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L'endotelina-1 indotta cerebrale media occlusione dell'arteria modello per l'ictus ischemico con guida laser flussimetria Doppler in Rat

Published: February 16, 2013 doi: 10.3791/50014
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 4, 1, 3
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran, 3Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida, 4Department of Neurology, University of Florida

Summary

Modelli animali di ischemia cerebrale sono stati sviluppati per simulare la condizione umana di ictus. Questo protocollo descrive l'endotelina-1 (ET-1) indotta da occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) modello per l'ictus ischemico nei ratti. Inoltre, importanti considerazioni, i vantaggi ei limiti di tale modello sono discussi.

Abstract

L'ictus è la prima causa di disabilità e la terza causa principale di morte nel mondo, che costano una cifra stimata di 70 miliardi negli Stati Uniti nel 2009 1, 2. Diversi modelli di ischemia cerebrale sono stati sviluppati per simulare la condizione umana di ictus. È stato suggerito che fino al 80% di tutte le corse da risultato nel danno ischemico cerebrale media (MCA) area 3. Nei primi anni 1990, endotelina-1 (ET-1) 4 è stato utilizzato per indurre ischemia applicandola direttamente adiacente alla superficie del MCA dopo craniotomia. Successivamente, questo modello è stato modificato 5 utilizzando una iniezione stereotassica di ET-1 adiacente alla MCA produrre ischemia cerebrale focale. I vantaggi principali di questo modello includono la capacità di eseguire la procedura rapida, la capacità di controllare costrizione dell'arteria alterando la dose di ET-1 espresso, nessuna necessità di manipolare i vasi extracranici forniscono sangue al cervello e graduale reperfusisui tassi che più strettamente imita la riperfusione nell'uomo 5-7. D'altra parte, l'ET-1 modello ha svantaggi che includono la necessità di una craniotomia, così come una maggiore variabilità della gittata sistolica 8. Tale variabilità può essere ridotta con l'uso di laser Doppler flussimetria (LDF) per verificare ischemia cerebrale durante ET-1 infusione. I fattori che influenzano la variabilità ictus comprendono la precisione di infusione e il lotto del ET-1 utilizzato 6. Un'altra considerazione importante è che, anche se la riperfusione è un evento comune nel tratto umano, la durata di occlusione per ET-1 indotta MCAO non strettamente imitare quello di ictus umano in cui molti pazienti hanno riperfusione parziale per un periodo di ore o giorni dopo occlusione 9, 10. Questo protocollo descrive in dettaglio l'ET-1 indotta modello MCAO per l'ictus ischemico nei ratti. Sarà inoltre richiamare l'attenzione su considerazioni particolari e gli svantaggi potenziali durante tutta la procedura.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) presso l'Università della Florida, ed è in conformità con la "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio" (ottava edizione, Accademia Nazionale delle Scienze, 2011).

Materiale

  1. Animali: otto settimane di età, di sesso maschile, Sprague Dawley (Charles River, Farms Wilmington, MA, USA) del peso di 250-300 g al momento dell'intervento chirurgico.
  2. Anestesia
    1. Inalazione sistema di anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurano anestetico (Farmaceutici Baxter, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotassico sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Piccolo animale sistema stereotassico
    2. Non rottura orecchio barre per i ratti
    3. Gas testa porta l'anestesia per i ratti
  4. Regolazione della temperatura
    1. BAT-12 Termometro microsonda (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, Stati Uniti d'America)
    2. T / POMPA, TP600 coperta termica (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, Stati Uniti d'America)
  5. Strumenti chirurgici
    1. Manico bisturi e # 11 della lama, iris forcipe, Graefe pinze, divaricatori bulldog pinza, cacciavite, siringa da 10 ml con 26 gauge smussato (Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, Stati Uniti d'America)
    2. Micromotore trapano e supporto stereotassica, Quintessential stereotassico Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1,0 millimetri fresa trapano rotondo, 1,0 mm di cono rovesciato trapano fresa (Roboz chirurgico Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Forniture chirurgiche
    1. Viti di montaggio 0-80 x 3/32 con 2.4 mm di lunghezza dell'albero, da 21 gauge cannula guida [4 millimetri a lungo sotto il piedistallo] e manichino cannula (Materie plastiche uno, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet acrilico protesi e liquidi (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Tamponi di cotone, unguento oculare Puralube (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
    5. Tosatrici elettriche (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Prodotti chimici
    1. L'endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Clorexidina al 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorfina HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualizzazione Attrezzature
    1. Microscopio chirurgico (Strumento Seiler e Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
    2. Fibra ottica illuminatore (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flussimetria sistema (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. StMatita sonda Andard
    2. Porta sonda
    3. Sangue flussometro
    4. Powerlab 4/30 con LabChart 7
  10. Misurazione del volume dell'infarto
    1. Rat cervello matrice (Zivic Miller-Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) diluito a 0,05% in PBS
    3. Scanner piano (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Pre-chirurgiche Steps

