzer bir yaklaşım kullanılan varsa zarar prob gecede önlenebilir.
  7. Prob dengeleme. Mikrodiyaliz gününde, süzüldü aECF ile Hamilton şırınga ve sintilasyon flakon doldurmak ve 1 saat dengeye kadar pompalamak. Gerekirse, şırınga pompası içine hazırlanmış tedavisinde (örneğin, insülin-aECF) ve yeri ile ikinci bir Hamilton şırıngası doldurun.
  8. Prob yerleştirme. Dengelenme tamamlandığında, kukla stileyi çıkarın ve yavaşça kanül aracılığı rat beyin içine dengelenmiş mD probu yerleştirin. Rat ev yatak bazı içeren bir şeffaf plastik kutu içine sıçan yerleştirin. Yerçekimi microdi tuttuğunu şekilde kafes dışında tüp su ile dolu bir 1.6 ml mikrosantrifüj tüpü takmak: boru dengelemek için emin olunalysis hatları unkinked ancak gergin değildir. Prob 2 saat sıçan muvazene edelim. Bu dönemin başında, perfüzat bu akışı teyit unblocked: Bu en kolay tanımlanan bir süre boyunca perfüzat çıkış toplama ve beklenen ses sistemi çıktıktan olduğunu onaylamak için örnek tartım yapılır. Verimleri <90 beklenen hacmi ve% kaldırma ve yeniden yerleştirilmesi sonra kendini doğru değil, değiştirilmesi gerektiğini herhangi bir prob (sonda ucunda aksi ödem neden olur). Akış sürekli düşük veya yok ise, sızıntı tüm bağlantıları kontrol edin; tıkanıklık izole edilebilir olup olmadığını görmek için aşamalarında boru bağlantısını, bu başarısız. Sorun tespit değilse, probu değiştirin; sorunu çözmezse, yeni prob ve Bölüm 3,3 hatları ile baştan başlamak için gerekli olabilir. Iki saatlik alışım dönemi probu etrafında kapatın ve prob yerleştirme herhangi bir akut etkisi önlemek için kan-beyin bariyeri sağlar.
  9. Örnekleri toplanıyor. Emin olun işbirliğinumune diyalizi (beyin) ve toplama (tüpüne) arasındaki rrelation doğru hesaplanır. Örneğin, döner ve prob arasındaki FEP tüpünün iki metre kullanarak, prob ve 30 ul arasında oluşan toplam hacmi vardır ve dolayısıyla sonda, boru, bağlantı geçmesine 1.5 ul / numune için min akış hızında 20 dakika sürer ve toplama için hortumun ucu ulaşmak için döndürün. Örnekler toplamak size deneyleri için gerekli konsantrasyonu için yeterli hacmi toplamak dikkat ediniz. Burada, her bir toplama tüpüne diyalizat 7.5 ul toplamak böylece 5 dk numune kutuları kullanın ve olacaktır.
  10. Baz örnekleri. Dengelenme tamamlandığında, örnek toplama başlar. Sıçan ölçümlerin istikrarlı bir temel kurmak için evde odasında istirahat ederken en az üç örnek toplayın
  11. Tedavi zamanlaması. Deneylerden önce tedaviye başlanması için gerekli zamanlama hesaplamak için dikkat edin: diyaliz arasında bir gecikme olduğu gibi hatırlıyorumve örnek toplama, perfüzat şırınga bırakarak ve hayvanın hipokampus gelmeden arasında bir gecikme (genellikle özdeş) vardır. Dolayısıyla, şırınga ve prob arasındaki 30 ul hacim ile kurulum, sen hipokampus gelen başlamak için tedavi isteyen önce bu içeren tedaviye perfüzat 20 dk şırıngayı değiştirin.
  12. Şırınga değiştirme. İstediğiniz ancak gerekli değilse bir sıvı anahtarı kullanılabilir: Uygun zamanda, sadece kontrol perfüzat şırıngadan girişi Hattı kesmek ve hızla tedavi perfüzat şırınga bağlanın. Bu perfüzat akışını önemli kesintiye uğramaması için en fazla 5 saniye sürer. Tedavinin sınırlı bir süre teslimat isteniyorsa istenen dozaj, teslim edildikten sonra bu süreç tersine gerektiğini NOT. Alternatif olarak, tedavi (bkz. Şekil 2) Örnekleme süresi boyunca devam edebilir. Hava kabarcıklarının anahtarlama esnasında hattı girmiş olmamalıdırşırıngalar, onlar diyaliz zarı birikebilir ve prob verimliliği azaltabilir gibi.
  13. Davranış testleri. Davranışsal bir görev yapıyorsanız, (aşağıda bölüm 4'e bakınız) bu prosedürü izleyin. NOT hipokampus ile tedavinin verilmesi ile koordinasyon önemli olduğunu. Örneğin, ensülin önce doğum başlangıç ​​test 10-10 dakika meydana belirlenmelidir. Bu nedenle, bir insülin içeren perfüzat için anahtar davranış testi öncesi 30 dk (perfüzat için 20 dakika hatları artı 10 dk boyunca öncesinde test istenilen teslim süresi geçmesi) gerçekleşmelidir.
  14. Örnek toplama tamamlanması. İstediğiniz örnekleri topladıktan sonra, tekrar hafifçe diyaliz ve numune toplama arasındaki hesap gecikme dikkate almak hatırlayarak, hayvanın başından prob çıkarın. Onun ev kafesine hayvan dönün ve hayvan öldürdü ve beyin doğru onaylamak için kaldırılana kadar sağlık ya da herhangi bir davranış sonrası deneysel değişim için yakından gözlemlemekprob yerleşimi. Kurban hemen gerçekleşmez ise, yabancı madde, herhangi bir giriş önlemek için kanül kukla stile dönmek.
  15. Analiz. Analitik yöntem ilgi analit (ler) bağlı olarak değişir. Diyaliz örnekleme probu membran tam analit dengelenmesi için izin vermediğinden, örnek konsantrasyonları sıfır-net-flux yöntemiyle 11,12 kullanarak ECF konsantrasyonları vermek için düzeltilmelidir.

