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Medicine

内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞模型缺血性中风激光多普勒血流仪在大鼠指导

Published: February 16, 2013 doi: 10.3791/50014
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 4, 1, 3
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran, 3Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida, 4Department of Neurology, University of Florida

Summary

已经开发了几种脑缺血的动物模型来模拟人的条件中风。该协议描述了内皮素-1（ET-1）诱导大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠缺血性中风。此外，重要的考虑因素，此模型的优点和缺点，进行了讨论。

Abstract

2009年1，2，耗资约70亿美元在美国，中风是导致残疾和死亡的第三大原因，在世界上的头号。已经开发了几种型号的脑缺血，中风模仿人类的​​条件。曾有人建议，高达80％的所有笔划的结果由缺血性脑损伤中的大脑中动脉（MCA）的第3区。在20世纪90年代早期，内皮素-1（ET-1）4，通过将它直接相邻的表面后，在MCA开颅用于诱导缺血。后来，这个模型进行了改进，采用立体定向注射ET-1的相邻MCA局灶性脑缺血。这种模式的主要优点包括能够迅速执行过程，控制动脉收缩，通过改变剂量的ET-1交付的能力，没有需要处理的颅外血管供应血液输送到大脑，并逐渐reperfusi的利率，更接近人类再灌注损伤的5-7。另一方面，ET-1的模型具有的缺点，其中包括需要开颅，以及更高的变异性的每搏输出量8。这种变化可以减少使用激光多普勒血流仪（LDF），以验证脑缺血时ET-1次静脉滴注。变异性中风的因素影响包括输液和一批ET-1的精度，使用了6个 。另一个重要因素是，虽然再灌注损伤是一种常见的发生在人类中风，阻断ET-1诱导脑缺血的持续时间可能不会紧密地模仿人类中风病人多有局部灌注在一个小时内闭塞9天， 10。此协议中详细描述的ET-1诱导的脑缺血模型大鼠缺血性中风的。在整个过程中，它也将提请注意的特殊考虑和潜在的缺点。

Protocol

机构动物管理和使用委员会（IACUC）在佛罗里达大学和批准该协议是符合“指南的照顾和使用的实验动物”（第八版，美国国家科学院，2011年）。

物料

  1. 动物：8周龄，雄性，只SD大鼠（查尔斯河农场，威​​尔明顿，MA，USA），体重250〜300克，手术时间。
  2. 麻醉
    1. 吸入麻醉系统（VetEquip公司，普莱森顿，CA，USA）
    2. 异氟醚麻醉剂（巴克斯特制药，迪尔菲尔德，IL，USA）
  3. 立体定位系统（大卫KOPF工具，图洪加，CA，USA）
    1. 小动物立体定位系统
    2. 非破裂大鼠耳棒
    3. 气体麻醉大鼠头支架
  4. 温度调节
    1. BAT-12探针温度计（世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州，美国）
    2. T / PUMP，TP600热毯（Gaymar工业公司，果树园公园，NY，USA）
  5. 手术器械
    1. 手术刀，虹膜镊子手柄＃和11＃刀片，格雷夫斗牛犬钳钳，拉钩，螺丝刀，10μl注射器，26号斜口针（世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州，美国）
    2. 微电机的演习和立体的持有人，精髓立体定向喷油器（Stoelting，伍德戴尔，IL，USA）
    3. 1.0毫米的圆形钻钻，1.0毫米的倒锥钻牙钻（Roboz手术仪器有限公司，公司，盖瑟斯堡，MD，USA）
  6. 手术用品
    1. 安装螺丝0-80 X 3/32，2.4毫米轴的长度，21号导管4mm长的基座下方，套管假的（塑料，罗阿诺克，VA，USA）
    2. 李连杰义齿丙烯酸树脂和液体的（郎牙科制造有限公司，公司，威灵，IL，USA）
    3. 3.0尼龙线（绿洲，Mettawa，IL，USA）
    4. 棉拭子，Puralube的眼膏（默飞世尔科技，匹兹堡，PA，USA）
    5. 电推剪（奥斯特，普罗维登斯，RI，USA）
  7. 化学制品
    1. 内皮素-1（美国多肽，桑尼维尔，CA，USA）
    2. 洗必泰2％（Agrilabs，圣若瑟，MO，USA）
    3. 盐酸丁丙诺啡（赫士睿公司的Lake Forest，IL，USA）
  8. 可视化设备
    1. 手术显微镜（塞勒仪器及制造，圣路易斯，MO，USA）
    2. 光纤照明器（TechniQuip公司，利弗莫尔，CA，USA）
  9. 激光多普勒血流仪系统（的ADInstruments公司，科罗拉多斯普林斯，CO，USA）
    1. 圣andard铅笔探头
    2. 探头支架
    3. 血液流量计
    4. PowerLab系统4/30与LabChart 7
  10. 梗死体积的测量
    1. 大鼠大脑基质（Zivic - 米勒实验室，公司，艾里逊公园，PA，USA）
    2. 2,3,5 - 三苯四唑氯化物（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州，美国），在PBS中稀释至0.05％
    3. 平板式扫描仪（爱普生Perfection V30，爱普生美国公司，长滩，CA，USA）
    4. Image J软件（ImageJ的1.42q软件，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，MA，USA）