  1. Prima dell'intervento, i topi sono alloggiati sotto una 12:12 ciclo luce / buio con libero accesso all'acqua e roditori chow.
  2. Anestesia viene indotta con 4% isoflurano in 100% O 2 miscela di gas in una camera di induzione fino ratto non ritiri a pinch zampa posteriore.
  3. Latecnica settico dovrebbe essere mantenuta durante questa procedura, compreso l'uso di guanti sterili, sterili strumenti chirurgici, e un telo chirurgico sterile 11.
  4. La parte superiore della testa è rasata con tosatrici elettriche.
  5. Il ratto viene posto in posizione prona su un tampone assorbente sdraiata su una temperatura controllata superficie operativa (coperta termica).
  6. La testa viene posta nell'apparecchio stereotassico partire posizionamento della maschera frontale del gas anestetico.
  7. Successivamente, le barre auricolari sono inseriti e serrati.
  8. Durante la procedura di anestesia viene mantenuta con isofluorano 2% in 100% O 2 miscela di gas.
  9. Unguento oftalmico lubrificante viene applicato a entrambi gli occhi, e le palpebre sono chiuse per prevenire l'essiccamento occhio durante la procedura chirurgica.
  10. Una sonda di temperatura rettale è inserito per mantenere una temperatura interna costante di 37 animali ± 0,5 ° C.
  11. Con la testa saldamente nella stereotassicodispositivo, l'area chirurgica è purificato con alternanza di clorexidina al 2% e soluzione fisiologica per tre volte.

2. Fasi chirurgiche

  1. Utilizzando un bisturi, una incisione mediana è fatta sulla pelle sovrastante la calvarium dagli aspetti più caudali degli occhi (nasion) fra le orecchie (linea nucale superiore).
  2. La pelle viene quindi retratto lateralmente con 3 pinze bulldog.
  3. Tessuto connettivo è rimosso dal cranio con tamponi di cotone asciutti modo che molteplici strutture può essere visto chiaramente. Questi includono bregma, la sutura coronale, e la cresta a destra laterale del cranio. Tamponi di cotone sono usati per rimuovere il sangue dal campo operatorio.
  4. Utilizzando il microscopio operatorio, bregma si trova, ed i manipolatori stereotassiche vengono regolati fino alla rotonda 1,0 millimetri fresa trapano viene azzerato a bregma.
  5. La fresa trapano è poi spostato a 1,6 mm e 5,2 mm anteriore laterale bregma.
  6. Un foro fresa che penetra il cranio si è esercitato per cannula posizionamento (Figura 1). Detriti in eccesso e il sangue sono continuamente spengono con tamponi di cotone.

A questo punto, una cannula guida può essere inserito (passo 7) o diretta ET-1 attraverso il foro di iniezione può essere eseguita fresa (procedere direttamente al punto 16).