4. Davranış Testi

  1. Labirent Yerleştirme. (En az üç numune diyaliz tamamlamış ancak halen toplanmakta olan çıkış boru olabilir sonra yani) bazal örnekleri yapıldıktan sonra, yavaşça davranışsal test cihazları içine sıçan taşıyın. Herhangi bir uygun görev kullanılabilir; Şekil 1 'deki veriler dört kollu artı şeklinde bir labirent kullanılarak ve uzaysal çalışma belleği bir ölçüsü olan kendiliğinden münavebe, ölçme toplanmıştır: sıçan başlangıçta cen yerleştirilirserbestçe 9,13 keşfetmek için labirentin ter ve izin verdi. Herhangi bir davranış testi kullanılabilir olduğundan, bu protokolün odağı burada bir örnek (başka 9,14,15 ayrıntılı olan) ama kısa kullanılan belirli bir görev üzerinde değil, hayvanlar (dönemin labirenti keşfetmek için izin verilir gri Şekil 1'de kutusu) ve silah bellek korumak için hipokampal-bağımlı süreçlerin kullanımı son ziyaret edilmiştir.
  2. Test sırasında Diyaliz boru hareketi. O ne fare hareketini engelleyen veya hayvanın önünde hareket ve dikkatini dağıtmak için izin almaya, serbestçe hareket öyle ki tüp tutun. Bir yerde kalmak ve sıçan davranışını etkilemez, böylece kendi hareketini en aza indirmek.
  3. Devamı örnek toplama. Başlangıç ​​sırasında olduğu gibi, her 5 dakikada bir yeni bir koleksiyon tüp çıkış hortumu taşıyın.
  4. Nöbetleşme testi. Hayvan serbestçe 20 dakika labirent keşfetmek için izin verin. Kullanarak ya da kol girişlerinin sırasını ve zamanlamasını kaydedinbir video kayıt veya daha sonra görev performans analizi 9,15 için elle.