1。术前步骤

  1. 手术前，老鼠被安置在一个12:12的光/暗周期，可免费使用水和啮齿动物州城。
  2. 麻醉诱导与4％异氟烷在100％O 2的混合气体的感应室中，直到不再大鼠提款后部爪夹送。
  3. 一化粪池在此过程中，应保持技术，包括使用无菌手套，无菌外科手术器械，一个无菌手术铺巾11。
  4. 电推剪剃光头顶。
  5. 大鼠置于俯卧趴在一个温度控制的操作表面（热毯）的吸收垫的位置上。
  6. 头被放置在立体定向装置放置气体麻醉面罩开始。
  7. 接着，耳棒被插入并拧紧。
  8. 在手术过程中麻醉维持在100％O 2的混合气体，用2％异氟烷。
  9. 润滑油眼药膏的双眼，眼皮被关闭，以防止眼睛干燥，在手术过程中。
  10. 探针插入直肠温度为37±0.5℃下，以保持恒定的动物核心温度
  11. 头牢牢的立体的移动设备，手术区洁净交替2％洗必泰和盐水洗涤三次。

2。手术步骤

  1. 中线切口用手术刀，是由覆盖在颅骨的眼睛从最尾端的方面（鼻根）之间的耳（上项线）在皮肤上。
  2. 3斗牛犬夹横向的皮肤，然后缩回。
  3. 从颅骨，使多个结构可以清楚地看出，用干棉签去除结缔组织。这些措施包括，冠状缝，前囟门和右侧头骨脊。使用棉签清除血液从手术领域。
  4. 使用手术显微镜，前囟门的位置，立体机械手进行调整，直到锁定在1.0毫米的圆形钻钻上的前囟门。
  5. 钻牙钻，然后移动到1.6毫米前侧面，前囟门和5.2毫米。
  6. 车针，穿透颅骨上钻洞卡恩乌拉的位置（ 图1）。不断地用棉签清除过量的碎片和血液。

在这一点上，一个导向套管可以被插入（步骤7）或ET-1直接注射通过牙钻通孔，可以进行（直接前进到步骤16）。

  1. 接着，钻的孔的3个安装螺丝钻颅骨使用1.0毫米的倒锥钻牙钻（ 图1）通过部分的厚度。在每个约1-2毫米的冠状缝和矢状缝1-2毫米的横向前额骨上钻一个孔。在顶骨钻一个孔，约2-3毫米的冠状缝和2-3毫米，侧的矢状缝同侧导管牙钻洞的后方。三0-80×3/32安装螺丝被放置在这些牙钻洞，并在套管水泥控股将提供支持。螺丝应仅是先进的2或3圈，以便不损坏硬膜。 导管被放置在立体定位的套管夹持器，并位于前囟。
  2. 立体机械手调整，直到锁定在导管前囟门。套管移动到牙钻孔位于1.6毫米前壁和5.2毫米的横向于前囟。
  3. 最后，在导向套管被降低到牙钻孔4.5毫米腹侧囟与最后的前端位置。
  4. 激光多普勒血流探测位置（可选）
    1. 为了使用LDF监测大脑的血流量，探头支架可以放置到位置加盖指南套管用牙科水泥。
    2. 除了小楔形“选项卡，探头支架基座的底座齐平修剪。
    3. 探针架座，然后放置后导向套管和公正的内侧与面向的标签的内侧（ 图1）的侧颅底脊。
    4. 探针架座和g指南套管贴在一起，用牙科水泥。
  5. 然后，使用牙科用粘固剂的插管固定到位。水泥是在三个螺钉与所有的接触和围绕所述套管的整个基地。
  6. 应完全干燥的水泥之前除去的套管夹持器。这大约需要5分钟。