  1. Successivamente, fori fresa per 3 viti di montaggio si sono esercitati nello spessore parziale del cranio con un 1,0 mm di cono rovesciato trapano fresa (Figura 1). Un buco si è esercitato in ogni osso frontale di circa 1-2 mm anteriormente alla sutura coronale e 1-2 mm lateralmente alla sutura sagittale. Un buco si è esercitato nell'osso parietale circa 2-3 mm posteriormente alla sutura coronale e 2-3 mm lateralmente alla sutura sagittale ipsilaterale al foro di guida cannula fresa. Tre 0-80 x 3/32 viti di montaggio sono posti in questi buchi fresa e fornirà il supporto per il cemento che tiene nella cannula. Le viti devono essere solo advanced 2 o 3 giri in modo da non danneggiare la dura madre. La cannula guida è inserito nel supporto stereotassica cannula e bregma si trova.
  2. I manipolatori stereotassiche vengono regolati fino a quando la cannula guida è azzerato a bregma. La cannula viene spostato nel foro situato fresa anteriore 1,6 millimetri e 5,2 mm laterale bregma.
  3. Infine, la cannula guida è abbassato nel foro della fresa con la posizione della punta finale di 4,5 mm al bregma ventrale.
  4. Laser Doppler sonda collocamento di flusso (opzionale)
    1. Al fine di monitorare il flusso ematico cerebrale utilizzando LDF, un porta sonda può essere collocato in posizione prima apposizione della cannula guida con cemento dentale.
    2. La base porta sonda viene tagliata a filo con il piedistallo, tranne per la scheda a forma di piccolo cuneo.
    3. Il supporto sonda viene poi collocato posteriormente alla cannula guida e appena mediale alla cresta laterale del cranio con la linguetta orientata medialmente (Figura 1).
    4. Il titolare sonda e gUIDA cannula sono apposti insieme con cemento dentale.
  5. Cemento dentale viene quindi utilizzato per fissare la cannula in posizione. Il cemento è in contatto con tutte e tre le viti e circonda l'intera base della cannula.
  6. Il cemento dovrebbe essere completamente asciutto prima della rimozione del supporto cannula. Questa operazione richiede circa 5 minuti.

Dopo queste operazioni, l'incisione chirurgica può essere chiuso e il manichino cannula può essere avvitato nella cannula guida. In alternativa, ET-1 indotta MCAO può essere eseguita sul ratto dopo un periodo di recupero dalla chirurgia impianto cannula. Per questo metodo, passo 19 deve essere eseguita dopo e passi 14-18 possono essere eseguite in un secondo momento. Effettuare guida impianto cannula e ET-1 iniezione durante l'intervento stesso, passo 14 deve essere eseguita dopo.

  1. La siringa di infusione è caricato con ET-1 (diluito a 80 pM in PBS) e poi montate nel iniettore stereotassico.
  2. Ilmanipolatori stereotassiche vengono regolati finché la punta dell'ago viene azzerato al bordo della cannula guida.
  3. La punta dell'ago è abbassato attraverso la cannula guida in una posizione di 17,2 millimetri ventrale al bordo della cannula guida. Se una cannula guida non viene utilizzato, la punta dell'ago viene azzerato al bregma e abbassato attraverso il foro di una fresa 8,7 millimetri posizione ventrale al bregma.
  4. 3 ml di 80 mM ET1 viene infusa a una velocità di 1 ml al minuto.
  5. La siringa viene lasciato in posizione per 3 minuti dopo l'infusione è completa e quindi lentamente rimosso.
  6. L'incisione viene chiusa con sutura di nylon 3,0 e il manichino cannula viene avvitata nella cannula.
  7. Una dose di analgesico appropriato (ad esempio buprenorfina a 0,05-0,1 mg / kg) deve essere utilizzato dopo l'intervento chirurgico per ridurre al minimo il dolore e il disagio durante il periodo di recupero.
  8. Il ratto viene rimosso dalla sala operatoria e collocato in un ambiente caldo, zona di recupero asciutto per prevenire l'ipotermia, con connessione, facile accesso a cibo e acqua dolce.

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Representative Results

1. Post-Op valutazione neurologica

Dopo che l'animale riprenda coscienza, una grande varietà di test possono essere utilizzati per valutare i deficit neurologici, tra cui l'equilibrio, forza di presa, messa zampa, asimmetria posturale e scala arrampicata. Il compito di semi di girasole è una valutazione lorda di funzione motoria e sensoriale che ha una correlazione significativa con il volume dell'infarto 7, 12. Durante questa attività, i ratti sono a tempo durante l'apertura e consumare 5 semi di girasole. I cinque semi sono posti in un angolo di un vuoto, asciutto, gabbia di plastica e il tempo trascorso manipolando i semi vengono registrati. Inoltre, il numero di pezzi di conchiglia nella gabbia dopo tutti i semi sono stati aperti e consumato viene registrato. I ratti con maggiore deficit neurologico ci vorrà più tempo per aprire e consumare i semi e si romperà il guscio in più parti. Anche se non è una parte formale di questo compito, è facile osservare maltrattamento frequente e caduta del seme di girasoles da ratti dopo l'ictus sperimentale. Ciò include l'uso di prima di tutto una zampa anteriore, e inefficace mordere al serbatoio durante i tentativi di apertura.

2. Colorazione e la misurazione quantitativa del volume cerebrale infarto

Dopo occlusione e riperfusione del MCA stabilire un'ischemia cerebrale transitoria, gli animali sono sacrificati ei loro cervelli sezionati coronalmente vengono colorate con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) per valutare il volume dell'infarto (Figura 2) come descritto nelle nostre precedenti pubblicazioni 7, 13.

Figura 1
Figura 1. Vista dorsale del cranio ratto raffigurante posizionamento hardware. Questa vista dorsale del cranio ratto con orientato anteriore a sinistra mostra la posizione del bregma e lambda rispetto alle suture che possono essere visualizzati dopo connettivo compensazionetessuto dalla superficie del cranio. La cresta laterale del cranio, guida cannula, LDF porta sonda, e le viti di fissaggio sono anche illustrato nel diagramma con i rapporti relativi a marchi terra cranio e gli altri.

Figura 2
Figura 2. Sezioni seriali TTC-macchiati del cervello coronale (2 mm) di ratto sottoposti a ET-1 indotta MCAO. Un cervello rappresentante di un ratto dopo ET-1 indotta MCAO è mostrato. Il cervello è stato rimosso e risciacquato con ghiaccio PBS freddo prima di essere sezionato coronale in 2 sezioni mm di spessore a partire appena caudalmente ai bulbi olfattivi. Le fette sono state quindi incubate a 0,05% TTC diluito in PBS a 37 ° C prima di essere spento in PBS e poi fissato in formalina brevemente. Tissue macchiate di rosso dopo l'esposizione al TTC rappresenta vitale materia grigia. La questione vitale grigia nell'emisfero ipsilaterale di ET-1 iniezione può essere paragonato al m grigioAtter dell'emisfero controlaterale per calcolare l'area dell'infarto cerebrale.

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Discussion

L'ET-1 indotta MCAO è un modello sperimentale consolidata di ictus ischemico che viene regolarmente utilizzato in molteplici ceppi di ratto. Molte variabili, come ceppo ratto, animale età, temperatura corporea, metodo di anestesia, e competenza operatore può portare ad un aumento dei volumi di variabilità infarto quando si utilizza questo modello 5, 14. Tuttavia, alcuni ricercatori hanno dimostrato che i vantaggi di questo modello sono l'approccio relativamente non-invasiva, dose-risposta del flusso ematico cerebrale a ET-1, e la capacità di evitare del tutto l'anestesia con l'infusione di ET-1 in ratti coscienti 14, 15. È da notare che ci sono molte differenze ceppo ratto ed età utilizzato in tutta la letteratura, e non è sorprendente che le diverse coordinate stereotassiche sono riportati in base a queste variabili. Le coordinate utilizzato nel nostro protocollo sono ottimizzati per 8 settimane vecchio maschio ratti Sprague Dawley. Ogni deviazione da questo ceppo, dal sesso o dall'età probabilmente richiederà l'iniezione intracerebraleione di colorante seguita da autopsia per individuare le coordinate valide per questa procedura. Inoltre, la riduzione ET-1 indotta nel flusso sanguigno cerebrale è dose dipendente. L'uso della dose in questo metodo provoca un infarto di circa il 30-40% della materia grigia nell'emisfero ipsilaterale all'iniezione con un errore standard della media di circa 4-5% in un esperimento 7, 16. Visualizzazione diretta di porzioni prossimali del MCA rivela un diametro luminale che va a 0% del basale entro 3 min e torna alla base a circa 30 min 7. Utilizzando LDF, portata massima ha dimostrato di diminuire a circa il 10% del flusso basale in 5-7 minuti con ritorno graduale al 60% dei valori basali dopo 1 ora che il monitoraggio è stato interrotto 16.

Altri dettagli tecnici specifici che menzione mandato sono elencati di seguito:

  1. Corretta localizzazione e l'azzeramento delle attrezzature stereotassico a bregma (sotto la guida microscopica) è fondamentale per inducing un colpo di successo. Le coordinate stereotassico per l'ET-1 infusione deve essere verificata per l'equipaggiamento specifico sperimentale e la tensione ratto prima sperimentazione. È probabile che nessuna lesione si verifica se l'infusione non è entro 0,5 mm dal MCA 6.
  2. Fare attenzione a non causare danni al cervello quando il foro iniziale fresa per la cannula guida. Si raccomanda una velocità di foratura lenta essere utilizzato per avviare il foro fresa e nuovamente verso la fine in modo da ridurre al minimo le possibilità di penetrare nel cervello.
  3. Nell'effettuare i fori fresa per le viti di montaggio, utilizzare la fresa trapano cono invertito per creare un foro fresa che solo in parte penetra nel cranio. Solo trapano abbastanza profonda in modo che le viti sono stabili.
  4. Quando cementando la cannula in posizione assicurarsi di mantenere il cemento chiara della pelle così come il braccio stereotassico. Il cemento può essere manipolato prima dell'essiccazione usando un tampone di cotone.
  5. Assicurarsi che il cemento è completamente dry e la cannula è stabile prima della rimozione del supporto cannula. E 'fondamentale che la cannula non muoversi prima di ET-1 iniezione.
  6. Nella nostra esperienza, il modello ET-1 corsa ha un tasso di mortalità di circa il 20% in base al metodo chirurgico. E 'importante per confrontare i tassi di mortalità tra i due gruppi e anche gli esperimenti del piano in modo che le dimensioni del campione sufficienti vengono utilizzati per endpoint neurologici e istologica.
  7. Linee guida per gli studi preclinici per ictus acuto la terapia consiglia il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale e il monitoraggio fisiologico della pressione arteriosa, temperatura, glucosio e gas del sangue per ridurre la variabilità durante gli esperimenti 17. LDF è un metodo che può essere utilizzato per monitorare in tempo reale del flusso sanguigno in diverse regioni anatomiche per verificare una soglia predeterminata per la riduzione del flusso è stato raggiunto.
  8. Assicurarsi di pulire la siringa e l'ago di infusione con etanolo e soluzione salina tra le somministrazioni, e l'etanolo primastoccaggio. Questa procedura darà ritiro coerente e iniezione di ET-1without bolle d'aria o blocchi durante il funzionamento.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal American Heart Association Greater Affiliato Sud-Est (09GRNT2060421), l'American Medical Association, e presso l'Università della Florida clinica e traslazionale Science Institute. Adam Mecca è un NIH / NINDS, compagno NRSA predoctoral (F30 NS-060335). Robert Regenhardt ricevuto il sostegno predoctoral borsa di studio presso l'Università di programma di formazione multidisciplinare in Florida Ipertensione (T32 HL-083810).

Materials

  1. Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery.
  2. Anesthesia:
    1. Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA):
    1. Small animal stereotaxic system
    2. Non-rupture ear bars for rats
    3. Gas anesthesia head holder for rats
  4. Temperature regulation:
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
  5. Surgical instruments
    1. Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (St–lting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Surgical Supplies
    1. Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicals:
    1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualization Equipment
    1. Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. Standard Pencil Probe
    2. Probe holder
    3. Blood FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 with LabChart 7
  10. Measurement of infarct volume:
    1. Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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