5. Post-test

  1. Nihai örnek toplama. Test sonrasında, labirent ve oda kontrol moduna geri dönmek için hafifçe sıçan çıkarın. Görev performansı sonrası toparlanma dönemi kapsayacak şekilde en az dört numuneler için mikrodiyaliz örnek toplama devam edin.
  2. Prob kaldırma. Tüm örnekleri alındıktan sonra, yavaşça bir saklama kabı içine Canlının kafası ve yerden prob kaldırmak; onun ev kafesine hayvan dönün.
  3. Prob depolama. Ev kafesine hayvan dönen ve kalan diyalizat toplanması tamamladıktan sonra, dH 2 0 ve dH 2 0 ile doldurulur ve parafilm ile kaplı bir sintilasyon flakon mağaza ile iyice prob durulayın. Mikrop büyümesini önlemek için dH 2 0 1:10,000 Kathon çözeltisi içeren bir şırınga geçerek tüp yıkayın. Onlar iyi bir akış sağlamak ve sahip olduğu Probları sürece yeniden kullanılabilirMembran herhangi bir hasar, bakım ile bu rutin on kullanımları fazla olmalıdır.
  4. Histoloji. Hayvan öldür ve beyin çıkarın. Kriyostaz üzerine Dilim ve doğru prob yerleştirme onaylamak için standart histolojik teknikler (örn. cresyl violet boyama) kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sıçanlar cerrahi hızla kurtarmak ve anestezi 30 dakika kesilmesini takiben içinde, uyarı hareketli ve aktif olmalıdır. Ameliyat temiz yapılır ve en az diş çimento kullanıldığında, kanül kapak etkisi en az düzeyde olmalıdır. Herhangi bir enfeksiyon belirtisi post-operatif takibi sırasında fark veya sıçan deney sona hemen, sıkıntı veya rahatsızlık belirtileri gösteren herhangi bir şekilde olduğu takdirde, bu son derece nadir olmalıdır. Test öncesinde kullanım sırasında, hayvanlar, uyarı serbestçe hareketli, güleryüzlü ve meraklı olmalıdır. İyi ele hayvanlara cerrahi ameliyat sonrası iyileşme veya deneyi varlığında kalan esasen gözlenebilir bir gerilme olması gerekir, bu plazma hormon stres ölçümü ile teyit arzu edilirse (epinefrin, glukokortikoidler) ve / veya glikoz 2,4 edilebilir , 5.

Beyin ECF glukoz aralığında 0.5 tipik olarak - 1.5 mM, beyin bölgeye göre değişen, yüksek değerlere rağmendiyabetik hayvanlarda görülebilir; hipokampus, bazal glukoz konsantrasyonları 1.25 mM 6,12 arasında yakın taleplerdir. Herhangi bir dışsal tedavi yokluğunda, ECF glukoz bir dalış (ve, genellikle, ECF laktat bir artış) bu görev (örneğin bkz. Şekil 1) yapma ile ilgili beyin bölgelerinde, görev performans sırasında, görülmelidir: Bu yansıtır artmış bir metabolik aktivite bilişsel yük 9,14,16 tarafından indüklenen. Benzer değişiklikler belli bir tedavi olarak insülin akut verilmesinden sonra perfüzat 7 (Şekil 2) eklenmesi ile örneğin görülen metabolizma lokal artar, bu da bir kanıtı olarak alınabilir.

Genel olarak, iyi kulplu hayvan sıkıntısı hiçbir işareti ile ve mikrodiyaliz boru farkındalık belirtisi olmaksızın davranış testi gerçekleştirmeniz gerekir: aşırı tımar, hareketsizlik, ağrı herhangi bir gösterge ya da işaret prob kaldırmak için hayvan tarafından girişimleri belirtileriprob sitenin etrafında olasılıkla yetersiz işleme ve / veya enfeksiyon ve bu deney sona erdirmek için bir gösterge olarak kabul edilmelidir.

Insülin uygulamasının alıcı hayvanlar, yüksek hipokampal metabolizma yanı sıra, önemli ölçüde gelişmiş uzaysal bellek 7 göstermelidir. Kontrol, işlenmemiş hayvan 7,9,14% 65 ile 75 arasında 4 kollu labirent ortalama ardalanması performansı olmalıdır.

Şekil 1
Şekil 1. Hipokampal ECF glukoz (9 uyarlanmıştır) Görev-ilişkili daldırma. Gri kutu spontan ardalanması (SA) üzerine labirentin test dönemidir. Mor çizgi hiçbir labirent testi (ama aksi özdeş ele kim) ile hayvanlarda hipokampal glukoz gösterir. Kırmızı çizgi 4-kol SA görevi gerçekleştirirken hayvanlarda ölçümler; turuncu çizgi kolay performans hayvanlarda ölçümleri gösterir3 kollu SA sürümü.

Şekil 2,
Şekil 2. Perfüzat dahil (7 uyarlanmıştır) yoluyla insülin verilmesinden sonra hipokampal glikoz ve laktat değişiklikler. İnsülin ok ile gösterilen noktada hipokampus ulaşır ve daha sonra sürekli olarak tatbik edilmektedir. Hayvanlar, hiçbir davranışsal manipülasyon, evlerinde kafeslerde test edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrodiyaliz kullanılan tüm .2 çözeltileri um filtre kullanılarak, hemen kullanım öncesi filtre edilmelidir. Kılavuz kanül içine prob yerleştirilmesi sonra, o akışı engellenmemiş olduğunu ve örnek toplama oluştuğunu doğrulamak için gözlemlemek. Akış yerleştirilmesi sonra durursa, en muhtemel nedeni yerleştirilmesine yetersiz bakım nedeniyle prob membran hasarı ve taze bir prob ikame edilmelidir.