在这些步骤之后，手术切口可以关闭，可拧入导向套管和套管虚设。另外，ET-1诱导MCAO可以对大鼠进行一段时间后，从插管植入手术的恢复。对于此方法，应接着执行步骤19，并在稍后的时间，可以执行步骤14-18。要执行同样的手术过程中引导导管植入和注射ET-1，第14步进行。

  1. 输液注射器装入与ET-1（在PBS中稀释至80μM），然后安装在立体定向喷射器。
  2. “立体定位的操纵器被调整直到针尖在导向套管的边缘被归零。
  3. 针尖降低，通过导向插管17.2毫米腹侧的导向套管的边缘的位置的。如果不使用的导向套管，针尖归零在囟和降低通过牙钻孔的位置8.7毫米腹侧囟。
  4. 3微升80μMET1注入的速率（每分钟）的1微升。
  5. 注射器为3分钟，在输注后是完整的，然后慢慢地去除留在原地。
  6. 切口6.0尼龙缝线被拧入插管和插管虚设封闭。
  7. （ 即丁丙诺啡在0.05-0.1毫克/公斤），应使用适当的镇痛药的剂量，手术后的恢复期间，以减少疼痛和不适。
  8. 大鼠从手术室被移除，并放置在温暖，干燥的恢复区，以防止低温，柔软的食物和水的自由，方便地访问。

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Representative Results

1。术后神经学评估

动物苏醒后，可用于广泛的测试，以评估神经功能障碍，包括平衡，握力​​，爪子配售，姿势不对称和楼梯攀登。葵花籽任务的运动和感觉功能，具有显着的相关性梗死第7卷，12是一个总的评价。在这个任务中，老鼠是定时开放和消费5葵花籽。五个种子放置在一个角落里，一个空的，干燥，塑料保持架和操纵的种子所花费的时间被记录。此外，在笼子里，所有的种子后，在被打开和消耗壳片的数目被记录。更大的神经功能缺损的大鼠会需要更长的时间来打开和使用的种子，将打破弹入多件。虽然不是正式的这个任务的一部分，它很容易观察到频繁的误操作和下降的向日葵种子s的大鼠实验性中风。这包括使用主要是前爪，和无效的外壳咬在试图打开。

2。染色及定量测量脑梗死体积

在MCA闭塞和再灌注后建立短暂性脑缺血，动物安乐死，2,3,5 -氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，以评估他们的冠状切片的大脑梗死体积的（ 图2），在我们以前的出版物中讨论7，第13。

图1
图1。大鼠颅骨背视图描绘硬件布置。这前壁面向左侧的大鼠颅骨背视图显示的位置后，可以可视化的缝合线相对于前囟和lambda清除结缔组织从颅骨表面的组织。侧头骨脊，LDF探头支架，导管，和锚定螺钉也显示在图上的相对头骨土地的商标和相互之间的关系。

图2
图2。序列冠状脑切片TTC染色（2毫米）大鼠ET-1诱导的脑缺血。从ET-1诱导脑缺血大鼠脑的一位代表。大脑在冰冷的PBS冲洗切片冠2毫米厚的部分，开始只是尾部的嗅球前。片，然后在0.05％孵育TTC在PBS中稀释，在37°C前被骤冷，在PBS中，然后固定在福尔马林中短暂。组织染成红色后，暴露在TTC可行的灰质。可行的灰质可以相比，ET-1注射同侧半球的灰色米东北黑钙土的对侧半球脑梗塞的面积来计算。

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Discussion

ET-1诱导脑缺血是一个既定的模式，经常使用在多个品系的实验缺血性中风。许多变量，如大鼠株，动物年龄，体温，麻醉方法和操作者的专业知识，可导致梗死体积的变异性增加时，使用此模型5中，14。然而，一些研究者已经证明，这种模式的优势，包括相对非侵入性的方法，剂量反应的脑血流ET-1，和能力，以避免完全由麻醉注射ET-1在清醒大鼠14日，15。值得注意的是，有很多在大鼠整个文学的应变和年龄的差异和不同的立体坐标，根据这些变量，这并不奇怪。我们的协议中使用的坐标8周龄雄性SD大鼠进行了优化。从该菌株中的任何偏差，性别，年龄，可能需要脑内注入离子染料随后尸检此过程，以确定有效的坐标。此外，ET-1诱导的脑血流减少是剂量依赖性的。在该方法中使用的剂量会导致梗塞同侧注射，标准误差的平均值为约4-5％的范围内的实验7，16，在该半球的灰质的约30-40％。 MCA的近端部的直接可视化揭示了管腔直径，在3分钟内，并返回到基线在约30分钟7到0％的基线。使用LDF，最大流量的结果表明，以减少到约10％的基准流量在5-7分钟逐渐返回到基线的60％，1小时后停止监测16。

其他具体的技术细节，值得提的是下面列出的：

  1. 正确定位和立体定位设备，前囟门（微观指导下）调零，是非常重要的induci纳克一个成功的行程。应核实具体的实验设备和实验之前，大鼠株的立体坐标ET-1次静脉滴注。它很可能会发生，如果没有病变输液不是0.5mm以内的MCA 6。
  2. 请注意，不要造成伤害到大脑时，最初的牙钻导管孔的钻。据建议，一个缓慢的钻井速度可以用来启动牙钻的孔和朝向端再次，以尽量减少渗入大脑的机会。
  3. 钻孔时钻针的安装螺钉孔，用倒锥钻牙钻，创建一个的牙钻洞，只能部分地穿透颅骨。只有钻，深足以使螺丝是稳定的。
  4. 固井套管时一定要保持水泥的皮肤以及立体手臂。可以被操纵的水泥之前干燥用棉签。
  5. 水泥是完全博士y和所述套管是稳定的之前除去的套管夹持器。至关重要的是，在插管前不动ET-1注射。
  6. 根据我们的经验，ET-1的中风模型有大约20％的死亡率，由于手术过程。这是重要的，比较治疗组和还计划实验，以便有足够的样本的大小用于神经学和组织学的端点之间的死亡率。
  7. 急性中风治疗的临床前试验的指导方针建议，以减少脑血流量监测和生理监测血压，温度，血糖，血液气体的变化在实验过程中17。 LDF是一种方法，该方法可以被用于实时监控的血流量在各解剖区域已达到预定阈值的验证，以减少在流动。
  8. 一定要清洗注射器和针头输液，注射用乙醇和生理盐水之间，乙醇之前存储。此过程将提供一致的提取和注射ET-1without的气泡或堵塞在操作过程中。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是支持由美国心脏协会大中华区东南亚联盟（09GRNT2060421），美国医学协会，并从大学的佛罗里达州的临床与转化科学研究所的资助。亚当麦加是一个NIH / NINDS，NRSA博士前研究员（F30 NS-060335）。高血压（T32 HL-083810）从佛罗里达州的多学科培训计划的大学，博士前奖学金罗伯特·Regenhardt收到支持。

Materials

  1. Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery.
  2. Anesthesia:
    1. Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA):
    1. Small animal stereotaxic system
    2. Non-rupture ear bars for rats
    3. Gas anesthesia head holder for rats
  4. Temperature regulation:
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
  5. Surgical instruments
    1. Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (St–lting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Surgical Supplies
    1. Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicals:
    1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualization Equipment
    1. Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. Standard Pencil Probe
    2. Probe holder
    3. Blood FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 with LabChart 7
  10. Measurement of infarct volume:
    1. Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

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References

  1. Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  3. Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W. Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management. Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. , Churchill Livingstone. New York. 377-450 (1986).
  4. Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat. Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).
  5. Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).
  6. O'Neill, M. J., Clemens, J. A. Rodent models of focal cerebral ischemia. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).
  7. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp. Transl. Stroke Med. 1, 8 (2009).
  9. Tomsick, T. A. Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke. J. Vasc. Interv. Radiol. 15, 67-76 (2004).
  10. Olsen, T. S., Lassen, N. A. A dynamic concept of middle cerebral artery occlusion and cerebral infarction in the acute state based on interpreting severe hyperemia as a sign of embolic migration. Stroke. 15, 458-468 (1984).
  11. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
  12. Gonzalez, C. L., Kolb, B. A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology. Eur. J. Neurosci. 18, 1950-1962 (2003).
  13. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. J. Vis. Exp. (51), e2879 (2011).
  14. Sharkey, J., Butcher, S. P. Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery. J. Neurosci. Methods. 60, 125-131 (1995).
  15. Macrae, I. M., Robinson, M. J., Graham, D. I., Reid, J. L., McCulloch, J. Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 276-284 (1993).
  16. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).
  17. Fisher, M., et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations. Stroke. 40, 2244-2250 (2009).

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72期医学，神经学，神经生物学，生物医学工程，外科，解剖学，生理学，神经系统疾病，缺血性中风，内皮素-1，脑血管，脑，血管，中风，阻塞，激光，doppley，流量测定，大鼠，动物模型
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