Yukarıda belirtildiği gibi, bu yöntemlerin önemli bir avantaj uyanık, serbestçe hareket eden hayvanlarda davranışsal ve nörokimyasal hem tedbirler izin, şaşırtmaya eksikliği: Bu yararlanmak için, testten önce kapsamlı taşıma hayvan sırasında gerilmemiş olması şarttır ölçümleri. Dengeleme süresi genellikle sabit bir temel metabolik sağlamak için yeterli olan, fakat hayvanların boyunca homojen kan glikoz düzeyleri sağlamak için eğer istenirse gıda Test öncesinde, 1-2 saat için çıkarılabilir.

The bir örnekleme tekniği olarak mD iki en önemli sınırlamalar (i) sınırlı analitin boyutu ve tüp yapışma nedeniyle analit kaybı (ii) potansiyel vardır. Eski daha büyük bir moleküler ağırlığa sahip kesme mD probların kullanımı ile bir dereceye kadar kontrol altına alınabilir. Tipik ticari problar kadar moleküller belki 50 kD nispeten engelsiz geçecek etmek, böylece 100 kD kadar cutoff izin, ancak mümkünse prob ucunda ultrafiltrasyon yoluyla herhangi bir numune kaybını en aza indirmek için tavsiye edilir alt limit membran kullanın. Boru hedef moleküllerin Yapışma öncelikle tüp FEP ve dolayısıyla analit kurtarma ve ölçüm doğruluğu hem azaltmak için uygun eğiliminde olacaktır birçoğu peptid ölçümleri, durumlarında bir konudur. : Bu sorun, (i) bir perfüzat ile hangi% 2 sığır serum albümini bir bloke edici ajan olarak hareket eklendi, ve (ii) geri dönüş borusunun uzunluğu en aza indirerek edilmiş borunun iç ön-muamele ile çözülebilir eğer neBu özellikle davranışsal test sırasında, hayvan bozmadan toplama tüpleri anahtarlama ek zorluklar yaratıyor olsa eded, bir koleksiyon hafif flakon, yakın prob çıkış eklenebilir. Teknik bir avantajı örnekleri hücre enkazları veya adı enzimler gibi büyük moleküllerin serbest bir şekilde elde edildiği, ve HPLC içine enjeksiyon yolu ile, genellikle doğrudan analizi için uygun olan, MS ya da diğer analitik makine ve daha ileri saflaştırma için ihtiyaç olmadan olarak- , bu da pek çok durumda her bir numune içinde çoklu analit (örneğin, Şekil 2'de gösterildiği gibi glikoz ve laktik asit ölçümü gibi) analiz izin verir.

Farmakolojik tedaviler sunmak için ters mikrodiyaliz kullanımı üzerine bir varyasyon çeşitli kaynaklardan bulunabilir çift mikroenjeksiyon-mikrodiyaliz probları, kullanmaktır. Bununla beraber, enjeksiyon noktasının deliği genelde çok dar ve tıkanma eğilimli ve doğru bir şekilde zor olabilirzamanlama ve / veya tedavi teslimat düzeyini kontrol eder. Bu alternatif dolayısıyla yalnızca perfüzat eklenmesi yoluyla teslimat için uygun olmayan tedaviler için önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH / NIDDK (ECM DK077106) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (6), 2881 (2000).
  2. McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56, (2), 66 (2001).
  3. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75, (3), 325 (2001).
  4. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  5. McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53, (2), 418 (2004).
  6. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  7. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75, (3), 325 (2001).
  8. McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55, (4), 1088 (2006).
  9. McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132, (1), 35 (2004).
  10. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  11. Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49, (3), 729 (1987).
  12. Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74, (3), 234 (1987).
  13. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (6), 2881 (2000).
  14. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93, (4), 546 (2010).
  15. Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
  16. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  17. Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26, (1), 91 (2002).
  18. Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5, (4), 358 (1986).
  19. McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87, (2), 298 (2006).
  20. McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18, (10), 3853 (1998).
  21. Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98, (4), 467 (2009).
Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</emMekansal Bellek Test sırasında&gt; mikrodivaliz
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).More

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter